巴西橡胶树SNARE蛋白全长cDNA克隆及其序列特征分析

从巴西橡胶树Hevea brasiliensis差减cDNA文库中筛选到一个与SNARE蛋白同源性较高的基因片段,根据其序列信息设计特异引物, 采用cDNA末端快速扩增技术RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）进行差异片段的5’和3’端的扩增,获得了长度为1 070 bp的全长cDNA克隆R295。序列分析表明该基因包含600 bp的开放阅读框,5’-UTR为93 bp, 3’-UTR为377 bp,编码199个氨基酸。该基因编码的蛋白具有一个SNARE coiled-coil保守区、一个典型的VAMP基元及一个羧基端的CAAX基元。同源分析表明该蛋白属于一类特殊的longins蛋白。RT-PCR检测表明它在胶乳中特异表达,在叶中没有表达。     

巴西橡胶树Profilin基因克隆及生物信息学分析

为了研究橡胶树中Profilin 蛋白的功能,利用橡胶树Profilin 基因部分已知序列设计引物,采用 3′-RACE技术获得Profilin 基因完整开放阅读框,该基因编码131 个氨基酸,含有一个保守的PROF结构域。在HbPro1 蛋白中没有预测到跨膜区和信号肽,二级结构分析表明HbPro1 属于混合型蛋白。对 25 个Profilin 蛋白系统进化分析表明,HbPro1 在进化上具有保守性,属植物类Profilin 蛋白家族。 HbPro1 基因的克隆和生物信息学分析为深入研究其功能奠定了基础。     

巴西橡胶树水解酶基因克隆与表达分析

磷是植物生长发育所需的大量重要元素,而缺磷是提高橡胶产量的重要限制因子,研究橡胶树耐低磷胁迫的分子机制,对提高橡胶树磷养分的利用效率具有重要意义。利用低磷胁迫差减文库获得的EST,通过RT-PCR和RACE技术克隆橡胶树应答低磷胁迫基因,并利用实时荧光定量PCR技术进行表达分析。结果表明,从橡胶树中克隆到1个应答低磷胁迫的水解酶基因Hbhyd,全长1860 bp,包含1个1479 bp的完整阅读编码框(ORF),编码56.1 kD(492aa)蛋白,经NCBI同源性分析,HbHyd编码的氨基酸序列与蓖麻水解酶的氨基酸序列一致性为84%。利用荧光定量PCR分析Hbhyd的表达水平,可知在低磷磷胁迫处理下,HbHyd在橡胶树根中表达量明显上调。Hbhyd基因在橡胶树应答低磷胁迫过程中上调表达,该基因的克隆有助于提高橡胶树磷素吸收利用效率。     

蓖麻基因组Mlo基因家族成员的鉴定及其序列特征分析

Mlo基因家族是一类重要的植物抗病基因,而蓖麻基因组Mlo成员的鉴定和分析为进一步培育蓖麻抗病品种奠定基础。本研究通过系统地分析蓖麻基因组数据,从中共鉴定出16个Mlo成员,其中15个具有完整的ORF,1个序列缺失。对15个具有完整ORF的蓖麻Mlo基因进行结构分析发现,它们在序列长度上差异较大,但其编码蛋白均具有一个保守的Mlo结构域和6~7次跨膜结构,主要定位在细胞膜上。对蓖麻Mlo基因与其他物种的Mlo基因进行聚类关系分析,结果显示,可将蓖麻Mlo基因家族分为7类(Ⅰ~Ⅶ),其中第Ⅶ类只包含2个蓖麻Mlo基因(RcMlo8和RcMlo9),这可能是蓖麻中特有的一类Mlo;蓖麻RcMlo3、RcMlo2、RcMlo6和RcMlo12与已知的抗病Mlo基因分别聚在第Ⅳ和第Ⅴ类,这4个基因可能是蓖麻基因组中具有抗病功能的Mlo。本研究结果为进一步克隆蓖麻Mlo基因并研究其功能奠定了良好的基础。     

