韩国克隆出具有人类免疫基因的迷你猪

本刊辑：据国际畜牧网报道，韩国科研人员最近公布了一项新的研究成果，克隆出具有人类免疫基因的迷你猪，目前这只名叫“Xeno”的小猪已经健康成长了90天。这项研究对异种器官移植具有重大意义。     

基因修饰猪作为异种器官移植供体在克服免疫排斥反应中的研究进展

器官短缺是制约器官移植发展的重要因素,而异种器官移植是解决器官移植短缺的有效途径。猪作为异种器官移植研究的最佳供体动物已得到广泛认可,但要实现猪异种器官移植的临床应用需要克服多重免疫排斥反应。基因修饰猪的改造,为解决免疫排斥反应实现异种器官移植提供了理论支撑。本文以免疫排斥反应发生的时间先后为顺序,依次对基因修饰猪在克服超急性排斥反应、急性血管排斥反应、细胞排斥反应和慢性排斥反应的研究进展进行了综述。     

韩国培育出克隆猪 含有人类生长激素基因

##正##据韩联社8月9日报道称,韩国CHOA制药公司表示,该公司成功培育出了拥有人类生长激素基因的转基因克隆猪。人类生长激素是一种由脑下垂体腺分泌,能刺激生长的物质。韩国CHOA制药公司称,通过在猪体细胞内注入人类生长激素基因后,移植到无核卵     

“基因猪”为人类提供器官移植成为可能

<正>昨天,四川省科技厅、卫生厅联合就"基因工程猪异种器官移植关键技术及平台建设"进行项目论证。中华医学会器官移植学分会主任委员、华中科技大学教授陈实等异种移植领域专家在听取项目汇报后表示,该项目对促进我国异种器官移植的基础和临床前期研究工作具有重大意义,未来"基因猪"为人类提供器官移植将成为可能。     

民猪FoxN1基因的克隆及生物信息学分析

试验旨在对民猪FoxN1基因的结构和功能进行初步探索。利用常规PCR技术对民猪FoxN1基因进行克隆,利用生物信息学手段对所获得FoxN1基因完整编码区序列进行分析,对民猪和大白猪的FoxN1基因序列进行比对,并构建分子进化树。结果显示,民猪FoxN1基因完整编码区长1 941 bp,编码646个氨基酸,分子质量为68.64 ku,理论等电点为5.81。FoxN1蛋白位于细胞核内,不存在信号肽,不是分泌性蛋白,不存在跨膜区,在第269-347氨基酸处有1个叉头结构域,该蛋白在不同的物种间有高度的保守性。克隆发现了3种转录剪切变异体,与变异体1相比,变异体2在第124-387核苷酸位置处发生缺失,变异体3在581-582处发生GCA插入。民猪与大白猪的FoxN1基因序列相比,存在4个突变位点,其中3个是同义突变,1个是错义突变,导致第108位的氨基酸发生了改变。由分子进化树得知,民猪与偶蹄目动物亲缘关系较近。上述结果表明FoxN1基因结构复杂,对其生物信息特性的探究将为进一步揭示民猪FoxN1基因的功能提供依据。     

猪星状病毒ORF2基因的克隆及序列分析

参考GenBank上发表的猪星状病毒亚基因组序列,设计1对引物,对猪星状病毒广西流行株衣壳蛋白ORF2基因进行扩增,最终克隆得到PAstV/NNJG7株的衣壳蛋白完整序列.序列分析发现,其ORF2全长2 358 bp,编码786个氨基酸;与猪星状病毒Ⅰ型参考株核苷酸同源性最高,为77.3％～79.4％;在ORF1b和ORF2连接处有一段高度保守的序列,在ORF2 3'端有一段长83 bp非翻译序列及一个含43 bp高度保守的茎环样基序.本试验不仅丰富了猪星状病毒衣壳蛋白基因序列,也为基因疫苗和诊断试剂盒的研制提供材料及理论依据.     

