加强蚕桑科学研究,为云南蚕桑发展提供科技支撑(续)

4 蚕种质量监测及检验技术研究情况 1988年开始，我省暴发家蚕微粒子病，使农村蚕业生产损失严重，为了控制家蚕微粒子病的发生蔓延，省内蚕种生产、检验部门对检测手段和检验方法进行改进，实施了新的概率计算抽样袋蛾集团镜检，采用了科学实用的集团磨蛾镜检办法，从此结束了延用多年的百分比抽样、单蛾镜检的老办法。 家蚕微粒子病的核心检验方法是母蛾显微镜检查，母蛾显微镜检查自法国著名科学……     

原蚕区微粒子病发生现状及防治措施

微粒子病是家蚕5大传染病之一,也是蚕业生产上唯一被列为检疫对象的蚕病.历史上法国曾因发生微粒子病而使法国蚕业受到毁灭性的打击.微生物学家巴斯德博士研究认定,微粒子病原体经食下和胚种2种途径传染.因此世界上蚕种塑育、普种改平附为袋制,进而原种改袋制为框制,有效地控制了该病的发生.近年来,随着云南省蚕业、蚕种生产的迅猛发展,原蚕区制种的大幅度扩大,微粒子病在一些地区发生和蔓延,而且危害严重.防治微粒子病已成为当务之急,家蚕微粒子病的防治研究被列为国家的攻关项目.     

家蚕微粒子病检验的质量管理

微粒子病检验最常用的手段是光学显微镜检验技术,通过对全面质量管理中影响家蚕微粒子病检验和镜检结果的主要因素和关键环节进行分析和总结,以期进一步提高家蚕微粒子病检验水平和管理能力。     

纳米金比色法在家蚕微孢子虫检测中的应用

家蚕微粒子病被列为蚕种生产的唯一检疫对象,母蛾镜检家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,简称Nb)是目前最主要的检疫手段,但其准确性受到多种因素影响。建立一种简便、快捷、准确的Nb检测技术,对家蚕微粒子病的防治具有重要意义。基于纳米金(AuNPs)比色法原理,对AuNPs探针的制备及其标记的最佳抗体浓度和最佳pH值进行探究,以及探究AuNPs比色法检测Nb的灵敏度。结果表明,Nb抗体与AuNPs(20 nm)结合最佳浓度为每500μL AuNPs溶液中添加5μL 0.5 mg/mL抗体蛋白,标记最佳pH值为8.5。AuNPs比色法能够最低检测出Nb蛋白量为10 ng。本研究成功建立一种基于AuNPs比色法检测Nb的新方法。     

基于GC-MS代谢组学解析阿苯达唑治疗家蚕微粒子病的作用机制

【目的】利用GC-MS代谢组学技术研究阿苯达唑对患微粒子病家蚕血淋巴代谢物的影响,从代谢组学角度阐明阿苯达唑的作用机制,为以阿苯达唑为主剂研发新的家蚕微粒子病治疗药物提供理论依据。【方法】对五龄起蚕接种家蚕微孢子虫（Nosema bombycis,N.b）建立家蚕微粒子病模型,分别于攻毒后12、24、48、72和96 h开始饲喂阿苯达唑混悬液处理桑叶直至上蔟结茧,以未攻毒未给药的家蚕为对照,待化蛹后逐头镜检调查家蚕感染率,以评价阿苯达唑的治疗效果;同时采用GC-MS代谢组学技术进行非靶向代谢组学研究,筛选患微粒子病蚕体血淋巴中的差异代谢物,并通过MetaboAnalyst 4.0进行代谢通路分析。【结果】阿苯达唑对家蚕微粒子病具有显著的治疗效果,药物作用的关键时间是攻毒后24~48 h。与对照组家蚕血淋巴相比,从模型组家蚕血淋巴中共筛选并定性获得47种差异代谢物,其中27种代谢物呈下降趋势、20种代谢物呈上升趋势。对模型组与阿苯达唑给药组的家蚕血淋巴样本进行比较分析,结果发现除木酮糖、D-葡萄糖-6-磷酸、肌醇、泛酸、甲基丁二酸和油酸外,阿苯达唑对多数与家蚕微粒子病相关的代谢物具有干预调节作用。通过MetaboAnalyst 4.0进行通路分析,发现家蚕感染N.b后有6条主要的代谢通路发生明显变化,分别为:①淀粉和蔗糖代谢;②苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成;③苯丙氨酸代谢;④甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢;⑤谷胱甘肽代谢;⑥磷酸肌醇代谢。家蚕添食阿苯达唑混悬液处理桑叶后能有效减轻上述代谢通路的改变,从而促使患微粒子病家蚕处于较正常的生理状态。【结论】阿苯达唑对家蚕微粒子病具有显著的治疗效果,药物作用的关键时间在N.b感染后24~48 h,结合N.b的生活史,可全面揭示阿苯达唑治疗家蚕微粒子病的作用机制,即阿苯达唑通过抑制N.b在蚕体内的裂殖体增殖,有效降低N.b感染对家蚕氨基酸代谢和能量代谢的破坏作用,维持家蚕的正常生理状态,而达到治疗效果。     