巴西橡胶树HbUBC22基因克隆与表达分析

泛素蛋白酶体途径（ubiquitin proteasome pathway, UPP）是细胞内最重要的且具有高度选择性的蛋白质降解途径,而泛素结合酶E2/UBC是该途径的一个关键酶。本研究通过对巴西橡胶树同源EST序列拼接和RT-PCR扩增的方法,克隆了一个巴西橡胶树的泛素结合酶基因HbUBC22,该基因的开放阅读框（ORF）共807 bp,编码268个氨基酸,编码蛋白含有一个保守的UBC结构域和一个高度保守的半胱氨酸催化位点。系统进化关系分析发现,HbUBC22蛋白与蓖麻、杨树、油茶和葡萄的UBC蛋白的同源性最高,分别为89%、85%、85%和81%;在拟南芥基因组中,HbUBC22则与AtUBC22的同源性最高达到73%。表达谱分析结果显示,HbUBC22受乙烯利和茉莉酸甲酯诱导显著上调表达。原核表达分析结果表明,经IPTG诱导后,HbUBC22能够在大肠杆菌中表达出目标蛋白。本研究结果为进一步研究HbUBC22在橡胶树中的生物学功能奠定了良好基础。     

巴西橡胶树HbbHLH1启动子的克隆与序列分析

bHLH转录因子在高等植物生长发育、激素应答和次生代谢调节中具有重要的功能.根据巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)HbbHLH1基因设计了2个特异性反向引物,利用GenomeWalking方法从巴西橡胶树叶片基因组DNA中克隆获得了HbbHLH1基因起始密码子上游819 bp的调控片段.序列分析表明,该片段除了含有一个典型的真核生物核心启动子区域(-60～-10bp)外,还含有多个TATA-box、CAAT-box等启动子元件以及多种与激素和胁迫诱导相关的顺式调控元件,其中在-290 bp和-309 bp位点分别有一个应答MeJA信号反应的调控元件,但没有发现典型的乙烯响应元件.这暗示了HbbHLH1转录因子可能在橡胶树乳管分化和胶乳生物合成中具有调控作用.     

巴西橡胶树HbSIP1基因启动子的克隆和序列分析

为研究橡胶焦磷酸酶基因的表达特征及其在天然橡胶生物合成中调控机理,根据巴西橡胶树焦磷酸酶基因HbSIP1序列,利用GenomeWalker方法对HbSIP1基因启动子序列进行了分离,对其序列进行了生物信息学分析,并构建了含有该序列的植物表达载体pSIP1-1381Z。结果表明：分离获得了1198 bp的HbSIP1基因启动子序列,该序列具有真核生物典型启动子结构特征,并含有众多应答激素和胁迫信号的调控元件。对HbSIP1的启动子区的克隆和分析,为进一步研究HbSIP1的功能和表达调控机制奠定基础。     

牦牛IGF-IR基因克隆及其序列分析

为研究牦牛胰岛素样生长因子1受体基因(IGF-IR)的结构和功能,采用同源克隆和RT-PCR方法分段扩增牦牛IGF-IR,拼接获得全长序列,利用生物学软件进行分析。结果表明,牦牛IGF-IR基因ORF长约4 104 bp,编码1 367个氨基酸;理论分子量约154. 95 ku,等电点p I值约5. 71。与黄牛IGF-IR比较,牦牛IGF-IR基因序列有20处碱基改变,其中G到T碱基颠换2次,G到A碱基转换2次,C到T碱基转换7次,A到G碱基转换3次,T到C碱基转换6次,以及3个位点氨基酸改变(G6R、T29I和S30I)。系统进化分析表明,牦牛与黄牛、猪、人、狗、小鼠、猩猩等物种IGF-IR氨基酸相似性均大于92%,处于同一进化分支,具有高度同源性。蛋白结构预测表明,牦牛IGF-IR包含半胱氨酸富集区(FU)、纤连蛋白Ⅲ型结构域(FN3)、跨膜结构域(TM)及酪氨酸蛋白激酶区(Tyr Kc),具有该受体家族的特征结构域。同源建模表明,其成熟区段氨基酸序列与人的IGF-IR有98. 68%的相似性。为后续牦牛IGF-IR基因的功能研究奠定了基础。     

芝麻COX Ⅶa基因克隆、表达与序列特征分析

为获得芝麻细胞色素氧化酶Ⅶa亚基基因及其蛋白质序列特征,研究其组织表达特性以及可能的功能。本研究利用NCBI数据库中注释的芝麻COXⅦa基因序列,设计特异PCR引物,以RT-PCR技术进行克隆和表达分析,并利用生物信息学方法分析其序列特征,预测其蛋白质亚细胞定位、跨膜结构和三级结构等。结果表明,克隆的芝麻SiCOXⅦa1和SiCOXⅦa2基因的cDNA序列长度分别为481 bp和416 bp,二者编码的蛋白质序列长度为67个氨基酸残基,具有88%的相似性,属于同源蛋白,均定位于线粒体中,在蛋白序列中35~57 aa形成一个跨膜螺旋区;预测的SiCOXⅦa三级结构均由2段α-螺旋结构组成,但SiCOXⅦa2与SiCOXⅦa1序列的C端形成的高级结构存在较小的差异。表达分析表明,二者在芝麻花蕾、花冠、根、茎和叶中均有表达,且表达模式相似,均在生长旺盛的组织中高丰度表达。本研究为揭示芝麻COX蛋白复合物的结构和功能提供了理论指导。     