猪Cathepsin B 基因cDNA分子克隆、序列分析及遗传多态性分析

采用 RT-PCR 结合克隆测序的方法,从猪肌肉组织总 RNA 中克隆出了猪组织蛋白酶 B(Cathepsin B,CTSB)基因的 cDNA 序列,并推导出其编码的氨基酸序列.猪 CTSB 基因开放阅读框(ORF)全长1 008 bp,编码335 个氨基酸.同源性分析结果表明,猪与人、鼠、牛的 CTSB 基因 cDNA 编码区(CDS)同源性分别为 85%、81%、90%,推测的氨基酸序列同源性分别为 81%、79%、91%.利用同源性结合序列特征预测表明该蛋白具有信号肽和前肽序列.蛋白质结构同源建模分析表明,该蛋白具有木瓜蛋白酶家族的典型空间结构,包括1个底物结合凹槽和3个相互靠近的活性位点.另外采用 PCR-SSCP 方法,在147头个体中分析了CTSB基因第6内含子内的SS-CP位点多态性,检测到3个等位基因6种基因型.FF基因型个体的各项嫩度指标最高,其最大剪切力与硬度值分别为6.56 kg和23.55 kg·s,极显著地高于 EE 和 EF 基因型个体(P<0.01),平均剪切力为4.85 kg,显著地高于EF基因型个体(P<0.05).     

Myostatin基因的克隆及免疫载体构建

肌肉生成抑制素基因(Myostatin,MSTN),又称GDF-8,是TGF-β超家族中GDF亚族的成员之一,其对肌肉的生长发育具有负调控作用,该基因的缺失或突变可以造成肌纤维数目的增多或直径的增大。本试验根据Gen Bank已发表的牛的MSTN基因序列,设计特异性引物,利用巢式PCR方法,扩增MSTN基因的编码区。为构建具有高免疫原性的免疫载体,将MSTN基因插入到HBs Ag基因S区的3'末端,得到HBs Ag与MSTN基因相连接的融合表达质粒。经酶切和测序鉴定表明,重组质粒p EF1α-DsRed-S-MSTN构建成功,为后续的细胞和动物实验奠定基础。     

双拷贝抑制素基因疫苗pcISI的构建和表达及免疫

为构建高免疫原性的卵泡抑制素（Inhibin,INH）DNA疫苗,将INH基因片段α1-32插入到pcIS中乙肝表面抗原（HBsAg）S基因第112-113氨基酸残基密码子之间,构建含2拷贝INH的融合表达质粒pcISI。酶切和测序鉴定表明,重组质粒pcISI构建成功。脂质体包裹法将pcISI转染HeLa细胞,ELISA检测表达产物的INH免疫反应原性。结果表明,融合目的基因在HeLa细胞获得表达,ISI融合蛋白具有比IS融合蛋白更强的INH抗原抗体反应性。将pcISI免疫6只大鼠后,5/6的大鼠产生了抗INH抗体,抗体P/N值在免疫后第2-6周高于pcIS免疫组。这些结果表明,所构建的质粒pcISI可以表达抑制素,表达产物具有较强的免疫原性。     

猪抗病和免疫相关候选基因能研究进展

通过育种选择提高猪的抗病性，不仅可以为我们提供品质更优良的肉产品；还可以最大限度地减小因疫病给养猪业带来的经济损失。尤其是近年来，随着病害造成的危害和损失越来越严重．抗病育种研究成为各国育种学家倍加关注的焦点。猪的基因组计划和遗传连锁图谱的发展以及DNA分子标记密度的增加，使许多控制猪经济（数量）性状的QTL逐渐被发现，并显示出巨大的应用前景。本文概述了猪抗病性或免疫相关候选基因的研究进展，综述了动物抗病育种研究的现状、存在问题与前景。     

猪抗病和免疫相关候选基因的研究进展

通过育种选择提高猪的抗病性,不仅可以为我们提供品质更优良的肉产品;还可以最大限度地减小因疫病给养猪业带来的经济损失。尤其是近年来,随着病害造成的危害和损失越来越严重,抗病育种研究成为各国育种学家倍加关注的焦点。猪的基因组计划和遗传连锁图谱的发展以及DNA分子标记密度的增加,使许多控制猪经济(数量)性状的QTL逐渐被发现,并显示出巨大的应用前景。本文概述了猪抗病性或免疫相关候选基因的研究进展,综述了动物抗病育种研究的现状、存在问题与前景。     

从江香猪ApoC3基因的克隆及亚细胞定位研究

为了观察从江香猪载脂蛋白C3(ApoC3)基因及其表达产物在真核细胞中的亚细胞定位情况,以脂肪型小型猪从江香猪为研究对象,克隆ApoC3基因CDS区,构建携带有绿色荧光蛋白的pEGFP-C1-ApoC3重组质粒,转染HEK-293T细胞。结果显示:从江香猪ApoC3基因与GenBank上公布的序列相比,在141位有1个碱基发生转换,由腺嘌呤(A)突变成鸟嘌呤(G),为无义突变;对ApoC3蛋白的亚细胞定位分析表明,该蛋白在胞外基质占55.6%,内质网占22.2%,液泡占11.1%,细胞质占11.1%。pEGFP-C1-ApoC3重组质粒转染HEK-293T细胞后的荧光共定位结果显示,ApoC3蛋白在细胞中表达部位与PSORT II Prediction软件预测结果一致。本研究结果为进一步构建ApoC3基因转基因动物模型,开展ApoC3基因的多态性变化而导致的相关疾病研究奠定了基础。     

