体细胞核移植技术在猪基因修饰中的应用

基因修饰猪作为一种理想的动物模型已应用于生物医学研究。构建基因修饰猪的方法很多,包括原核注射、慢病毒转染、精子介导和体细胞核移植等,其中体细胞核移植具有显著优势,一直是构建基因修饰猪的重要方法。近几年,随着转座子、设计核酸酶等基因修饰新技术以及诱导性多能干细胞研究的不断进展,将进一步凸显体细胞核移植技术在基因修饰猪构建中的价值。本文比较了猪基因修饰的主要方法,并论述体细胞核移植技术在猪基因修饰中的优势、发展历程和最新应用等。     

牛去透明带卵体细胞核移植技术的应用研究

本研究通过进一步完善和简化“去透明带双半卵体细胞克隆牛技术”，探讨了生产应用的可能性。结果表明：(1)在卵母细胞体外成熟发育的特定阶段(17～20h间)采用分期分批显微盲吸法去核，去核率可高达95％以上；(2)一次同时将2枚去核后的半卵和1枚供核体细胞粘合在一起，可大大提高电击融合效率；(3)克隆重构胚在DMAP中激活时间从4h延长至16h仍有较高的卵裂率和囊胚率；(4)利用OPS法玻璃化冷冻保存牛体细胞克隆胚胎，解冻后胚胎可用率极显著地高于常规慢速冷冻法；(5)利用改进后的体细胞核移植程序工厂化批量生产牛体细胞克隆胚胎，获得88．2％(2575／2920)卵裂率、41．6％(1215／2920)囊胚率、75．4％(916／1215)冻胚率，冷冻胚胎移植后30d妊娠率为28．1％(48／171)。结果说明，本研究的牛去透明带双半卵体细胞核移植技术已可达到克隆胚胎批量生产应用的水平。     

化学去核卵母细胞为受体的小鼠体细胞核移植

卵母细胞的化学去核是采用干扰染色体分离或纺锤体正常功能的化学试剂,使其所有染色质通过纺锤丝牢固结合,并借助极体排出的惯性将所有染色质全部带出胞外,达到去核目的。目前以化学去核处理的MⅡ期卵母细胞为受体,已获得克隆小鼠。然而,第一次减数分裂期的小鼠卵母细胞经化学去核后,进行核移植还未见报道。与传统的机械去核相比,该方法对卵母细胞无机械损伤,完全是极体的自然排放;同时细胞质及其中核重编程相关因子损失量小;而且高效、省时,程序简单,所得的卵胞质或许更适合于供体细胞核的重编程。剪取超排小鼠的卵巢,以注射器刺破有腔卵泡后获得卵母细胞和卵丘细胞复合体,进行体外成熟培养。成熟培养5 h后去除卵丘细胞,挑选生发泡破裂的细胞顺序移入含脱羰秋水仙碱(DC,0.4μg/mL,2 h)和DC(0.4μg/L) 放线菌酮(CHX,50μg/mL)的M16培养液中继续培养,直到第一极体排出。去核卵胞质与胎儿成纤维细胞用植物凝集素(PHA,200μg/mL)粘合后,转入电击槽;施加1个5 V/mm、3μs交流电脉冲和2个92 V/mm、70μs直流电脉冲进行电融合。3 h后,以SrCl2激活6h,于四孔培养皿中制作的“孔中孔”(well of well)体外培养重构胚。试验重复3次,共计698个卵母细胞,获得的重构胚融合率和激活率分别为84.8%和93.6%;胚胎2-细胞发育率为24.7%,4-细胞率为6.74%;2-细胞期克隆胚移植假孕受体后,没有获得怀孕受体。试验分别以“血清饥饿”胎儿成纤维细胞、新鲜细胞和冷冻保存细胞为供体作核移植,结果表明,冷冻保存细胞的融合率(69.3%)与其余两组(80.6%和84.8%)呈显著差异(P<0.05);激活率、2-细胞和4-细胞发育率,则三组间差异不显著(P>0.05)。本研究将化学去核与无透明带技术相结合,完全丢弃了传统核移植的显微操作及其繁琐程序,属手工克隆,它的成功将会大大简化核移植程序,同时提高了核移植的生产力,最终提高核移植总效率。     

