棉花纤维次生壁加厚期基因的表达谱分析

本研究以高纤维强度材料0-153和转基因抗虫棉sGK9708为亲本构建的高代重组自交系群体(F608)中纤维强度具有显著差异的两个系(高强材料69307和低强材料69362)作为材料,利用cDNA芯片技术,对纤维次生壁加厚阶段(15 DPA和20 DPA)的基因表达谱进行研究.共检测到差异表达基因3 383个,占cDN...     

棉纤维发育相关基因时空表达与纤维品质的关联分析

以14个纤维品质差异的棉花品种(或品系)为材料,研究10个纤维发育相关基因时空表达变化与纤维品质的关系,为阐明棉纤维发育相关基因与纤维品质形成关系提供理论基础。利用实时荧光定量PCR技术检测10个基因在14个供试品种(或品系)不同纤维发育时期的相对表达量,结果表明,虽然遗传背景完全不同,但它们具有某些共同表达特征。GhExp1、GhCIPK1、GhSus1、GhSusA1和GhPL这5个基因都是在纤维伸长期优势表达;GhACT1、GhRacA和GhRacB是在纤维伸长前期和次生壁加厚期高表达;而GhCelA1和GhcelA3是在纤维伸长后期和次生壁加厚期优势表达。这些基因表达谱与纤维品质关联分析显示,GhRacA在23DPA高表达且表达量与纤维品质显著正相关,其余基因在低表达时其表达量与纤维品质呈显著性相关,而在高表达时其表达量与纤维品质无相关性。GhExp1在20DPA的表达量与纤维比强度和整齐度呈显著负相关,与伸长率呈极显著正相关;GhPL在23DPA的表达量与纤维长度呈显著负相关;GhRacA在5DPA和23DPA的表达量均与伸长率呈极显著正相关;GhRacB在10DPA的表达量与长度和整齐度呈显著负相关;GhCelA1基因在5DPA的表达量与纤维长度呈显著正相关,与马克隆值呈显著负相关,在10DPA的表达量与马克隆值呈显著正相关,与伸长率达到极显著正相关,与比强度呈显著负相关,与长度和整齐度呈极显著负相关;GhCIPK1、GhACT1、GhSus1、GhSusA1和GhCelA3 这5个基因在纤维发育各时期的表达量与纤维品质各指标未检测到相关性。     

棉纤维发育相关基因时空表达与纤维品质的关联分析

以14个纤维品质差异的棉花品种(或品系)为材料,研究10个纤维发育相关基因时空表达变化与纤维品质的关系,为阐明棉纤维发育相关基因与纤维品质形成关系提供理论基础。利用实时荧光定量PCR技术检测10个基因在14个供试品种(或品系)不同纤维发育时期的相对表达量,结果表明,虽然遗传背景完全不同,但它们具有某些共同表达特征。GhExp1、GhCIPK1、GhSus1、GhSusA1和GhPL这5个基因都是在纤维伸长期优势表达;GhACT1、GhRacA和GhRacB是在纤维伸长前期和次生壁加厚期高表达;而GhCelA1和GhcelA3是在纤维伸长后期和次生壁加厚期优势表达。这些基因表达谱与纤维品质关联分析显示,GhRacA在23DPA高表达且表达量与纤维品质显著正相关,其余基因在低表达时其表达量与纤维品质呈显著性相关,而在高表达时其表达量与纤维品质无相关性。GhExp1在20DPA的表达量与纤维比强度和整齐度呈显著负相关,与伸长率呈极显著正相关;GhPL在23DPA的表达量与纤维长度呈显著负相关;GhRacA在5DPA和23DPA的表达量均与伸长率呈极显著正相关;GhRacB在10DPA的表达量与长度和整齐度呈显著负相关;GhCelA1基因在5DPA的表达量与纤维长度呈显著正相关,与马克隆值呈显著负相关,在10DPA的表达量与马克隆值呈显著正相关,与伸长率达到极显著正相关,与比强度呈显著负相关,与长度和整齐度呈极显著负相关;GhCIPK1、GhACT1、GhSus1、GhSusA1和GhCelA3 这5个基因在纤维发育各时期的表达量与纤维品质各指标未检测到相关性。     

