多年生黑麦草原生质体制备及瞬时表达体系的建立

本研究以10～12 d苗龄的多年生黑麦草品种NUI叶片为材料,通过正交实验确定原生质体分离的最佳条件.结果表明,在甘露醇浓度为0.5 mol/L、纤维素酶R10浓度为1％、离析酶R10浓度为0.3％的酶解液中,28℃黑暗条件下酶解4 h后分离的原生质体最为理想,原生质体浓度达到4.69×106个/mL,活性达到88.5...     

玉米籽粒淀粉结合蛋白分离纯化研究

以高淀粉玉米自交系415084-2为材料,系统分析了十二烷基硫酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate,SDS)浓度、煮沸时间对分离纯化淀粉粒结合蛋白(Starch Granule-Associated Protein,SGAPs)数量的影响,结果表明,提取SGAPs时最适SDS缓冲液浓度为10%,最适煮沸时间为2～3min。对于深入研究玉米SGAPs的性质、功能,及其相互作用具有重要意义。     

绞股蓝核糖体失活蛋白的分离、克隆与表达

核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein，RIP)具有抗肿瘤和抗病毒等医用价值，以及抗植物病毒和病原真菌等农用价值。它是一种多活性的物质，不同RIP具有各自独特的功能，其潜在活性还在不断发现之中。葫芦科(Cucurbitaceae)植物大多药食同源，其中蕴涵着极其多样的RIP，但多数已知的RIP其基因尚未被克隆，而目前仍无一套快速筛选RIP新基因的方法。葫芦科中的绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)具有抗癌和抗衰老等特殊功效，其中的皂甙和黄酮成分的研究已有大量报道，但．其活性蛋白成分未见报道。为此，本研究开展绞股蓝RIP的分离纯化、基因克隆、原核表达以及转基因植物研究。率先对绞股蓝活性蛋白成分进行研究，从中分离到一种新的核糖体失活蛋白(绞股蓝毒蛋白，Gynostemmin)。它具有很高的抗TMV活性。其分子量约为27kDa。测得其N-端19个氨基酸序列：DINFSLAGADGQTYNTFIA，与其它植物RIP的同源性为10％一73％，与葫芦科RIP的同源性为37％一73％。根据葫芦科RIP上、下游两段高度保守的氨基酸序列设计简并引物对LYl／LY2，对基因组DNA进行PCR扩增，首次建立了RIP新基因快速筛选体系。从冬瓜和南瓜中分别获得了1个和5个RIP新基因，长度为408bp，编码136aa，与其它葫芦科RIP对应区段的同源性约为35％一85％。比较发现，19个葫芦科RIP的LYl／LY2区段上完全相同的氨基酸有29个，其中7个在其它科属来源的RIP中也完全保守，包括构成活性中心的3个残基E160、R163和W192。根据LYl／LY2区段同源性构建的系统进化树表明，葫芦科RIP之间的进化关系与其来源植物间的亲源关系大体一致。通过DNA片段克隆、RACE扩增、cDNA克隆和DNA克隆，从绞股蓝中分离了13个RIP基因，其中10个为cDNA序列，3个是DNA序列(GP609、DNA-750和DNA-8001)。它们之间在碱基水平和氨基酸水平上的同源性都很高，可根据序列上发生缺失的有无及其类型将其分为4组：组1，发生6bp缺失(535 GAAAAC 540，与574-579间的序列完全一样)，包括GynostemminⅡ、GP609和CX8405A，编码275aa；组2，缺失87bp(122-208)，包括DNA-750和CX820，编码248aa；组3，包括5RACE和DNA-8001，不发生组2的87bp缺失，但因其序列较短，无法确认是否具备组1的6bp缺失；组4，包括GynostemminⅠ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ以及EMUZW和RHXJB，既无87bp缺失也不发生6bp缺失，编码277aa。其中GP609与其它葫芦科RIP的LYl／LY2区段的同源性，碱基水平为47％-61％，氨基酸水平为37％-49％。5RACE中包含了由23aa组成的信号肽“MRVARFCTVVAILLYFGFHIAEC”，同时包含有5’UTR序列，其中含有kozak序列“AAAAA”。对绞股蓝RIP基因家族及其编码氨基酸进行的比较分析发现，绞股蓝RIP前体成熟过程中可能发生C-末端切除，并因此造成等电点从弱酸性跃迁至强碱性，这种现象以前未见报道。分析结果进一步支持了RIP基因无内含子的观点。5个含有3’UTR的成员中，GynostemminI比另外4个多了两个小的茎环结构和一富含AU的不稳定子元件ARE(AU-rich element)，其mRNA的稳定性可能因此受到影响。运用生物信息学软件对绞股蓝RIP前体进行碱基组成和密码子偏倚性、氨基酸组成特征、功能位点、亚细胞定位、跨膜结构、核酸结合基序以及空间结构等方面的分析。分别将GP609和RHXJB转入pGEx-2T融合表达载体，在大肠杆菌DH5a菌株中实现融合表达。将DNA-8001连接到pET-5a表达载体上，在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中实现天然表达，表达产物对TMV的抑制效果很差，其原因可能是C-末端延伸序列的存在抑制了抗TMV活性的发挥。分别构建了含有GP609和EMUZW的pEmu-mcs-N植物表达载体，同时构建了含有RHXJB的pKYLX71：35S^2植物表达载体(ZW-pK)。采用三亲交配法将ZW-pK转入土壤农杆菌LBA4404中，用于转化烟草品种K-326，分子鉴定表明绞股蓝RIP基因已经整合到再生烟苗的基因组中并发生了转录。重点讨论了绞股蓝RIP的应用前景、RIP基因的内含子、以及RIP的C-末端及其延伸序列的修饰和功能等方面的问题。研究结果为绞股蓝RIP的开发利用奠定了坚实基础，并对探讨其酶学活性、生理功能以及抗病毒机理等RIP研究的难点和热点问题具有一定的指导意义。     

棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立

以棉花幼嫩子叶为外植体材料,分析影响棉花叶肉原生质体分离及目标基因转化的主要因素,以棉花叶肉原生质体为受体,建立稳定、高效的目标基因瞬时表达与鉴定体系。技术体系包括,选择自然生长12 d的棉花幼嫩子叶为外植体材料,混合1.5%纤维素酶、0.4%离析酶、0.5 mol L^–1甘露醇、20 mmol L^–1 KCl、20 mmol L^–1 MES、0.1 mol L^–1 CaCl₂和1.0 g L^–1 BSA等酶液,在28℃黑暗条件下振荡酶解8 h,可游离出浓度达1.0×10⁶ m L^–1以上的纯净棉花叶肉原生质体。利用该方法将棉花锌指蛋白基因GhZFP2整合到pJIT166-GFP质粒载体,构建了GhZFP2:GFP融合载体,采用40% PEG(4000)介导转化,获得高转化率的棉花叶肉原生质体。对目标基因瞬时表达产物检测表明,GhZFP2蛋白清晰定位在细胞核上。     

植物原生质体分离及培养研究进展

原生质体分离及再生体系现已被广泛用于生理、生化、遗传、分子生物学、基因组学、蛋白质组学、代谢组学的研究中,并能够为植物遗传转化提供良好的受体系统,从而达到优化遗传性状,丰富种质资源的目的等。园艺植物由于其观赏性强、倍性高的特点,具有很高的研究价值,但目前具有稳定的原生质体分离体系的园艺植物数量很少。本研究总结了园艺植物原生质体分离及培养时的各种影响因素：原生质体分离的植物材料;原生质体的酶解条件和纯化;原生质体的培养方法;原生质体的培养基成分,以及原生质体在各领域的应用,为建立更多植物原生质体分离及再生体系提供参考,为将原生质体系统更广泛的应用于多种植物中提供帮助。     