猪细小病毒PPV-SD1株VP2全基因的克隆及原核表达

为研究猪细小病毒PPV-SD1分离株的VP2蛋白的结构与功能,自行设计引物,通过PCR扩增的方法,获得VP2全基因,克隆到pMD18-T载体中进行测序,然后亚克隆到pET30a(+)表达载体中,构建并筛选出阳性重组子,标记为pET30a-VP2。将阳性重组质粒转化进RosettaTM宿主菌中,通过改变IPTG浓度、诱导温度和诱导时间,使重组蛋白获得表达,并确定最佳诱导条件为:IPTG终浓度1.0 mmol/L、诱导温度37℃、诱导时间为3~4 h。经SDS-PAGE和Western-blotting分析表明该重组蛋白相对分子量约为68 ku,具有良好的免疫学活性。     

猪Toll样受体9基因的克隆、序列分析及其结构预测

本研究应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增技术,从猪脾脏淋巴细胞中,克隆了猪Toll样受体9基因(pTLR9).基因序列分析表明,克隆的pTLR9基因ORF为3 093 bp,编码1 030个氨基酸,含18.5%的亮氨酸,含有24个氨基酸的信号肤序列,属于Ⅰ型跨膜受体,具有富含亮氨酸的重复序列(LRR)和Toll/IL-1R同源区结构域;与GenBank上登载的pTLR9参考序列(AY859728)的同源性为99.3%,与牛、马、羊和人的同源性较高,与家鼠、褐鼠的次之,TLR9的演化关系与亲缘关系密切.     

猪骨骼肌发育过程中免疫相关基因的表达分析

为探究猪骨骼肌发育过程中免疫相关基因的表达模式以及相关生物学功能,本研究根据蓝塘猪和长白猪骨骼肌10个发育时期的转录组数据,对各时期免疫相关基因的表达数目和表达量进行分析,鉴定了相邻发育时期之间以及同一时期品种间差异表达的免疫相关基因,并对后者进行功能注释分析。结果表明:在蓝塘猪与长白猪骨骼肌发育过程中存在1 129个表达的免疫相关基因;胚胎期35 d和49 d、胚胎期91 d和生后期2d这2组相邻时期之间的差异表达免疫相关基因数目最多;品种间差异表达免疫相关基因数目则在胚胎期49d以及生后期180d最多,且趋向于在蓝塘猪上调表达,并富集在NIK/NF-κB信号传导、细胞凋亡的负调控等生物学过程中。本研究表明免疫相关基因在猪骨骼肌发育过程中存在表达,长白猪与蓝塘猪骨骼肌生长发育差异可能与NF-κB介导的细胞凋亡有关。     

猪伪狂犬病病毒gE基因缺失苗免疫试验

为了掌握猪伪狂犬病gE基因缺失疫苗免疫效果,并制定合理的免疫程序,选用国产和进口的猪伪狂犬病gE基因缺失弱毒疫苗,用4种不同的免疫程序,对250头母猪和1000头仔猪进行了免疫试验。试验期间,按比例定时采集免疫猪的血液,用ELISA试剂盒进行抗体检测,证明猪伪狂犬gE基因缺失疫苗,无论国产苗或进口苗都可以产生良好的免疫效果;无论跟胎免疫、1年2次普免,每隔4个月定时免疫,效果均良好。种猪免疫抗体合格率达100%,仔猪49日龄前抗体合格率达100%,75日龄后抗体逐渐降低,120日龄后基本消失。为了使猪体免疫力更强,不给野毒入侵的机会,建议仔猪在首免后,适当时间进行二次加强免疫。而只给公猪、母猪春秋两季免疫,不给仔猪免疫组,仔猪在35日龄后抗体降为阴性,不能抵抗野毒的侵袭,这种免疫方法不宜推广。     