海岛棉纤维发育相关基因GbPDF2酵母单杂交文库构建及其上游基因解析

为研究棉纤维起始发育的分子调控网络,以海岛棉(Gossypium barbadence L.)品种"海渝"开花当天(0 DPA)胚珠为实验材料,利用酵母单杂交技术来筛选棉纤维起始发育相关基因GbPDF2的上游调控转录因子。首先,克隆GbPDF2的启动子(Accession:KJ475468);构建了该启动子的诱饵融合载体(GbPDF2-PRO)-pAbAi,转入酵母细胞中重组为Y1HGold[Bait-pAbAi]菌株。之后,应用Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System系统构建酵母单杂交cDNA文库,转化重组酵母菌株,通过同源重组筛选GbPDF2的上游转录调节因子。构建的cDNA文库库容为2.23×106,重组率为95.8%,插入片段大小为300 bp~2000 bp,其中大于1000bp的阳性克隆为109个。cDNA插入片段经测序和Blast同源性分析,筛选出2个生长素响应因子,1个WRKY7转录因子,1个WD-repeatprotein 40等与纤维发育相关的转录调节因子,为研究棉纤维起始发育的信号转导通路奠定了基础。     

一个棉花液泡转化酶基因的克隆与功能分析

棉纤维正常发育需要大量的蔗糖供应。转化酶是生物体内蔗糖代谢途径中的关键酶之一, 对转化酶基因的结构和功能研究将有助于揭示复杂的棉纤维发育分子机制, 并为纤维品质改良提供优良的基因资源。本研究以棉纤维突变体im和遗传标准系TM-1纤维发育中显著差异表达的EST序列(GenBank登录号为EY196825)为探针, 通过电子克隆方法, 结合cDNA及基因组全长基因PCR扩增、测序验证, 克隆到一个棉花液泡转化酶基因GhVacInv2a (GenBank登录号为KF305322)。该基因ORF全长1857 bp, 编码618个氨基酸, 与已登录的陆地棉GhVacInv2基因(GenBank登录号为FJ864677)序列一致性为99%(E=0)。基因组序列分析表明, GhVacInv2a在二倍体棉种非洲棉和雷蒙德氏棉中含1个拷贝, 在四倍体陆地棉和海岛棉中存在2个拷贝, 其中GhVacInv2a和GhVacInv2分属于A、D亚组同源基因。该同源基因含7个外显子, 6个内含子。Q-PCR分析表明, 该基因在花药中表达量最高, 在快速伸长的纤维组织中优势表达。在13~19 DPA的纤维中, 其在TM-1中的表达水平极显著地高于im突变体。开发SNP标记, 将GhVacInv2a基因定位在异源四倍体棉花第3染色体上。标记与性状的关联分析显示, GhVacInv2a与纤维强度存在显著相关(P=0.0087), 表明GhVacInv2a在棉花纤维品质形成中可能发挥重要功能。     

海岛棉GbMYB5基因的克隆及表达分析

为了挖掘鉴定棉纤维发育相关基因,本研究根据海岛棉RIL群体定位的纤维强度QTL位点,结合转录组数据及海岛棉全基因组数据库注释信息,筛选出1个R2R3类MYB转录因子基因Gbar_A11G032760.1,根据该基因的注释信息,克隆并命名该基因为GbMYB5,qRT-PCR分析发现,在纤维发育15、20、25 DPA (Days post anthesis),该基因在高FS (Fiber strength)材料中的表达量显著高于低FS材料,且在高FS材料中明显上调表达;氨基酸序列分析表明,GbMYB5基因的编码区长747 bp,编码248个氨基酸残基,氨基酸序列包含1个高度保守的HTH-myb DNA-binding domain;序列同源比较及系统发育进化表明,该基因与不同物种的MYB5相关蛋白氨基酸序列都存在1个高度保守的HTH结构域;GbMYB5和雷蒙德氏棉的MYB5聚集在同一分支上,该基因与雷蒙德氏棉的同类基因亲缘关系较近。利用qRT-PCR分析不同组织表达情况,发现GbMYB5基因在花瓣和花萼中极显著表达量,雌蕊和雄蕊中显著表达一般,茎组织中表达不显著。研究初步分析了该基因的氨基酸序列及表达模式,为今后棉花MYB转录因子在纤维发育阶段的功能及分子机制的研究提供依据。     

盐碱胁迫下羊草消减文库的构建及分析

以盐碱胁迫下的羊草地上部分cDNA为实验方(tester),非盐碱条件下生长的羊草地上部分cDNA为消减方(driver),利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建了盐碱胁迫下羊草消减文库.从消减文库中筛选1920个阳性克隆,PCR鉴定插入片段大部分集中在300～800 bp之间.将聚类后得到的552个非重复序列与GenBank中的序列进行比对,其中有548条与数据库中的序列有同源性,其中功能已知的339个,功能未知序列209条.获得了与盐碱胁迫相关的基因,如单脱氢抗坏血酸还原酶(MDAR)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-ECS)、铁蛋白(Ferrtin)、水孔蛋白(PIP)、脱水素基因(dehydrin)、14-3-3蛋白等.本实验为抗逆基因的克隆及系统研究盐碱胁迫下羊草相关基因的表达奠定了基础.     