决明原生质体的分离与培养研究

用决明（ＣａｓｉａｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａＬ．）子叶和下胚轴为材料,游离和培养原生质体。结果表明,１５日龄无菌苗的子叶和下胚轴比较适于游离原生质体,每１ｇ材料的原生质体产量高达１．６×１０４个;ＰｅｃｔｏｌｙａｓｅＹ－２３是分离原生质体所必需的;用含２,４－Ｄ０．４ｍｇ／Ｌ（以下单位同）,ＮＡＡ１．０与ＫＴ０．１的ＫＭ８Ｐ漂浮培养利于原生质体的分裂。培养４ｄ后,原生质体开始分裂,１５ｄ后其植板率约为１９．２％,３０ｄ形成了细胞团或小愈伤组织。增殖愈伤组织在分化培养基上培养,可分化出芽。芽在生根培养基上培养１４ｄ生根,从而再生决明小植株。     

绞股蓝核糖体失活蛋白的分离、克隆与表达

核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein,RIP)具有抗肿瘤和抗病毒等医用价值,以及抗植物病毒和病原真菌等农用价值.它是一种多活性的物质,不同RIP具有各自独特的功能,其潜在活性还在不断发现之中.葫芦科(Cucurbitaceae)植物大多药食同源,其中蕴涵着极其多样的RIP,但多数已知的RIP其基因尚未被克隆,而目前仍无一套快速筛选RIP新基因的方法.葫芦科中的绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)具有抗癌和抗衰老等特殊功效,其中的皂甙和黄酮成分的研究已有大量报道,但其活性蛋白成分未见报道.为此,本研究开展绞股蓝RIP的分离纯化、基因克隆、原核表达以及转基因植物研究.率先对绞股蓝活性蛋白成分进行研究,从中分离到一种新的核糖体失活蛋白(绞股蓝毒蛋白,Gynostemmin).它具有很高的抗TMV活性.其分子量约为27 kDa.测得其N-端19个氨基酸序列:DINFSLAGADGQTYNTFIA,与其它植物RIP的同源性为10%-73%,与葫芦科RIP的同源性为37%-73%.根据葫芦科RIP上、下游两段高度保守的氨基酸序列设计简并引物对LY1/LY2,对基因组DNA进行PCR扩增,首次建立了RIP新基因快速筛选体系.从冬瓜和南瓜中分别获得了1个和5个RIP新基因,长度为408 bp,编码136 aa,与其它葫芦科RIP对应区段的同源性约为35%-85%.比较发现,19个葫芦科RIP的LY1/LY2区段上完全相同的氨基酸有29个,其中7个在其它科属来源的RIP中也完全保守,包括构成活性中心的3个残基E160、R163和W192.根据LY1/LY2区段同源性构建的系统进化树表明,葫芦科RIP之间的进化关系与其来源植物间的亲源关系大体一致.通过DNA片段克隆、RACE扩增、cDNA克隆和DNA克隆,从绞股蓝中分离了13个RIP基因,其中10个为cDNA序列,3个是DNA序列(GP609、DNA-750和DNA-8001).它们之间在碱基水平和氨基酸水平上的同源性都很高,可根据序列上发生缺失的有无及其类型将其分为4组:组1,发生6 bp缺失(535 GAAAAC 540,与574-579间的序列完全一样),包括GynostemminII、GP609和CX8405A,编码275 aa;组2,缺失87 bp(122-208),包括DNA-750和CX820,编码248 aa;组3,包括5RACE和DNA-8001,不发生组2的87 bp缺失,但因其序列较短,无法确认是否具备组1的6 bp缺失;组4,包括GynostemminI、III、IV、V以及EMUZW和RHXJB,既无87 bp缺失也不发生6 bp缺失,编码277 aa.其中GP609与其它葫芦科RIP的LY1/LY2区段的同源性,碱基水平为47%-61%,氨基酸水平为37%-49%.5RACE中包含了由23 aa组成的信号肽“MRVARFCTVVAILLYFGFHIAEC“,同时包含有5UTR序列,其中含有kozak序列“AAAAAA“.对绞股蓝RIP基因家族及其编码氨基酸进行的比较分析发现,绞股蓝RIP前体成熟过程中可能发生C-末端切除,并因此造成等电点从弱酸性跃迁至强碱性,这种现象以前未见报道.分析结果进一步支持了RIP基因无内含子的观点.5个含有3UTR的成员中,GynostemminI 比另外4个多了两个小的茎环结构和一富含AU的不稳定子元件ARE(AU-rich element),其mRNA的稳定性可能因此受到影响.运用生物信息学软件对绞股蓝RIP前体进行碱基组成和密码子偏倚性、氨基酸组成特征、功能位点、亚细胞定位、跨膜结构、核酸结合基序以及空间结构等方面的分析.分别将GP609和RHXJB转入pGEX-2T融合表达载体,在大肠杆菌DH5α菌株中实现融合表达.将DNA-8001连接到pET-5a表达载体上,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中实现天然表达,表达产物对TMV的抑制效果很差,其原因可能是C-末端延伸序列的存在抑制了抗TMV活性的发挥.分别构建了含有GP609和EMUZW的pEmu-mcs-N植物表达载体,同时构建了含有RHXJB的pKYLX71∶35S2植物表达载体(ZW-pK).采用三亲交配法将ZW-pK转入土壤农杆菌LBA4404中,用于转化烟草品种K-326,分子鉴定表明绞股蓝RIP基因已经整合到再生烟苗的基因组中并发生了转录.重点讨论了绞股蓝RIP的应用前景、RIP基因的内含子、以及RIP的C-末端及其延伸序列的修饰和功能等方面的问题.研究结果为绞股蓝RIP的开发利用奠定了坚实基础,并对探讨其酶学活性、生理功能以及抗病毒机理等RIP研究的难点和热点问题具有一定的指导意义.     

