哺乳动物腔前卵泡体外培养研究进展

哺乳动物腔前卵泡的体外培养可充分挖掘优良母畜潜在的遗传和繁殖潜力,为体外胚胎生产提供大量的卵母细胞来源,因而正日益受到人们的重视。本文就哺乳动物腔前卵泡的体外发育中的培养系统、培养方法,培养形式以及影响其体外发育的因素等几个方面进行了阐述。     

猪腔前卵泡体外培养研究进展

哺乳动物卵巢中有数量丰富的腔前卵泡,腔前卵泡体外发育的研究,对于揭示卵子发生和卵泡发育的内在规律有重要意义,并可以最大限度利用卵巢资源促进动物繁殖,保护濒临灭绝物种及人类生殖健康。猪腔前卵泡自开始研究以来,已取得了很大的进展。作者简要阐述了猪腔前卵泡培养方法、培养条件的研究进展及其体外培养技术存在的问题和发展前景。     

牛腔前卵泡的体外培养

通过在α- MEM和 D- MEM/ F1 2 基础液中添加不同比例的 ITS、丙酮酸钠、谷氨酰胺、次黄嘌呤和血清 ,观察了不同基础液对牛腔前卵泡体外生长发育的影响 ,从而筛选出较好的组别。在筛选出的基础液组别中添加 3个水平的FSH、L H、E2 ,观察了其对牛腔前卵泡体外生长发育的影响。结果表明 ,α- MEM和 D- MEM/ F1 2 2种基础液中以α-MEM为好 ,不同的基础培养液组合对牛腔前卵泡的体外培养有一定的影响。添加不同水平的激素对牛腔前卵泡体外培养也有显著影响。试验初步筛选出最佳的培养液成分为α- MEM ITS(I- 5 m g/ L ,T- 5 mg/ L ,S- 5μg/ L ) 丙酮酸钠(0 .2 3mmol/ L) 谷氨酰胺 (1.5 m mol/ L) 次黄嘌呤 (2 m mol/ L) 血清 (7.5 % ) FSH(0 .2 5 mg/ L) L H(5 IU/m L ) E2 (0 .5 mg/ L )。     

哺乳动物腔前卵泡卵母细胞的体外培养

阐明哺乳动物卵泡体内发生的一般模式，回顾腔前卵泡体外培养的研究历史，着重论述腔前卵泡的获取及鉴定标准，常用的培养体系和影响腔前卵泡体外发育的多种因素。     

哺乳动物腔前卵泡体外培养及研究进展

哺乳动物卵巢内的原始卵泡库是雌性生殖资源的储存库,但大部分卵泡在腔前阶段已退化闭锁了,这无疑是对这一资源的巨大浪费。因此,越来越多的学者致力于腔前卵泡的开发和利用,建立了一系列的培养体系,尤其在小鼠上做的比较成功,已经得到了少量后代。文章主要就卵泡的发生发育过程,腔前卵泡的分离方法,培养基的选择,不同直径腔前卵泡培养体系的建立,影响腔前卵泡发育的因素及研究进展进行了阐述,为进一步完善腔前卵泡培养体系,揭示其发育机理提供参考。     

影响小鼠腔前卵泡体外发育因素的研究

通过在培养液中添加胎牛血清（FCS），牛血清白蛋白（BSA）及卵泡刺激素（FSH），对小鼠腔前卵泡进行体外培养，观察卵泡腔的形成及雌二醇（Estradiolum,E2)和睾酮（Testosteroni propioas,T)的分泌情况.     

牛腔前卵泡在体外无血清培养中发育为有腔卵泡

用无血清培养系统研究了牛腔前卵泡的体外培养。直径为100－200μm的牛腔前卵泡在添加L－谷氨酰胺、BSA、睾酮、转铁蛋白和硒的McCoy′s 5a培养液中培养，卵泡保持正常的形态结构并持续生长，培养10d左右形成贸泡腔，成腔率约50％。培养液中添加胰岛素对卵泡直径的增长和卵泡腔的形成有明显的促进作用，但添加FSH对腔前卵泡的生长未表现促进作用。     

激活素A和胰岛素样生长因子-I对冷冻保存后小鼠腔前卵泡体外培养的影响

为了探讨激活素A和胰岛素样生长因子-I对冷冻保存后小鼠腔前卵泡体外发育的影响,试验分别在培养液中加入激活素A和胰岛素样生长因子-I(IGF-I)对小鼠腔前卵泡进行体外培养.结果表明:激活素A组和激活素A+IGF-I组的成活率显著高于未添加因子的冷冻对照组和IGF-I组(P<0.05);激活素A组、IGF-I组、激活素A...     

