SYBR Green I 实时荧光定量PCR检测小麦纹枯病菌体系的建立和应用

【目的】纹枯病是小麦生产上重要的土传病害之一,早期准确定量检测病原是病害预测预报及实现有效防控的基础。传统组织分离鉴定方法费时、程序复杂,而且无法做到准确定量。为实现小麦纹枯病早期快速准确定量检测,研究旨在建立小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）的SYBR Green I实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测方法。【方法】根据小麦纹枯病菌的β-tubilin序列,设计1对特异性引物,建立并优化SYBR Green I real-time PCR反应体系,利用小麦纹枯病菌、立枯丝核菌（R. solani）、双核丝核菌AG-A和AG-F菌株、小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis var. tritici）、小麦根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）、小麦茎基腐病菌假禾谷镰孢（Fusarium pseudograminearum）和禾谷镰孢（F. graminearum）等8种小麦根部或土壤病原物的菌丝DNA进行普通PCR和real-time PCR特异性检测,并对灵敏度、可重复性进行评价。利用该体系分别检测接种后5、10、60 d不同接种浓度的盆栽小麦病株。【结果】研究设计的引物特异性强,普通PCR检测结果仅小麦纹枯病菌DNA有扩增条带。Real-time检测结果表明该对引物对小麦纹枯病菌只有唯一的产物吸收峰,对其余供试菌株均未检测到荧光信号。普通PCR检测的灵敏度为6.5×10³ copies/μL, real-time PCR的灵敏度可达到6.5×10² copies/μL。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建的real-time PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线的吸收峰单一,相关系数为0.997,扩增效率为0.91。对人工接种的盆栽小麦病株进行real-time PCR检测,结果表明与病情指数和接种量分别呈显著正相关。【结论】研究建立的基于real-time PCR技术的小麦纹枯病菌快速检测方法速度快、灵敏度高、特异性强、重复性好。可以用于小麦纹枯病菌检测、指导病害预测和防治。     

鸭源PKC基因荧光定量PCR检测方法的建立

为建立基于鸭源宿主细胞的蛋白激酶PKC基因的实时荧光定量PCR检测方法。根据GenBank数据库的PKC基因设计、合成特异性引物,通过PCR技术扩增目的基因片段,构建重组质粒GV pXT19-TPKC,并以其为阳性标准品建立荧光定量PCR检测方法和标准曲线,进行重复性、特异性和敏感性验证。结果显示,荧光定量PCR标准曲线为y=-3.334 0x+44.199,相关系数为0.995 4,扩增效率为99.19%;熔解曲线仅出现单特异峰,未检测到H5亚型/H7亚型/H9亚型禽流感病毒疫苗毒株、新城疫病毒和鸭肝炎病毒等参考毒株的核酸样本的荧光信号。说明,建立的荧光定量PCR方法具有良好的稳定性、特异性和灵敏性。     

PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒（PPV）的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中的PPV VP2基因序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR,扩增猪细小病毒VP2基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy 载体中,构建重组质粒。对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和Mg²⁺浓度条件进行优化,建立最佳的荧光定量 PCR 反应体系和标准曲线。以阳性重组质粒为模板,建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对临床60份疑似PPV病料进行检测,同时与血凝试验(HA)和常规PCR方法的检测效果进行比较。【结果】 在25 μL扩增体系中,Mg²⁺终浓度为4.5 mol/L、SYBR Green染料浓度为20 μmol/L、引物浓度为25 μmol/L时,本底反应最小、循环阈值最低、扩增效率最高。所建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法能够特异、定量地检测猪细小病毒,灵敏度达20 TCID₅₀/mL;在临床样品检测中,其检出率比常规PCR方法高13.3%。【结论】 成功建立了PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为临床猪细小病毒的早期诊断及定量分析病毒的感染程度奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立一种定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的荧光定量PCR方法.[方法]用RT-PCR方法扩增PRRSV的N基因片段,构建含有N基因片段的重组质粒,以不同浓度的PRRSV-N基因重组质粒作为模板来进行检测PRRSV的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增.[结果]PRRSV SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR的扩增效率为98.2％,标准曲线的决定系数为0.9995,可准确检测的最低核酸模板浓度为60 copies/μL,重复性试验的变异系数小于3％,对3种常见的猪源RNA病毒的检测结果全为阴性.临床检测显示,PRRS病猪的血清中PRRSV载量极显著(P＜0.01)高于PRRSV亚临床感染猪.[结论]建立了一种可用于PRRSV定量检测与PRRS早期快速诊断的特异性强、灵敏度高、重复性好的PRRSV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法.     