辣根叶片原生质体分离条件的研究

分离优质原生质体是进行细胞功能性以及生物膜特性研究的基础,建立适宜的酶液浓度与酶解时间以及酶液渗透压组合是获得高产优质原生质体的重要条件.本实验以辣根叶片为材料,研究了不同酶液浓度、溶液渗透压以及酶解时间对其原生质体分离的影响.结果表明,用浓度为1%纤维素酶+0.1%果胶酶+0.9mol/L甘露醇组成的混合酶液,在28.5℃条件下,pH为5.8的酶液组合中酶解50min时,可获得较高的原生质体产量,且原生质体活力较高.     

纳豆激酶的保健功能及分离提取技术研究

纳豆激酶来源于传统食品纳豆中,有很强的溶血栓能力。纳豆激酶的保健功能与其生化特性和酶的活性、功能机理有关。与传统的一些溶栓药物相比,纳豆激酶具有安全性好、成本低及可以口服等优点。良好的分离纯化技术是开发纳豆激酶保健品的关键。     

玉米叶绿体表达载体构建及绿色荧光蛋白基因瞬时表达检测

Tps1是生物保护物质海藻糖的关键合酶基因.构建含Tps1的玉米叶绿体表达载体,首定从玉米叶绿体基因组中克隆16S/trnI-trnA/23S片段,作为定点整合同源片段;然后将编码酵母海藻糖合酶基因Tps1表达盒(Prrn-Tps1-TpsbA-ter)、草丁膦抗性基因Bar表达盒(RpsbApro-Bar-RpsbAter)、卡那霉素抗性基因Npt Ⅱ和绿色荧光蛋白基因Gfp构建的融和基因表达盒(Prrn-Npt Ⅱ/Gfp-RrbcLter)一起克隆到定点整合同源片段之间,构建了玉米叶绿体的稳定表达载体mTKGB.通过基因枪轰击法将mTKGB转化到玉米幼嫩叶片中,培养2 d后,在激光扫描共聚焦显微镜下脱测到玉米一些细胞的叶绿体中有很强的GFP绿色荧光,结果表明构建的载体可在玉米叶绿体中表达.     