巴西橡胶树RALF基因家族的鉴定及其表达分析

快速碱化因子(rapid alkalinization factors, RALFs)是一种植物多肽类激素,参与胞内MAPK信号传递、细胞伸长调控、花器官发育及免疫应答等植物重要生理过程。本研究利用生物信息学方法对橡胶树RALF基因家族进行全基因组鉴定,对其序列特性、基因结构、保守基序、系统进化及表达特性进行系统研究。通过同源比对在橡胶树基因组中共鉴定到16个RALF基因,分别命名为HbRALF1～HbRALF16。序列分析结果表明,这些基因编码氨基酸数目介于108～149 aa之间,分子量和等电点分别介于11.92～16.88 kD和5.41～9.33。多序列比对结果表明,HbRALFs含有S1P蛋白酶识别位点、受体蛋白识别位点YISY保守序列和四个保守半胱氨酸。基于转录组数据的组织和乙烯刺激表达特性分析显示,16个橡胶树RALF基因至少在一个组织中表达,8个胶乳中高表达的RALF还参与乙烯刺激响应。本研究为进一步研究RALF基因家族在橡胶树关键农艺性状调控中的作用提供参考依据。     

植物生长调节剂对橡胶树不定芽诱导的影响

为了研究植物生长调节剂对橡胶树不定芽诱导的影响,本研究以橡胶树优良无性系‘云研73-477’花药体胚植株为外植体,采用正交试验法研究了6-BA、NAA、KT、GA₃对橡胶树不定芽诱导的影响。结果表明,4种激素对茎尖不定芽诱导率的影响差异不显著,对繁殖系数的影响差异达显著水平,其主次顺序为：NAA＞6-BA＞KT＞GA₃,优组合为1.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+0.2mg/LKT+0.4mg/LGA₃;6-BA、NAA、GA₃对茎段芽繁殖系数的影响差异达显著水平,KT则不显著,NAA、GA₃对死亡率的影响差异达极显著水平,其他2种激素则不显著。茎段不定芽诱导的优组合为1.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+0.2mg/LKT+0.2mg/LGA₃。     

巴西橡胶树钙调蛋白基因的克隆及表达分析

为了进一步研究橡胶生物合成的分子机制,根据巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）cDNA文库中的EST序列,利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术分离了一个巴西橡胶树钙调蛋白基因,命名为HbCAM1。分析结果显示,该基因cDNA全长775 bp,含有完整的阅读框架,编码区为450 bp,编码149个氨基酸,5’非编码区26 bp,3’非编码区299 bp。通过序列比对以及结构预测分析,HbCAM1编码的氨基酸序列与蓖麻、毛葡萄、烟草、麻风树中相应基因氨基酸序列的一致性分别达到100%、100%、99%、99%。半定量RT-PCR分析显示,HbCAM1基因可能通过对相关代谢基因表达调节参与了乙烯利刺激橡胶树增产的分子调控。     

巴西橡胶树膜结合NAC转录因子HbNTL1的克隆及生物信息学分析

本实验根据巴西橡胶树胶乳cDNA文库中筛选到的NAC EST序列,克隆了橡胶树膜结合NAC转录因子,HbNTL1的cDNA和基因组DNA序列。生物信息学分析显示HbNTL1基因包含6个外显子和5个内含子,开放阅读框(ORF)为1704bp,编码了567个氨基酸。HbNTL1编码蛋白的相对分子量为62.52 kDa,理论等电点PI为4.62,N-端具有保守的NAC结构域,高度变异的C-端有一个跨膜结构域(TM)。序列比对和系统进化分析表明HbNTL1蛋白属于NAC转录因子家族中的NAC2亚族,推测其可能与橡胶树生长发育和胁迫应答有关。     