高品质转野生荠菜凝集素基因棉花的获得

利用花粉管通道转基因技术,将DE35S启动子驱动的野生荠菜凝集素(WSA)基因导入10个高品质棉花品种(系)。所使用的转基因表达载体还含有选择标记基因NPTⅡ(卡那霉素抗性基因)和Ω序列,以利于转基因植株的筛选以及WSA基因的高效表达。对转化当代3197棵棉苗的检测结果表明,4.88%植株具有卡那霉素抗性(Kan )。根据野生荠菜凝集素基因序列设计一对特异性引物,对156个Kan 植株进行PCR检测,筛选出45个转WSA基因棉花工程植株。45个株系纤维品质测定结果表明,获得了9个高品质转WSA基因棉花株系。并对植物基因工程研究中以NPTⅡ作为标记基因的局限性以及一些转WSA基因棉花株系纤维强度变劣的原因进行了探讨。     

亚洲棉石系亚1号耐旱相关基因SSH文库的构建及其分析

通过抑制消减杂交技术成功地构建了亚洲棉石系亚1号耐旱相关基因cDNA文库。通过蓝白斑筛选、菌落PCR及生物信息学等分子生物学手段分析和检验了库的质量,最终筛选出阳性克隆392个。通过EST测序得到265个单一序列,其中41个为重叠群,224个为单拷贝。生物信息学分析结果表明,该文库含有大量与耐旱相关的基因,并且涉及植物生理中多种代谢途径。     

一个棉花GDSL脂肪酶基因的克隆与功能分析

GDSL脂肪酶与GXSXG脂肪酶是2个重要的脂肪酶亚家族。其中, GDSL家族脂肪酶具有水解酶活性, 能水解多种酯类物质。本试验根据新乡小吉无绒无絮(XinWX)和无绒有絮(XinFLM)近等基因系纤维起始期29K芯片竞争杂交结果, 选择了一个在纤维起始期具有极显著表达差异的EST序列(GenBank登录号为DR458916), 以该序列信息为探针, 利用电子克隆方法并进行cDNA及基因组全长基因PCR扩增、测序验证, 克隆获得一个陆地棉GDSL脂肪酶基因(GhGDSL;GenBank登录号为KC186125)。该基因ORF长1065 bp, 编码354个氨基酸, 含有5个外显子和4个内含子。该基因在二倍体棉种基因组中含一个拷贝, 在四倍体棉种基因组中含2个拷贝。序列比对显示该基因在四倍体棉种的2个亚组中独立进化, 且D亚组比A亚组变异大。染色体定位显示该基因2个拷贝分别位于A4 (Chr. 4)和D4 (Chr. 22)染色体上。定量RT-PCR结果表明, GhGDSL在开花后3~10 d的纤维组织中表达量高, 其中在海7124中表达高峰在8DPA, 在TM-1中表达高峰从5DPA持续到10DPA。利用[(TM-1×Hai7124)×TM-1]的BC₁S₁群体开展GhGDSL功能与纤维、种子品质性状关联分析, 发现该基因A亚组的拷贝与种子脂肪含量存在显著相关(P=0.048);D亚组的拷贝与种子蛋白含量存在极显著相关(P=0.008)。推测GhGDSL基因功能与种子中脂肪、蛋白代谢相关, 同时也参与纤维伸长过程。     

高品质陆地棉蔗糖代谢关键酶活性对纤维品质形成的影响

以高品质陆地棉鲁324系(324)、渝棉1号(YM-1)和普通陆地棉鲁棉研18 (L18)为材料, 研究蔗糖代谢关键酶活性变化对纤维品质形成的影响。结果表明, 高品质陆地棉叶片蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthetase, SPS)活性高, 蔗糖合成能力强, 主茎叶和果枝叶蔗糖含量高, 蔗糖供应能力强。Logistic方程模拟纤维素累积过程, 高品质陆地棉纤维素进入快速累积期的时间晚, 终止期延后, 快速累积持续期长, 累积速率平缓, 最终纤维素含量高, 纤维比强度高。在纤维发育前期, 高品质陆地棉蔗糖贮存较多, 为次生壁发育提供了充足的初始底物。高品质陆地棉蔗糖合成酶(sucrose synthetase, SS)活性高, 降解蔗糖能力强, 酶活性迅速增加时期与纤维素快速累积期相吻合; SPS活性在纤维素快速累积期终止前均明显高于普通陆地棉。叶片SPS活性和棉纤维中SS、SPS活性与纤维素累积及纤维品质形成有密切关系。     