甘蓝型油菜异三聚体G蛋白原生质体瞬时表达体系的建立

为建立甘蓝型油菜异三聚体G蛋白各组分原生质体瞬时表达体系,以油菜叶片为试材,从试材选取、平摇时间和聚乙二醇浓度方面优化了油菜原生质体制备条件和转化条件。结果表明,选取30 d苗龄叶片、平摇10 min时原生质体游离状态最佳,产量为10.73×10~6/m L,活力可达96.4%。采用30%PEG转化原生质体时,目的蛋白表达量最高。Western Bolt的检测分析表明,异三聚体G蛋白各组分均参与了甘蓝型油菜对ABA的应答反应,当ABA浓度分别为100,150,100,50 mmol/L时,Bn GA1、Bn GB1、Bn GG2和BnRGS1蛋白的表达量最高。     

荧光标记基因转化棉花黄萎病菌及标记菌系选育

为了研究黄萎病菌的侵染机制,通过农杆菌介导的转化方法,将绿色荧光蛋白基因sGFP导入落叶型黄萎病菌VD07038,将红色荧光蛋白基因mCherryRFP导入非落叶型黄萎病菌Bp2中,分别获得了具有绿色、红色荧光信号的阳性转化子。经过分子验证和连续继代培养,证明了这些转化子具有遗传稳定的对潮霉素的抗性。通过对转化子的菌落形态、生长速度和致病力进行检测,发现大部分转化子与野生型基本一致,少量转化子发生变异,其中转化子Bp2R-30不能产生微菌核,致病力显著下降。利用荧光显微镜观察了转化子VD07038G-10在感病棉花品种苏棉22幼苗根部的侵染情况。结果表明,在接菌12 h后VD07038G-10的孢子可吸附在根表面;接种7~9 d后,菌丝入侵到棉花根部的维管组织。本研究获得的荧光蛋白标记的棉花黄萎病菌VD07038G-10可用于实时观测黄萎病菌侵染棉花根系的过程,并且可以定量鉴定不同棉花品种对该菌系的抗性,为棉花黄萎病菌抗性鉴定提供一种新方法。     

pCB-zeolin-GFP表达载体的构建及瞬时表达

为利用荧光蛋白基因GFP检测外源基因在转基因植株中的表达和定位,构建含有GFP基因的植物表达载体pCB-zeolin-GFP。在目的基因的开放阅读框（ORF）两端设计引物,并引入酶切位点和保护碱基,用PCR方法从pDHA扩增得到zeolin基因的全长,克隆到中间载体pMD18-T,分别用NcoⅠ和BglⅡ2种限制性内切酶酶切重组质粒和经过改良的pCAMBIAI1302植物表达载体,经回收、连接、转化、鉴定后,利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞,通过共聚焦显微镜检测绿色荧光蛋白在洋葱表皮细胞中的瞬时表达。构建了zeolin基因与绿色荧光蛋白（GFP）融合的植物表达载体pCB-zeolin-GFP,并在洋葱中得到了表达。构建的融合植物表达载体pCB-zeolin-GFP正确,该载体的成功构建为今后进行基因转移、基因功能研究及培育新品种奠定了基础。     

橡胶树根际土壤浸提液的GC-MS分析

【研究目的】对橡胶树根际土壤浸提液进行了检测分析,以对橡胶树根系分泌物的组成进行初步探索。【方法】以正己烷为浸提剂浸提热研7．33．97橡胶树根际土壤,浸提液过滤、浓缩,用气相色谱-质谱联用仪进行了组分分析。【结果】从该浸提液中共检测分离了50种物质,对其中的36种进行了鉴定,主要是醇、酯、醛、烃、酮、酚、酸等物质。用峰面积归一化法确定了这些物质的相对含量,其中醇、烃、酯类的相对含量较高,分别为37．78％、23、78％、20．19％,占到检出面积的81．75％。【结论】从浸提液的组成成分来看,橡胶树的根际土壤中含有多种有机化合物,主要为醇、酯、醛、烃、酮、酚、酸等物质。这些物质可能来源于橡胶树的根系分泌。其中一些物质具有较为重要的生态学意义,另外一些物质可能在橡胶树的根际营养中起着重要作用。对这些物质的发生作用机制有待于进一步的深入研究。     