猪体细胞克隆技术的优化

摘要: 用体细胞核移植方法生产的克隆猪诞生至今已经8年,虽然同胚胎细胞核移植相比,体细胞核移植技术难度大,成功率低（1~2%）,但近年来用体细胞核移植技术克隆猪有了较深入的研究,在体细胞核移植基本机理和关键技术上取得了一定的进展。本文结合本实验室近年来的相关研究工作,综述了用核移植方法生产体细胞克隆猪的技术关键和难点及应用情况,并对提高猪体细胞核移植效率的策略进行了分析。     

不同融合条件对水牛体细胞核移植效果的影响

本研究主要探讨水牛体细胞核移植电融合的影响因素,以摸索出适合水牛体细胞核移植的电融合条件。结果显示:直流脉冲前施加2 .0 V交流电波能显著提高Φ<1 5 μm供体细胞的融合率及胚胎的卵裂率( P<0 .0 5 ) ,但对其存活率和囊胚率以及2 0 μm<Φ<3 0 μm供体细胞的融合率、胚胎的存活率、卵裂率及随后的囊胚发育率无显著影响( P>0 .0 5 ) ;然而无论施加交流电与否,直径2 0～3 0 μm供体细胞的囊胚率均显著高于直径小于1 5 μm供体细胞的囊胚率( P<0 .0 5 )。注核操作液中添加聚乙烯醇( PVA)对重组胚的融合率和卵裂率没有显著影响( P>0 .0 5 ) ,但激活后重组胚的存活率( 95 .83 %)及囊胚发育率( 1 1 .3 2 %)显著高于对照组的重组胚存活率( 74.77%)和囊胚率( 3 .75 %,P<0 .0 5 )。结果表明:( 1 )直流脉冲前施加2 .0 V交流电波能提高直径较小供体细胞的融合效果;( 2 )注核操作液中添加0 .1 %聚乙烯醇有利于提高水牛体细胞核移植的效果     

猪体细胞核移植重构胚发育异常及印迹基因表达特征研究的进展

由于猪的器官极可能成为人类未来器官的供应源,猪体细胞核移殖及转基因等方面的研究已成为全球的热点。近几年来,猪体细胞核移植研究取得了一定的进展,但总体来看核移植效率还很低(1%~2%),还需要不断完善核移植程序及对一些基础问题的深入研究。本文主要对猪体细胞核移植重构胚发育异常及“印迹”基因表达特征作一综述与分析,旨在为研究者提供一些有益的启示。     

猪胚胎卵裂球的细胞核移植

以湖北白猪卵母细胞为核移植受体，杜洛克胚胎卵裂球为核移植供体，进行了猪胚胎细胞核移植的研究，建立了核移植的程序，卵母细胞的电激活实验表明猪卵母细胞的激活以1.25kV/cm、40μs脉冲为最佳；2－细胞期胚胎电融合实验表明脉冲时间40μs。1.5-2.0kV/cm脉冲的融合效果较好，卵母细胞体外成熟时间对核移植效率有显著影响，42－48h成熟卵做受体核移植效果较好。61枚核移植的重组胚胎移植给5头受体，1头维持妊娠至足月，顺利产下5只核移植猪.训对核移植效率的影响因素和猪核移植的前景进行了分析。     