高品质陆地棉纤维品质形成特点的研究

以常规棉苏棉16为对照,研究了高品质棉渝棉1号、高品质Bt棉科棉1号的纤维发育及品质形成特点。结果表明,与苏棉16相比,科棉1号和渝棉1号纤维快速伸长期略长,快速伸长期内的长度日增长速率较高;比强度快速伸长期较短,但在快速伸长期内的增长速率较高;纤维素含量随着花后天数呈增加趋势,17 d内的增长速率很低,17 d后速率明显加快,至花后24 d呈直线上升趋势,到花后45 d时纤维素含量基本稳定。与苏棉16相比,渝棉1号和科棉1号花后IAA含量较高;花后17 d ABA含量较高,花后24 d的ABA/IAA较高,说明不同基因型纤维发育和品质建成过程的差异与其纤维细胞内的激素变化有关。     

棉花纤维RNA提取方法的比较及酵母双杂交文库的构建

为了从棉花纤维中提取高质量的RNA用于构建酵母双杂交文库,采用4种不同的方法提取9天和19天棉花纤维的RNA。琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测结果表明：热硼酸法适用于初生幼嫩纤维和次生加厚纤维的RNA提取,CTAB-PVP法仅适用于初生幼嫩纤维的RNA提取,异硫氰酸胍法和高盐高pH值法提取的RNA由于杂质含量较多而影响反转录效果。采用热硼酸法大量提取总RNA,纯化后的mRNA反转录为cDNA,通过重组将扩增的cDNA片段定向插入到pGADT7-Rec AD克隆载体中,得到棉纤维9天和19天的酵母双杂交cDNA文库。2个文库的滴度分别是1.01×107 cfu /mL和8×106 cfu /mL,cDNA插入片段长度集中分布在250~2500 bp之间。由此可以看出,构建的2个棉纤维文库质量较高,可用于棉花纤维素合成和调控途径的研究。     

高品质陆地棉棉铃发育特点

以高品质棉杂交种科棉3号、常规种科棉4号为供试品种(常规品质棉苏棉[1]5为对照),于2004-2005年测定棉铃的发育性状。结果表明,高品质棉与常规品质棉明显不同,前者铃较长、铃体积大、铃重高,棉铃最大直径与后者相似。科棉3号以花后10 d内铃长增长快于常规品质棉、科棉4号则以花后10 d、21~30 d快于常规品质棉;高品质棉铃最大直径的增长持续期短于常规品质棉,且花后10 d内增长慢;高品质棉在花后20 d内铃体积的增大高于常规品质棉,尤其以花后11~20 d增长更快;科棉3号在开花后10 d后铃重增长快于常规品质棉,科棉4号则表现在开花后20 d前快于常规品质棉。说明以铃长为重要指标进行高品质类型棉花品种选育、以棉铃体积和铃重提高为载体进行高产优质栽培调节是关键技术。     

利用马克隆值差异显著的BILs鉴定棉纤维品质相关基因

【目的】马克隆值是衡量棉纤维品质的重要指标之一。利用马克隆值存在显著差异的2个陆海回交近交系材料进行高通量基因芯片分析,旨在筛选和鉴定棉纤维发育相关的关键基因。【方法】从SG747(Gossypium hirsutum L.)和Giza75(Gossypium Barbadense L.)高世代回交近交系(Backcross Inbred Lines,BILs)群体中选取NMGA-140(马克隆值6.2)和NMGA-051(马克隆值4.0)为材料,利用Affymetrix公司的棉花寡聚核苷酸基因芯片对其开花后10 DPA(Days after anthesis)的棉纤维进行了表达谱分析。【结果】获得了2655个差异表达基因,包括功能预测基因(15.57%),翻译、核糖体结构与生物合成相关基因(13.54%)和翻译后修饰、蛋白质转换、分子伴侣相关基因(9.31%)等。推测β-tub10正向调控棉纤维发育过程,β-tub1负向调控棉纤维发育过程,Ghi.3578.1.S1_s_at在棉纤维发育早期起到了作用。【结论】为棉花纤维品质的遗传改良提供了丰富的基因资源,为分子标记辅助育种开发更多新的分子标记。     

多环境下陆地棉(Gossypium hirsutum L.)重组自交系铃重与衣分性状的QTL分析

本研究利用以SGK9708为母本,0-153为父本构建的196个陆地棉重组自交系(F6:8)构建了包含186个标记,总长827.84 cM,标记间平均距离4.45 cM,覆盖棉花基因组18.6%的遗传连锁图谱,并对7个环境下的铃重和衣分性状进行QTL定位和上位性互作分析.利用两种分析软件(WinQTLcart2.5和Q...     