健全防控家蚕微粒子病制度——提高防治效果

养蚕行业一直在农业发展中占据着非常重要的地位,为了推动养蚕行业的经济效益提高,要对养蚕过程中可能遇到的病虫害进行重点的防治和治理,在养蚕的过程中,家蚕微粒子病在桑蚕良种繁育的过程中有非常巨大的影响,要做好家蚕微粒子病的综合防治,要在预防的基础上综合控制防御的工作,创新微粒子病的防御措施,本文介绍了集中家蚕微粒子病的防御制度,提高蚕种的防治效果。     

家蚕母蛾微粒子病病毒率计算的程序设计

一、引言家蚕微粒子病是对蚕桑生产影响极大的一种病害,轻则降低养蚕收入,重则全部失收。因此,对家蚕微粒子病加以严格控制就显得非常重要。目前要求把微粒子病的病毒率控制在0.5％以内,就是说如果家蚕母蛾的病蛾率(即微粒子病病毒率)小于0.5％,则该批蚕种为合格蚕种。否则为不合格蚕种。但由于制种批很大,一般采用抽样检查方法。在抽     

基于环境控制的家蚕微粒子病防控措施

桑园野外昆虫微孢子虫的交叉感染已成为当前家蚕微粒子病发生的主要原因,结合多年的实践经验,从养蚕环境净化入手,提出了生产环境净化、桑叶全程洗消、桑园病虫害的控制等一系列实用技术措施,以期达到控制家蚕微粒子病传染和交叉感染,减少家蚕微粒子病的发生。     

模拟感染家蚕微粒子病的PCR分子诊断技术研究（11）

家蚕微粒子病病原为桑蚕微孢子虫(Nosema bombycis Nageli, N.b)。本文根据文献报道,选用了一对根据N.b孢子及其相近种属微孢子虫的SSU-rRNA保守区段设计的有效引物VIF/530R,从模拟感染不同浓度N.b孢子(3×101-7/ml)的蚕蛾、蚕卵的角度,较系统地研究了PCR诊断技术的可检测灵敏度和对模拟感染家蚕微粒子病的诊断效果,为PCR分子诊断家蚕微粒子病的实用化研究提供参考。在本实验的DNA制备方法和PCR反应条件下,分别对由不同浓度N.b纯孢子抽提的DNA模板和不同浓度N.b纯孢子(3×101～7ml-1)分别与蚕卵、蚕蛾混合抽提的DNA模板进行PCR扩增检测。结果表明:(1)对N.b纯孢子DNA模板,PCR可检测灵敏度为3×104N.bml-1(弱检测信号可到3102～3N.bml-1),对模拟染毒N.b孢子的蚕蛾DNA模板,PCR可检测灵敏度为3×105N.bml-1,两者分别已超过或达到目前生产上用显微镜的检毒水平;(2)对模拟染毒N.b孢子的蚕卵DNA模板,VIF/530R引物不能有效地检出蚕卵中染毒的N.b孢子DNA信号,推测在蚕卵DNA抽提物里可能含有抑制PCR扩增的未明因素,而蚕蛾DNA抽提物里则无此抑制因素。     

常用家蚕原种对家蚕微粒子的胚传特性分析

家蚕微粒子病是一种危害性极大的传染性疫病,是蚕业生产上唯一的法定检疫对象.不同家蚕原种对家蚕微粒子的胚传特征分析可为家蚕微粒子病的综合防控提供理论支撑.为了充分了解现有主要实用家蚕原种对家蚕微粒子(Nosema bombycis)感染抗性的差异,本研究利用流行病学和统计学方法选择产业中近30年主要分布于四川、重庆、江苏、广西及云南常用的8个高产优质亲本品种(871、 872、芙蓉932、湘753、菁松B×A、皓月B×A、苏菊和云7),分别测定其对家蚕微粒子的抗性,并分析了不同品种对家蚕微粒子的胚传规律.经研究发现8个现有生产中常用品种对微粒子抗性明显不同,当母蛾带毒程度100时,云7的子代感染率与感染强度分别为54.4%和82,均为最低;相对于易感原种871,其子代感染率提高了21.2%,子代感染强度数值提高了34,子代感染率和感染强度的差异均十分明显;同一原种感染程度不同的母蛾胚传存在差异,一般胚传带毒与母蛾带毒呈正相关,表明母蛾带毒程度是影响子代感染率和感染强度变化的主要因素.通过掌握母蛾感染程度与胚传带毒之间的规律,可为原种间抗性差异的研究提供参考,并对家蚕微粒子防控具有重要意义.     