黄牛体细胞核移植初步研究

对牛体细胞核移植的有关影响因素进行了系统研究,结果表明,电场强度为100v／mm,电脉冲2次,脉冲时间为10μs的融合率显著高于30μs的融合率,囊胚发育率差异不显著;在耳部成纤维细胞的注核微滴中添加7％乙醇可提高重组胚的卵裂率,供体细胞的预激活可提高核移植效果;TⅠ期(第二次减数分裂末期)去核卵母细胞核移植总囊胚率低于MⅠ期(第二次减数分裂中期)去核卵母细胞的,TⅠ期去核卵母细胞的核移植效果不如MⅠ期去核卵母细胞的;成纤维细胞直接注射后3h用离子霉素(5μmol／L,5min)和6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP,2mmol／L,3h)激活处理的重组胚发育率显著高于注核后0h和6h激活的重组胚,供体细胞核与受体卵母细胞激活前的胞质因子互作一段时间,有利于核移植胚胎的早期发育。     

猪 前 体 脂 肪 细 胞 的 原 代 培 养

建立猪前体脂肪细胞原代培养方法，研究猪脂肪组织增生的生物学特征。选用出生7d的仔猪脂肪组织，采用原代消化细胞培养法培养出棱形细胞，该细胞成分均一、生长旺盛和充脂率高。经形态学动态变化观察、MTT比色法、生长曲线及油红O染色提取法测定，证明是功能活跃的前体脂肪细胞，并在体外重现了其增殖的全过程。     

供体细胞处理方法对水牛核移植效果的影响

本研究探讨了水牛供体细胞不同培养处理方法对细胞周期及其核移植效果的影响。流式细胞仪分析供体细胞周期的结果显示,水牛胎儿耳皮成纤维细胞或颗粒细胞,在增长期、汇合长满期或经血清饥饿培养或0.1μg/mL蚜栖菌素(APD) 0.5%胎牛血清(FBS)培养处理后,G0 G1期细胞比率差异显著(P<0.05),其中以0.1μg/mL APD 0.5?S培养处理的G0 G1期细胞比率最高(87.89%和89.04%);而增长期的G 2 M期的细胞比率以及汇合长满期的S期细胞比率明显高于其他三组,但经血清饥饿处理后,DNA碎片明显高于其他三组(P<0.05)。当分别以0.1μg/mL APD 0.5?S培养处理后的水牛胎儿耳皮成纤维细胞或颗粒细胞作供核时,重组胚的卵裂率及囊胚发育率,均显著高于血清饥饿处理或汇合长满期的同种供体细胞(成纤维细胞:70.14%vs 58.29%和55.90%,21.33%vs 10.55%和8.72%;颗粒细胞:74.35%vs 60.51%和57.61%,22.17%vs10.26%和9.78%,P<0.05),但汇合长满期或血清饥饿处理的供体细胞构建的重组胚,其卵裂率和囊胚率均没有显著差异(P>0.05)。将经APD处理后的供体细胞构建核移植胚胎,移植给受体水牛后有1头受体水牛妊娠并成功的产下后代。以上结果表明:0.1μg/mL APD 0.5?S预培养处理供体细胞,能有效的抑制细胞停留在G0/G1期,并能提高其核移植胚胎的发育率,而且已成功的获得后代。但在本培养系统中,血清饥饿处理供核细胞是没有必要的。     

供体细胞种类对牛核移植效果的影响

供体细胞种类对牛卵母细胞核移植效果影响的研究结果表明,颗粒细胞的核移植效果与成年牛成纤维细胞无显著差异(19.8%vs 17.3%,P>0.05);胎牛成纤维细胞核移植囊胚发育率高于成年牛成纤维细胞(24.2%vs 14.0%,P<0.05);血清饥饿处理的胎牛成纤维细胞(休眠细胞)与高血清培养(非休眠细胞)的胎牛成纤维细胞核移植效果差异不显著(18.8%vs 18.6%,P>0.05),表明胎牛成纤维细胞血清饥饿处理没有必要。     