猪种布氏杆菌WboA基因缺失株对绵羊的免疫剂量及免疫程序研究

为优化猪种布氏杆菌WboA基因缺失株(B.suisΔWboA)对绵羊的免疫条件,本研究采用1岁左右的成年雌性绵羊对B.suisΔWboA的免疫剂量及免程序进行了比较研究。实验分5个组进行,其中A、B、C 3个试验组分别以2倍剂量重复接种、4倍剂量重复接种和单剂量1次接种B.suisΔWboA,D组单剂量1次接种猪种布氏杆菌S2疫苗株(B.suis S2),E组为空白对照组。各组羊首免后7 d、21 d和35 d分别采血,测定血清抗体水平;在首免后35 d,分别采用布氏杆菌强毒菌M28株(B.melitensis M28),经腹股沟皮下注射攻毒。攻毒后28 d,分别取试验羊的脾脏分离攻毒菌株。所有试验羊,在实施攻毒前,其精神、食欲均正常。血清抗体测定结果表明,在二免7 d、21 d后,A组和B组试验羊的抗体水平明显高于C组,而且均超过D组试验羊的抗体水平。攻毒后的细菌分离结果表明,攻毒后28 d,A组和B组试验羊的脾脏细菌分离数量明显低于C组试验羊,并且均低于D组试验羊的细菌分离水平。实验结果表明,B.suisΔWboA的免疫剂量由单倍改为2倍或4倍,免疫程序由单剂量1次改为2倍或4倍剂量2次,可以明显提高免疫效果,并达到与亲本疫苗菌株B.suis S2的免疫水平。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型7型25-4株ApxⅡCA基因的克隆和基因缺失

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型7型25-4株ApxIICA基因用特异性引物进行PCR扩增并克隆到T载体上,构建重组质粒pMD18-ApxIICA,将pMD18-ApxIICA转化到E.coli JM83中并测序.序列分析表明血清型7型25-4株ApxII CA与其它血清型(5型和9型)核苷酸序列同源性达98%以上,氨基酸序列同源性达90%以上.利用ApxIIC基因内部单一的SpeI位点,设计特异性的引物,利用PCR技术在ApxIIC基因内部缺失165bp的核苷酸片段,PCR产物再用SpeI进行酶切,并体外连接构建得到含有ApxIIC缺失基因的重组质粒pMD18-ApxII△/CA.     

Enterocin A结构基因和免疫基因的克隆及序列特征分析

采用PCR技术从屎肠球菌的染色体DNA上扩增到1条529 bp的DNA片段entAIc，以pGEM—T为载体，将该基因片段克隆到大肠杆菌中，对阳性重组质粒pGAI测序。序列分析结果表明：片段entAIc含有2个ORF，Enterocin A结构基因ent A和免疫基因entI，2个基因紧密相连。核苷酸序列分析显示，不同菌株来源的ent A和ent I具有较高的同源性，分别达到99．87％和99．76％。氨基酸序列分析显示不同菌株来源的Enterocin A前体完全相同，免疫蛋白仅有1个氨基酸差异。     

猪脾脏结构和功能及其免疫关键基因研究进展

脾脏作为猪最大的次级淋巴器官,含有多种免疫活性细胞和免疫因子,是先天性免疫和适应性免疫重要的应答场所,具有广泛的免疫调控功能;同时可清除衰老、损伤红细胞及过滤病原体,并在造血和储藏血细胞方面具有重要作用。这些功能与脾脏的结构密切相关,其中红髓主要作为血液滤过器,执行造血、储血和清除异物的功能;白髓是免疫的主要区域,含有多种免疫细胞,可执行特异性免疫应答调控功能;而边缘区是连接两个区室的重要桥梁,使所有细胞和抗原都能通过其进入脾脏不同部位。不同的发育和免疫关键基因是实现脾脏功能的根本,发育基因的表达保证了其结构的完整,为脾脏执行各种功能提供空间。免疫关键基因的表达确保了免疫反应进行,其中不同模式识别受体基因的表达保证了先天性免疫的吞噬和识别应答,而各种免疫细胞分泌的多种细胞因子和免疫活性物质是获得性免疫反应的基础,实现机体清除和监控抗原的生理过程。随着脾脏研究的深入,对其各种免疫细胞和免疫功能有了新的认识。作者首先阐述了脾脏组织不同区域的生物学功能;然后结合机体免疫应答机制,论述脾脏先天性和特异性免疫功能以及所需免疫细胞和免疫因子的作用与关联;最后简单介绍了脾脏胚胎期和出生后期的组织发育和免疫相关基因,总结了猪脾脏先天性免疫中重要的模式识别受体及其基因家族,为研究猪脾脏先天性免疫功能提供参考。