GCLV病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank发表的大蒜普通潜隐病毒(GCLV)的外壳蛋白基因的保守序列设计了一对引物,以全基因序列合成的方法获得质粒标准品,以此质粒标准品为模板建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测GCLV的方法.该方法在4.2×101~4.2×107拷贝之间呈现良好的线性关系,相关系数为0.999,扩增效率为106%,最低可检测42拷贝/PCR反应阳性标准品,比常规PCR敏感100倍;扩增产物的溶解曲线只出现1个单特异峰,无引物二聚体,溶解温度为(77.5±0.9)℃;重复性好,组内变异系数为0.2%~1.1%.用该方法对疑似带病的大蒜材料进行检测,结果表明GCLV-SYBR GreenⅠPCR特异性强,操作简便,敏感性高,可以用于GCLV感染的检测及定量分析.     

猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法的建立与应用

用RT-PCR方法扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因片段,并克隆到PUC-T载体中,构建含有PEDV M基因片段的重组质粒。以系列稀释后的重组质粒为模板,基于SYBR GreenⅠ进行PEDV检测的实时荧光定量PCR扩增。结果显示,扩增效率为100.4%,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物的熔解曲线具有单一整齐的峰,标准曲线具有优良的线性关系,最低可准确检测520拷贝/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于3%。用所建立方法对3种常见猪源RNA病毒的检测结果均为阴性,对临床样品的检出率显著(P0.05)高于常规PCR方法。研究结果表明,建立了一种灵敏度高、特异性强、重复性好的检测PEDV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,可用于PEDV的定量检测和猪流行性腹泻的早期快速诊断。     

转基因大麦B-hordein基因荧光定量PCR方法的建立

为快速定量大麦贮藏蛋白基因B-hordein差异表达,利用SYBR Green I染料法测定转基因大麦和对照花后10 d籽粒B-hordein表达量,通过RT-PCR扩增B-hordein和内参基因actin片段,对PCR退火温度、引物浓度等进行优化,结合扩增曲线和熔解曲线分析。结果表明,转基因大麦B-hordein基因表达量较对照品种Golden Promise显著降低(P<0.05),B-hordein和actin扩增片段分别在(84.51±0.01)℃和(80±0.01)℃处显示特异性单峰,可成功建立转基因大麦B-hordein SYBR Green I实时定量PCR法。     

鸭乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、特异的鸭乙型肝炎病毒(DHBV)SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,设计一对引物扩增DHBV基因组,将其克隆到pMD-18-T载体上,然后以该重组质粒为模板,选择DHBV S基因保守序列设计一对定量PCR引物,构建标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验,并用所建立的方法评价拉米夫定和阿德福韦酯在鸭体内对DHBV-DNA复制的抑制效果。结果表明:该方法能特异性检测到DHBV;相关系数为1.00,扩增效率为105%;敏感度高,最低检测限为70个拷贝。拉米夫定和阿德福韦酯对DHBV感染后鸭外周血DHBV-DNA的复制均有很好的抑制效果,但停药后会出现轻度"反跳"现象。建立的DHBV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法具有特异、灵敏、快速等优点,可用于抗HBV药物的评价。     

伪狂犬病病毒gB基因荧光定量PCR检测方法的建立

用PCR方法扩增伪狂犬病病毒(PRV)的gB基因片段,构建含有gB基因片段的重组质粒,以不同浓度的PRV-gB基因重组质粒为模板应用SYBR Green I方法来建立检测PRV-gB基因载量的荧光定量PCR方法。结果显示:在(8.6×107~8.6×101)copies/μL范围内,回归方程为y=-3.5604x+41.165,其决定系数为0.9993,显示出优良的线性关系;扩增产物的熔解曲线仅有一个特异性单峰。该方法对猪圆环病毒、猪细小病毒、猪细环病毒等常见猪源DNA病毒进行检测时均没有扩增曲线,重复性试验的变异系数小于2%,表明建立了特异性强、重复性好、灵敏性高的PRV-gB基因SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。用该方法检测8种商品伪狂犬病弱毒活疫苗的每头份剂量的病毒载量,结果显示不同商品伪狂犬病弱毒活疫苗之间的病毒载量存在明显差异,与其标识剂量基本一致,表明该荧光定量PCR检测方法可用于疫苗剂量检测。     

转基因烟草中外源基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法,为转基因植物中外源基因拷贝数的检测提供参考.[方法]采用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,检测转基因烟草中外源绿色荧光蛋白基因(GFP)的拷贝数,以烟草单拷贝的内源核糖核酸还原酶基因(RNR2)作为内参基因,建立相对定量的双标准曲线法检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法.[结果]构建RNR2基因、GFP基因实时荧光定量PCR的标准曲线,分别为y=-0.2858x+5.6695和y=0.2826x+2.1048,R2分别为0.9994和0.9989,相关性较高.在检测的5株转基因烟草中GFP基因的拷贝数分别为5、8、19、28和45,非转基因烟草植株的GFP基因拷贝数为0.[结论]建立的转基因烟草中外源基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法具有简单、快速、准确等优点,可用于基因工程中对优良转化植株的筛选及外源基因表达量的快速检测和定量分析.     