水牛体细胞核移植相关影响因素的研究

主要是探讨水牛卵母细胞的体外成熟与供体的年龄和性别对其核移植效果的影响。体外成熟培养22～24h的水牛卵母细胞,在含有5μg／mL细胞松弛素的操作液中进行去核,然后将经0．1μg／mL蚜栖菌素（Aphidicolin,APD）培养处理24h,再用0．5％胎牛血清（FBS）培养2d的水牛耳皮成纤维细胞注射到去核的卵母细胞卵周隙中,再经电融合形成重构胚。重构胚经5μmol／L离子霉素激活处理5min并在2mmol／L的二甲氨基嘌呤（6-DMAP）中培养3h后,在含有颗粒细胞单层细胞的微滴中（30μL）培养7d,观察其卵裂和胚胎发育情况。结果显示：在添加有10ng／mL上皮生长因子（EGF）成熟液中培养的受体水牛卵母细胞的融合率和重组胚卵裂率与对照组无显著差异（P〉0．05）,但其囊胚发育率明显高于对照组（18．53％vs．7．56％,P〈0．05）。来自胎儿（3个月）或成年（一头5～6岁,另一头22岁）水牛的耳皮成纤维细胞核移植后重组胚的卵裂率差异不显著（P〉0．05）,但水牛胎儿体细胞构建的重组胚囊胚率显著高于成年体细胞（22．55％vs．10．77％和8．09％,P〈0．05）。雌性水牛成纤维细胞构建的重组胚的囊胚发育率（20．23％）显著高于雄性水牛体细胞的囊胚率（10．16％,P〈0．05）。以上结果表明：（1）成熟液中添加EGF能提高受体卵母细胞核移植后的胚胎发育率;（2）水牛体细胞核移植效果受供体的个体年龄和性别的影响：胎儿成纤维细胞的核移植效果优于成年的成纤维细胞,而且以雌性的效果较好。     

不同受体胞质对牛体细胞核移植效果的影响

通过研究不同受体胞质对核移植效果的影响,结果发现:部分体外成熟16~18 h的牛卵母细胞,其细胞核已完成成熟,胞质可直接用于核移植而不需进行激活处理,直接进行核移植囊胚率达7.7%;体外成熟培养(IVM)30 h的TⅡ期受体胞质较IVM 20~22 h激活的TⅡ期胞质核移植效果差,不适宜作受体胞质;MⅡ期胞质核移植效果优于TⅡ期胞质,两组囊胚率分别为11.7%和5.2%(P<0.05)。     

5头经玻璃化冷冻保存后移植的成年体细胞克隆牛降生

2003年7月19日，经过剖腹产．一头体重60kg的足月体细胞克隆牛在青岛平度降生。随后,在7月22日至10月26日之间又产下4头足月克隆牛犊。5头均为活产。这是世界上首次报道利用“去透明带双半卵融合技术”获得的成年体细胞克隆牛，也是我国首次成功获得经过玻璃化冷冻保存后的胚胎移植产下的体细胞克隆牛。这是广西大学动物繁殖研究所与加拿大国际新技术发展集团开展国际问科研与产业开发合作的结晶,也是继1995年7月广西大学(原广西农业大学)与华南师范大学合作成功获得我国首例胚胎细胞克隆牛后，广西大学取得的又一个成果。这群成年体细胞克隆牛是采用较独特的“去透明带双半卵融合技术”克隆生产的(方法详见谭世俭等，广西农业生物科学,2003，22(3)：201～206)。体外成熟的牛卵母细胞经显微盲吸法去核及去除透明带(简称为半卵)。供核体细胞取自加拿大一头18月龄高产奶牛的耳皮下成纤维细胞。电融合前，将两枚半卵和一枚供体细胞用植物凝集素按细胞纵轴水平粘合在一起，经AC电场使细胞排序，再施于单次DC电脉冲诱导3细胞融合。重构胚采用微穴法体外培养。7～8d的克隆囊胚采用玻璃微管法玻璃化冷冻保存(谭世俭等，广西农业生物科学，2002，21(1)：1～7)。结果在批量生产的条件下，卵母细胞去核率达96．2％(301／313，N=4)，电融合率为95．7％(3678／3842，N=36)，卵裂率87．2％(3180／3645)、囊胚率42．2％(1540／3645)，冻胚率31．4％(1145／3645)。经玻璃化冷冻保存的胚胎于2002年l0月至2003年1月间分23个批次进行移植。胚胎移植30d后用超声波仪检查，确诊48头妊娠，受胎率为28．1％(48／171)。出生的5头克隆牛犊中，除1头自然分娩(2003年10月12日生)的牛犊健康存活至今(2个半月)外，其余4头在母牛发生难产时行剖腹产术取出的克隆牛犊有3头在产后不到1h内即先后夭折；另1头存活了5d。     