壮蚕感染微孢子虫与蛾期毒率的关系

采用口腔微量注射接种法,研究了壮蚕(4～5龄)感染微孢子虫与蛾期微粒子病显微镜判别的关系.结果表明:在一定范围内,显微镜检别出微粒子病的时期随微孢子虫接种剂量的增大而提早,造成蚕蛾镜检有毒的壮蚕感染微孢子虫的下限剂量为32～64个/条,其下限感染剂量在不同发育阶段的蚕之间存在一定差异.本试验结果对于当前蚕种生产上微粒子病的防治工作有积极指导意义.     

应用（60）Co-γ射线辐射治疗家蚕微粒子病研究

[目的]探索防治家蚕微粒子病的新方法。[方法]利用60Co-γ射线辐射处理微孢子虫、感病家蚕幼虫和蛹及带毒蚕卵,研究60Co-γ射线辐射对家蚕和微孢子虫作用的差异及其对家蚕微粒子病的治疗效果。[结果]以20-160 Gy剂量辐射,不能杀死微粒子,不能去除感病蚕体的微孢子虫。感病家蚕幼虫体重随辐射剂量的增加而降低,感病蚕的死亡率在80 Gy以上处理时有明显增加的趋势。随辐射剂量的增加,辐射处理卵的孵化率降低,孵化蚕的带毒率也有一定程度的降低,孵化蚕和未孵化蚕总的带毒率降低;20-160 Gy小剂量辐射,不能去除蚕蛹体内的微孢子虫。随辐射剂量的增加,蚕蛹羽化率、母蛾带毒率、卵带毒率和雄蛾交配能力逐步降低,但20 Gy辐射处理的蛹羽化率高于对照和其他处理。[结论]低剂量60Co-γ射线辐射对家蚕卵具有一定的除毒效果。     

家蚕原种母蛾微粒子病集团检验比较研究

通过超几何分布、二项分布、f二项分布、泊松分布等不同概率计算方法，根据数理统计和检验原理分析家蚕原种母蛾微粒子病集团检验存在的误差。结果表明，由于检验系统误差的存在，设置原种集团母蛾全数检验的质量接收（拒收）限时应更多地考虑系统误差对蚕业生产的影响，且现行标准以批病蛾率作为检验接收（拒收）质量限有待商榷。准确原种病蛾率的计算应考虑对有毒集团中出现多个病蛾的情况进行修正，用实际检验母蛾数进行计算；在不考虑缺蛾影响时，用检验无病蛾集团出现概率作为合格标准的判断方法亦可行。     

蚕蛾鳞毛和蛾尿的微孢子虫感染及其传染性

调查研究了家蚕微孢子；Ｎｏｓｅｍｅｂｏｍｂｇｃｉｓ）感染蚕蛾鳞毛和蛾尿中微孢子虫存在状况及对家蚕的传染性。结果表明被微孢子虫感染的蚕蛾，它的鳞毛和蛾尿中寄生和存在形态、大小、折光性均无异的微孢子虫孢子，对家蚕幼虫均具有较强的致病性，对健康蚕蛾具有较大的污染性，其致病性和污染性大小与蚕蛾患病程度强弱呈平行关系，这一结果可作为蚕种生产上对蚕蛾鳞毛和蛾尿的控制与消毒的依据。     

温度对家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）孢子体外发芽的影响

【目的】调查温度对家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）孢子体外发芽的影响,为家蚕微粒子病的防治及其他微孢子虫的基础研究提供参考依据。【方法】以K2CO3-KHCO3法诱导孢子体外发芽,在孢子发芽过程中利用不同温度（5、15、25和35℃）在不同时期处理家蚕微孢子虫孢子,观察不同处理的孢子发芽率。【结果】在前期4个温度处理的家蚕微孢子虫孢子发芽率分别为3.88%、15.66%、31.91%和58.75%,孢子发芽率随着温度的升高而增大;在刺激期4个温度处理的孢子发芽率依次为53.33%、38.17%、25.07%和6.08%,孢子发芽率随着温度的升高而减小;在培育期4个温度处理的孢子发芽率分别是44.63%、41.29%、43.53%和48.82%,无显著差异。【结论】温度对家蚕微孢子虫孢子体外发芽具有一定的影响,在家蚕微孢子虫孢子体外发芽过程中,前期低温和刺激期高温能抑制孢子发芽,而前期高温和刺激期低温能促进孢子发芽。     