实时荧光定量PCR检测对虾白斑综合症病毒方法的建立

[目的]根据对虾白斑综合症病毒（White Spot Syndrome Virus,WSSV）的保守序列,利用Primer5.0软件设计引物,建立了WSSV的荧光实时定量PCR检测体系。[方法]构建含有WSSV目扩增片段的质粒为标准品,进行定量PCR扩增,探索反应条件。[结果]确定了最佳退火温度（61℃）和最佳引物浓度（0.2μmol/L）,标准品浓度在8.8×1098.8×104个拷贝数之间有典型的＂s＂型扩增曲线,标准曲线中模板拷贝数（X）与Ct值的关系为Ct=-3.597lgX＋42.547,相关系数R2=0.993。[结论]该检测方法特异性强,对传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）、肝胰腺细小病毒（HPV）没有扩增反应。     

鸡毒支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立

 【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将其连接到PMD19-T载体,转化至大肠杆菌DH5α中,经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线,并进行特异性,灵敏性,重复性及临床样本检测试验,评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系数为0.990。最低检测限为72拷贝/20 μL ,其敏感性比常规PCR至少高100倍;无论是对不同病原DNA单模板还是几种病原DNA混合模板进行扩增,该方法都呈现很好的特异性;重复性试验中,批内和批间变异系数均小于2%,表明该方法重现性好;临床样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法的检测率明显高于常规PCR方法。【结论】本研究初步建立了基于种特异性基因pvpA的鸡毒支原体荧光定量PCR方法,为养禽场诊断和监测鸡毒支原体病原提供一种新的特异、灵敏的方法。     

Development of A Real-Time PCR Assay for Plasmodiophora brassicae and Its Detection in Soil Samples

A SYBR Green I real-time PCR assay was developed to detect and quantify Plasmodiophora brassicae ribosomal DNA(rDNA) and internal transcribed spacer(ITS).A pair of primers PBF1/PBR1 was designed based on the conservative region of rDNA-ITS of P.brassicae.The positive plasmid pB12 was obtained and used as the template to create standard curve.The specificity,sensitivity,and reproducibility of real-time PCR were evaluated respectively.Naturally and artificially infested soil samples containing different concentrations of P.brassicae were detected.The results demonstrated that standard curve established by recombinant plasmid was shown a fine linear relationship between threshold cycle and template concentration.The melting curve was specific with the correlation coefficient of 0.995 and that the amplification efficiency was 93.8%.The detection limit of P.brassicae genomic DNA was approximately 40 copies per 25 μL.The sensitivity of the assay was at least 100-fold higher than conventional PCR.Only DNA from P.brassicae could be amplified and detected using this assay,suggesting the highly specific of this assay.The coefficient of variation was less than 3%,indicating the PCR method revealed high reproducibility.The detection limit in soil samples corresponded to 1 000 resting spores g-1soil.Bait plants were used to validate the real-time PCR assay.This developed real-time PCR assay allows for fast and sensitive detection of P.brassicae in soil and should be useful in disease management and pest interception so as to prevent further spread of P.brassicae.     

禾谷丝核菌的次生代谢产物

禾谷丝核菌 (RhizoctoniacerealisVanderHoeven)菌株对小麦的致病性测定结果表明 ,3个菌株的致病力存在显著差异。小麦品种和禾谷丝核菌菌株间存在显著的相互作用 ,在两个感病品种“苏麦 3号”、“宁麦 6号”和R7、R4 6 两个强致病力菌株间 ,这种相互作用尤为明显。禾谷丝核菌在马铃薯蔗糖培养液中产生的次生代谢物种类多 ,产量高。试验明确了进行禾谷丝核菌次生代谢物分析的最佳液相色谱条件。液相色谱和气质联用的结果显示 ,致病力不同的 3个菌株间 ,次生代谢物的构成上有差异 ,呋喃甲酸和苯甲酸衍生物的产量在菌株间差异最大。禾谷丝核菌的酸性粗提物具一定的生物活性 ,在高浓度和低浓度下的作用相反。禾谷丝核菌的次生代谢物处理后 ,小麦组织的电导率与对照 (未处理 )没有差异 ,表明次生代谢物对小麦的细胞膜半渗透性可能没有影响     

小麦纹枯病综防技术区域性决策的初步研究

运用决策分析方法, 研究了在区域性生产条件和小麦不同抗性品种布局的情况下, 如何优化综合防治技术, 以达到控害增效的目的, 为因地制宜综合防治小麦纹枯病提供了一种基于决策分析理论的技术方法途径。     

实时荧光定量PCR技术的实验研究

实时荧光定量PCR技术是在普通PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术,已广泛应用于不同研究领域。论述了荧光定量PCR技术的基本原理、主要类型和定量实验方法,探讨了实验条件的控制、影响因素和优化实验结果的方法。