荧光染色及紫外照射(UV)对黄牛孤雌和克隆胚胎早期发育的影响

探讨荧光染色及紫外照射对牛孤雌和克隆胚胎体外发育的影响。结果发现，1／4倍UV照射20、30、40S的卵母细胞孤雌激活后囊胚发育率都极显著低于UV照射0S和10s组；以1、1／4、1／8、1／32倍的UV强度照射黄牛卵母细胞20S，其中1／4倍UV照射组的分裂率与1／8、1／32倍UV照射组无显著差异，但囊胚率间差异显著。以1倍UV强度照射组的分裂率与囊胚率均显著低于1／8、1／32倍UV强度照射组；观察培养24h后原核形成情况，发现1倍UV强度照射组原核形成也显著滞后于其它处理组；比较1、1／8倍UV强度照射引导去核胞质构建的重组胚体外早期发育情况，发现1倍UV强度照射引导去核胞质重组胚的卵裂率及囊胚率极显著低于1／8倍UV照射强度引导去核胞质组。以上结果表明：1／4倍UV强度照射黄牛卵母细胞时间大于20s，显著降低其孤雌激活后的卵裂和体外发育潜力；1、1／4倍UV照射强度可阻滞原核形成，降低UV照射强度可提高胚胎孤雌发育率；1／8倍UV照射强度可用于引导去核操作。     

不同来源的供体细胞对水牛体细胞核移植效果的影响

采用电融合方法,探讨不同来源的供体细胞对水牛核移植效果的影响。体外成熟培养22～24h的水牛卵母细胞,在含有5μg/mL细胞松弛素B的操作液中进行去核,然后将经0.1μg/mLAphidicolin(APD)+0.5%FBS培养2～9d的水牛不同来源的供体细胞,注射到去核的卵母细胞卵周隙中,电融合形成重构胚。重构胚经5μmol/L离子霉素激活处理5min,并在2mmol/L的6-DMAP中培养3h后,在含有颗粒细胞单层细胞的微滴中培养7～9d,观察其卵裂和胚胎发育情况。结果发现,来自水牛胎儿耳部或腹部组织块的成纤维细胞用作供体细胞,其重组胚的融合率及体外发育能力差异不显著(P>0.05),且细胞培养方法(组织块法或酶消化法)对其核移植效果没有影响;来自编号011010的胎儿耳皮成纤维细胞重组胚的囊胚发育率显著高于来自编号030323和030410细胞(31.45%vs10.96%和14.49%,P<0.05),但它们的融合率、卵裂率无显著差异(P>0.05)。以上结果表明:经不同培养方法培养的细胞或来自身体不同部位的组织的成纤维细胞均可作为核移植研究的供体细胞,但是水牛体细胞核移植效果受供体的个体差异的影响。     

猪核移植供体细胞的分离培养及传代的研究

通过对猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离、培养和传代的研究,摸索出一套猪体细胞的分离、培养和传代的方法,建立了猪的供体细胞系。研究结果表明:猪的卵丘细胞单层的生长需要5~6 d;运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞,组织块法单层的生长需要10~11 d,酶消化法需要8~9 d。猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞均可以建立并获得稳定的细胞系,这些供体细胞培养方法的应用可为猪体细胞核移植研究提供丰富的供体细胞材料来源。