温度对家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）

【目的】调查温度对家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）孢子体外发芽的影响,为家蚕微粒子病的防治及其他微孢子虫的基础研究提供参考依据。【方法】以K2CO3-KHCO3法诱导孢子体外发芽,在孢子发芽过程中利用不同温度（5、15、25和35℃）在不同时期处理家蚕微孢子虫孢子,观察不同处理的孢子发芽率。【结果】在前期4个温度处理的家蚕微孢子虫孢子发芽率分别为3.88%、15.66%、31.91%和58.75%,孢子发芽率随着温度的升高而增大;在刺激期4个温度处理的孢子发芽率依次为53.33%、38.17%、25.07%和6.08%,孢子发芽率随着温度的升高而减小;在培育期4个温度处理的孢子发芽率分别是44.63%、41.29%、43.53%和48.82%,无显著差异。【结论】温度对家蚕微孢子虫孢子体外发芽具有一定的影响,在家蚕微孢子虫孢子体外发芽过程中,前期低温和刺激期高温能抑制孢子发芽,而前期高温和刺激期低温能促进孢子发芽。     

家蚕病原性微孢子虫多样性调查分析

[目的]从分布、感染性和分类特征三方面调查家蚕病原性微孢子虫多样性,为蚕业生产上有效防控家蚕微粒子病提供参考依据.[方法]跟踪蚕种生产微粒子病检疫数据及抽样检验家蚕受微孢子虫感染的情况,调查家蚕病原性微孢子虫的分布;通过测定微孢子虫对家蚕的半数感染浓度(IC50)和胚种传染率及检验带毒蚕种的微粒子病胚种传染率,调查家蚕病原性微孢子虫的感染性;基于微孢子虫SSU rRNA序列构建家蚕病原性微孢子虫系统发育进化树及进行相似性和遗传距离分析,调查家蚕病原性微孢子虫的分类特征.[结果]不同时间和不同蚕区生产饲养的广西家蚕均存在一定量的微孢子虫感染,蚕种微粒子病发生率(毒率)呈波动起伏态势.GXM3、GXM4、GXM5、GXM6、GXM7、GXM8、GXM9、GXM10、GXM11、GXM12和GXM13等11株异型微孢子虫对家蚕均具有较强食下传染力,大部分异型微孢子虫对家蚕的IC50与N.b同一级别;各种微孢子虫对家蚕的胚种传染力存在明显差异,N.b的胚种传染率达51.67%,其他异型微孢子虫均比N.b低,部分异型微孢子虫(GXM6和GXM13)对家蚕无胚种传染力.GXM3、GXM4、GXM5、GXM6、GXM7、GXM8、GXM9和GXM11等8株异型微孢子虫均位于Nosema属的类群分支上,除GXM7与GXM9、GXM3与GXM5间存在较低分化度和较高相似度外,其他微孢子虫间的分化度和相似度均存在明显差异.[结论]广西蚕区家蚕病原性微孢子虫分布广泛,种类繁多,且各种微孢子虫的感染力存在明显差异,即广西家蚕病原性微孢子虫存在丰富的种类多样性.     

一株从家蚕体内分离获得的微孢子虫GXM2的生物学特性

[目的]研究一株从家蚕体内分离获得的新微孢子虫(GXM2)的致病性和生物学特征,为全面防控家蚕微粒子病提供参考依据.[方法]观察GXM2添食感染家蚕的病症,以半数感染浓度(IC50)法测定GXM2对家蚕的食下感染力,镜检调查GXM2的胚种传染率,并利用光学显微镜透射电子显微镜观察GXM2孢子的形态、血清学反应、生活史及内部结构.[结果]GXM2感染蚕体病症为:发病急,病程短(6~9 d),出现不蜕皮或半蜕皮症状,类似生理性病害.GXM2对家蚕(蚁蚕)的IC50为2.76×105个孢子/mL,是家蚕微孢子虫(N.b)的4.8倍;对家蚕的胚种传染率为1.19%.GXM2呈卵圆形,大小为(2.49±0.10) μm×(4.19±0.15)μm.GXM2孢子在N.b免疫抗体血清中未能发生凝聚反应,其生活史中发现单核和双核并存,均以二分裂方式增殖,最后形成单核、双核两种成熟孢子;GXM2孢子的极丝有9~11圈,与N.b孢子内部结构有明显差异.[结论]GXM2对家蚕具有较强的致病性和危害性,与N.b异属异种,即要求进行蚕种母蛾微粒子病检疫时应采取分类检验处理技术,进一步完善广西家蚕微粒子病防治技术体系.     

常用消毒药剂对不同存在状态微孢子虫孢子的消毒效果

研究了甲醛制剂（福尔马林液）和含氯制剂（漂白粉液）对蚕粪、地表层土、蚕体、蛹体、蛾体内微孢子虫（Nosema bombycis）孢子的消毒效果。结果表明福尔马林液的消毒效果明显优于漂白粉液的消毒效果。但是在养蚕生产常规消毒条件下,两种消毒药剂对蚕体、蛹体、蛾体、深处土层、蚕粪(除福尔马林液外)中微孢子虫孢子均没有彻底的消毒效果。