玫瑰RdGASA4-like基因启动子的分离及其在甘蓝中的瞬时表达分析

在前期的研究中,一个玫瑰RdGASA4-like基因的cDNA和DNA序列全长利用同源克隆结合RACE的方法首次得到克隆。为深入了解该基因在赤霉素调控植物发育过程中的作用,通过TAIL-PCR的方法首次克隆该基因起始密码子ATG上游685bp的5’-UTR和部分启动子序列,在启动子序列分析的基础上,构建其与GUS基因融合表达载体,命名为pBI-GP685。通过农杆菌介导的方法对甘蓝外植体子叶-子叶柄进行启动子瞬时表达研究,结果表明分离得到的启动子具有启动报告基因GUS表达的活性。     

国家橡胶树种质资源圃07/08年寒害调查

在2007/2008年发生的典型平流型寒害影响下,对国家橡胶树种质资源圃材料进行全面调查。调查结果表明,遗传背景不同的种质对寒害具有一定程度上的差异;1981’IRRDB野生种质中有较大比例显示出对低温具有一定的耐性,可利用从中筛选的优异资源进行耐寒选育种。     

橡胶树光合与干物质积累模拟模型研究

基于单叶光合速率的光响应模型和冠层光的分布规律,通过积分形式,构建了橡胶树冠层光合作用模拟模型。模型充分量化了光通量密度、温度、叶面积指数、单叶最大光合速率、光合作用特征参数、消光系数、群体反射率等因子对橡胶树冠层光合速率的影响。在分别确定了叶片和木质器官与环境因子作用关系的基础上,构建了橡胶树的群体呼吸作用模型。在橡胶树冠层的光合作用模型和群体呼吸作用模型的基础上,整合成橡胶树干物质积累模拟模型。模型经初步检验,结果表明模拟值与观测值吻合度较好,模型不仅具有较强的机理性而且具有较高的预测性和实用性。     

洋葱愈伤原生质体分离和纯化研究

建立高效原生质体分离和植株再生体系是进行体细胞杂交的基础性工作。以洋葱多次继代的愈伤组织为研究试材,对原生质体分离纯化技术进行研究。结果表明：2.0%纤维素酶Onozuka R-10+0.1%果胶酶Y-23+0.5%离析酶 R-10+0.60 mol/L甘露醇+CPW+0.1% MES的酶液,酶解6 h,洋葱原生质体分离效果最好。纯化时,适当降低离心力的短时间离心有利于原生质体纯化过程中产量和活力的保持,以600 r/min离心5 min效果为好。     

棉花尖孢镰刀菌绿色荧光蛋白的转化

棉花枯萎病是棉花的主要病害之一,严重威胁棉花产量和品质。绿色荧光蛋白(GFP)是发光水母(Aequorea victoria)体内的一种蛋白,作为报告基因拥有诸多优点,目前已被广泛应用于植物研究当中。为研究枯萎菌浸染棉花的过程及植病互作分子机理,本研究利用PEG介导的原生质体转化方法,将绿色荧光蛋白(GFP)基因转入到棉花枯萎病菌中,创制转报告基因株系。结果表明:转化子连续转接2代后仍能够稳定遗传,且荧光强度良好。经荧光共聚焦显微镜观察和PCR验证GFP基因已成功转入到菌株中,转化所得的菌株将为后续可视化检测和分析枯萎病菌对棉花的侵染等研究提供帮助。