橡胶树中碱性转化酶基因HbNIN7的克隆与表达分析

蔗糖主要由植物光合作用产生,其水解依赖于转化酶和蔗糖合成酶。其中,转化酶催化蔗糖不可逆分解为葡萄糖与果糖。本研究基于橡胶树的基因组和转录组数据库,采用RT-PCR技术克隆得到一个中碱性转化酶基因HbNIN7基因,预测编码683个氨基酸。同源与亚细胞定位分析表明HbNIN7属于α类中碱性转化酶,定位于线粒体。通过原核表达获得其重组蛋白,酶活性分析表明,HbNIN7重组蛋白最适酶活pH值7.2;最适酶活温度45℃;最大反应速率32.69 mmol hexose·mg^-1protein·h^-1;Km值25.04 mmol/L。利用荧光定量方法分析基因的表达特征,结果显示:HbNIN7基因在雄花中表达水平最高,且在雄花发育的不同阶段差异显著,说明Hb NIN7很可能参与橡胶树花组织中糖利用及糖信号调控。     

巴西橡胶树HbTCTP基因的克隆及表达

在先前的研究中通过抑制缩减杂交获得了一个在巴西橡胶幼态无性系与老态无性系胶乳中差异表达的片段(HbSSHl2),BlastX分析表明,由该片段编码的氨基酸与麻疯树(Jatropha curcas L.)翻译控制肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)的同源性达到92%.本研究根据HbSSHl2的序列信息设计引物,通过3L-RACE的方法获得了一个长832bp的cDNA(命名为HbTCVP),序列分析表明HbTCTP有507 bp的阅读框,68 bp的5'-UTR和255 bp的3'UTR,编码168个氨基酸,该氨基酸序列与麻疯树、油棕、花生、南瓜、番茄和拟南芥的TCTP同源性分别达到93.45%、90.48%、89.29%、85.12%、82.74%和79.76%.RT-PCR表明,HbTCTP在巴两橡胶叶片、胶乳及树皮中都有表达,乙烯利处理可诱导HbTCTP的表达,割胶抑制HbTCTP的表达,表明HbTCTP可能参与伤信号或乙烯信号传导.HbTCTP的表达分析有助于解析橡胶树幼态无性系高产的分子机制.     

巴西橡胶树伤害诱导蛋白基因的克隆及表达分析

为了研究橡胶树在逆境胁迫下的分子机制,根据巴西橡胶树抑制消减(SSH)文库和NCBI数据库中的伤害诱导蛋白基因拼接序列设计嵌套引物,通过RACE技术获得基因的完整开放阅读框,命名为HbWUN1。序列分析表明HbWUN1长872 bp,含有390 bp的开放阅读框,编码129个氨基酸。生物信息学分析结果表明HbWUN1不含信号肽和跨膜结构,为亲水性蛋白。进化分析结果显示,橡胶树HbWUN1与拟南芥NP_974279.1聚成一类。RT-PCR分析结果表明HbWUN1表达无组织特异性,在胶乳中表达量最高。在叶片不同发育时期HbWUN1表达存在变化,在衰老期最高。此外,低温、伤害、高盐、乙烯和茉莉酸处理均调控HbWUN1表达,推测其可能在橡胶树逆境反应中发挥作用。     

橡胶树Ago蛋白基因家族分析

Ago蛋白基因家族成员与不同的小RNA结合,广泛参与细胞的生长发育及抵抗外源DNA的入侵。对Ago蛋白基因家族成员的研究有利于进一步了解各成员的功能,同时有助研究小RNA的功能。橡胶树的Ago蛋白基因家族及小RNA的研究均较少,为了弄清楚橡胶树Ago蛋白基因家族成员情况及其初步功能,本研究对橡胶树(Hevea brasiliensis)所有蛋白质序列进行了分析。用HMMER及BLAST等软件分析发现橡胶树有18个Ago蛋白,这些Ago蛋白进行分类及理化性质分析,发现其可分为3类,大多数Ago蛋白定位于细胞核,蛋白序列长度在577 aa至1 237 aa氨基酸之间,等电点在8.66至9.47间。通过qPCR技术研究橡胶树Ago蛋白的表达,发现18个Ago蛋白在不同叶龄间有差异,在白粉病菌对橡胶树进行感染处理后各Ago蛋白的表达也有差异,说明不同的Ago蛋白参与了不同的生理过程。这些结果为进一步研究各Ago蛋白在橡胶树的生长发育及抗病抗逆过程中的功能提供了理论依据。