体外培养牛腔前卵泡颗粒细胞的超微结构研究

透射电镜下，简易机械法分离得到的腔前卵泡有1～3层颗粒细胞，相邻颗粒细胞间存在明显而广泛的间隙连接，卵泡基膜完整，外无卵泡膜。培养过程中超微结构的变化与体内发育腔前卵泡类似。培养6d时观察到颗粒细胞增殖现象，培养15d时，个别卵泡的内膜细胞开始形成。超微结构研究结果表明，本培养体系适于小腔前卵泡的体外培养。     

猪腔前卵泡机械分离研究

本研究以分离到的卵泡数量、分离时间和卵泡在体外培养3 d后的存活率为指标比较了两种机械方法分离猪腔前卵泡的效果。结果表明:用针刮法分离猪腔前卵泡的数量(Φ<50μm:203600±59000;50μm≤Φ≤150μm:29.40±10.34;Φ>150μm:9.30±3.29)极显著(P<0.01)高于剪碎法(Φ<50μm:18900±12000;50μm≤Φ≤150μm:13.95±3.70;Φ>150μm:4.95±1.61),而且针刮法16.16±1.43 min分离时间比剪碎法(20.30±1.48)min短,(P<0.01)。体外培养3 d后,腔前卵泡存活率在两种方法之间没有明显差异。说明应用针刮法分离猪腔前卵泡能有效保护卵母细胞和颗粒细胞的正常形态以及基膜的完整性,从而使分离到的猪腔前卵泡维持正常的生理活性。     

一氧化氮对猪腔前卵泡颗粒细胞凋亡的影响

本试验旨在研究在培养液中添加不同浓度的NO供体硝普钠(sodium nitro-prusside,SNP)(0、0.001、0.01、0.1、1.0 mmol/L)处理,研究培养4 d后的腔前卵泡颗粒细胞凋亡情况。结果表明,1.0 mmol/L SNP组凋亡率显著高于其他各组(P0.05),而0.001 mmol/L SNP组凋亡率显著低于其他各组(P0.05)。说明高浓度的SNP对猪腔前卵泡颗粒细胞凋亡起促进作用,低浓度的SNP起抑制作用。     

用台盼蓝和荧光染色法评价腔前卵泡的活力

在用显微镜直接观察卵泡形态的基础上，建立了结合台盼蓝染色和hoechst33342荧光染色的一种评价卵泡活力的新方法，可对培养前后的卵泡活力进行准确鉴别，为客观评价培养体系提供科学依据。     

维生素对牛腔前卵泡体外培养的影响

用改良的McCoy’s 5a无血清培养液 (含 3mML -谷氨酰胺、0 1%BSA、2 0ng/ml睾酮、2 5 μg/ml转铁蛋白、10 0ng/ml胰岛素和 4ng/ml硒 ) ,在 96孔培养板中 ,每孔 2 5 0 μl培养液的条件下 ,研究了维生素C和维生素E对腔前卵泡体外发育的影响。结果表明 :在培养液中添加 90 μM的维生素C有利于维持腔前卵泡体外生长时结构的完整性 ,显著提高牛腔前卵泡体外培养 10天的存活率 (P <0 0 5 ) ,但并没有发现对腔前卵泡的生长、发育和成腔有促进作用 (P >0 0 5 ) ;在培养液中添加3 0 μM的维生素E对Φ >13 0 μm的腔前卵泡及其卵母细胞有促进发育和促进卵泡腔形成的趋势 (P >0 0 5 ) ;在培养液中联合添加 12 μM维生素E和 96μM维生素C ,能显著提高牛腔前卵泡体外培养 10天的存活率 (P <0 0 5 ) ,并对牛腔前卵泡的生长和发育有一定的促进作用 ,但差异不显著 (P >0 0 5 )。     

牛卵巢黄体状况与腔前卵泡采集数量的关系

根据牛离体卵巢黄体的不同状况，将31枚卵巢分为5种类型，并采用机构方法分离腔前卵泡，观察不同黄体状况卵巢与腔前卵泡采集数量的关系，结果表明，火山口型，圆锥型和蘑菇型3种大黄体的卵巢腔前卵泡采集量多，扁平片状和表面无黄体型卵巢腔前卵泡采集量较少，具有黄体状况的卵巢初级卵泡（Pm)采集数量多于无黄体类型卵巢，原始卵泡（Pf) 以3种黄体较大的卵巢采集数量最多，次级卵泡（Sc)则以黄体为火山口型卵巢为最多，说明卵巢黄体状况不同，其腔前卵泡采集数量有所不同。     

卵巢大小及发育状况与牛腔前卵泡采集数量的关系

用简单机械分离法处理了 12 7枚成年牛卵巢。结果显示 ,在外观正常的卵巢中 ,腔前卵泡的采集数量与卵巢的大小成正相关关系 ,而有无黄体与腔前卵泡的采集数量无明显关系 ;卵巢上不同大小的可见卵泡的数量和分布与腔前卵泡的采集量有关。卵巢上可见卵泡分布均衡 ,大、中、小卵泡均有分布 ,小卵泡不过多以及无大卵泡 ,但中、小卵泡较多的 ,无论是否有黄体存在 ,均可获得较多腔前卵泡。而卵巢表面脂肪化、卵巢充血、有弥散性片状黄体及幼稚卵巢的 ,则腔前卵泡分离很少或几乎分离不到