棕色棉纤维发育过程中碳水化合物和色素的变化特征

 以深棕色棉、棕色棉、浅棕色棉和白色棉（对照）为材料,研究了纤维发育过程中碳水化合物和色素的变化特征。结果表明,在开花当天至开花后10 d,白色棉纤维中的可溶性总糖和蔗糖含量最高;其次为浅棕色棉,棕色棉和深棕色棉含量较低且接近;从开花后15 d至纤维成熟期棕色棉和白色棉纤维中总糖和蔗糖含量差异不大。整个纤维发育期内果糖含量一直呈下降趋势,且棕色棉和白色棉差异不明显。从开花当天至纤维成熟时,纤维中的色素含量从高到低依次为：深棕色棉>棕色棉>浅棕色棉>白色棉,说明棕色棉纤维因色素的大量积累将消耗部分碳水化合物。     

棉花Gh14-3-3L2基因的分子克隆及其互作蛋白质的初步鉴定

根据本实验室蛋白质组学研究鉴定的EST序列,克隆了一个可能在棉花纤维起始和伸长发育阶段起调控作用的棉花14-3-3蛋白质的全长cDNA,定名为Gh14-3-3L2。Gh14-3-3L2蛋白毒性大,难以通过酵母双杂交途径鉴定其互作蛋白质组。因此,本研究首先经原核表达并纯化出添加六联组氨酸标签的Gh14-3-3L2蛋白,以此蛋白质为诱饵,以开花前3 d至开花后6 d正常野生型、徐州142无纤维突变体和Li-1无长绒纤维突变体胚珠或纤维混合蛋白质为猎物样品,采用Pull-down技术分离、富集Gh14-3-3L2相互作用蛋白质,再经2-DE和MALDI-MS/MS串联质谱分析,鉴定了7个可能与Gh14-3-3L2相互作用的蛋白,其功能有作为分子伴侣、参与微囊的运输、代谢、信号转导等。为进一步解析Gh14-3-3L2的功能以及棉花纤维发育的分子调控网络奠定了基础。     

Study Crystallinity of the Developing Cotton Fibers by Micro-Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and X-Ray Diffraction (XRD)

[Objective] The change of crystalline index (CI) of two different cultivated cotton fibers at the development stage was studied by micro-Fourier transform infrared spectroscopy (micro-FTIR) and X-ray diffraction (XRD). The feasibility was verified by measuring CI in developing cotton fibers with micro-FTIR method. And it was utilized to estimate the CI of mature cotton fibers. [Method] Upland cotton 0-153 and sea island cotton S-6 were selected as examined materials. The cotton fibers of 2 varieties were obtained at 5-30 d post anthesis respectively, with a sampling interval of 5 d. After obtaining the fiber, it was washed several times with distilled water and then placed in an oven at 40℃ for 48 hours. After drying, the FTIR and XRD spectra of each sample were obtained. The CI is calculated according to 4 different FTIR-CI calculation methods, the crystallinity changes of different cotton varieties in the developing period were compared, and the correlation between the FTIR-CI and XRD-CI was studied. [Result] Only FTIR-CI calculated by the Carrillo-Colom index(FTIR-CCI) had a good correlation with XRD-CI method, with higher R2 than 0.9 of both varieties. The fitting model (IR-CI) between the FTIR-CCI and XRD-CI was used to calculate the CI of the twenty-three randomly selected mature fibers. The results showed that the accuracy of IR-CI was good, and the XRD-CI results were within the error range of the calculated results according to the IR-CI model, while the precision of IR-CI could not reach anticipation. [Conclusion] Micro-FTIR can be used to study the change of cellulose in cotton fiber during the developing period. The model of IR-CI established by the correlation between the FTIR-CCI and XRD-CI, can be used to evaluate the crystallinity of developing period in cotton fiber. However, for the study of the crystallinity of mature fibers, it is necessary to use a large number of samples in the later experiment to establish an optimized model.