牛磺酸对牛体外受精早期胚胎发育的影响

研究了牛体外受精后早期胚胎体外发育时向其基础培养液中加入牛磺酸对胚胎桑椹胚率、囊胚率和孵化囊胚率的影响.试验1:以TCM-199 10?S为基础培养液(对照组),再加入7、14 mmol/L的牛磺酸(试验组),试验组与对照组的桑椹胚率分别为48.1%、47.4%和43.2%;囊胚率分别为26.4%、22.3%和21.0%;孵化囊胚率分别为21.8%、18.7%和0.试验2:IVF后2细胞、4～8细胞及8～16细胞期,在基础培养液中分别添加7 mmol/L的牛磺酸时,桑椹胚率分别为48.7%、57.1%和52.0%,囊胚率分别为25.1%、30.7%和27.9%,孵化囊胚率分别为25.9%、28.6%和25.0%;而添加14 mmol/L牛磺酸时,桑椹胚率分别为50.4%、56.4%和55.4%,囊胚率分别为26.5%、31.3%和27.7%,孵化囊胚率分别为27.5%、31.1%和29.9%.结果表明,体外发育培养液中添加7 mmol/L牛磺酸可显著提高桑椹胚率和囊胚率(P＜0.05),并且在4～8细胞期添加14 mmol/L牛磺酸最为合适.     

β-巯基乙醇对猪卵母细胞体外受精及胚胎发育的影响

实验探讨了成熟液中添加β-巯基乙醇对猪卵母细胞体外受精和孤雌激活后早期发育的影响,以优化猪早期胚胎体外生产体系。结果发现:成熟液中添加低浓度β-巯基乙醇对猪卵母细胞体外受精和孤雌激活后胚胎的早期发育无明显促进作用,添加浓度过高(≥250μmol/L)反而不利于猪胚胎的早期发育。     

不同共培养体细胞和胎牛血清浓度对牛体外受精后早期胚胎的影响

利用屠宰黄牛的卵母细胞经体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)后的早期胚胎,与单层颗粒细胞(GC)、输卵管上皮细胞(BOEC)等体细胞共培养及在胎牛血清的胚胎培养液中的后续发育进行了研究,并探讨了其影响因素,以期筛选出最佳的体外培养条件。结果表明:使用GC和BOEC体外共培养牛体外受精后胚胎,均取得了较好的囊胚发育率;且牛体外受精后早期胚胎体外培养体系中,添加10%血清能有效地促进牛体外受精后胚胎的囊胚率。     

不同培养体系对牛体外受精早期胚胎发育的影响

为探讨体外受精早期胚胎的最佳体外培养体系,将从屠宰牛卵巢上获取的卵母细胞进行体外成熟培养、体外受精后获取的早期胚胎,分别用TCM199和mSOFaa与牛卵泡颗粒细胞和牛输卵管上皮细胞进行共培养。结果表明：TCM199和mSOFaa均能使体外受精胚胎突破8～16细胞期的发育阻断,但是囊胚发育率仅为14.3%和15.5%,差异不显著;胚胎与牛卵泡颗粒细胞和牛输卵管上皮细胞进行共培养能够使胚胎的囊胚发育率达到30.2%和33.5%,差异不显著。     

由牛体外受精胚胎分离胚胎干细胞

以DMEM＋15％NBS＋0．1mmol/Lβ－巯基乙醇＋0．01μmol/L亚硒酸钠＋10μg/L LIF＋10μg/L IGF－1作为培养液，以原代小鼠胎儿成纤维细胞为饲养层，利用8日龄牛体外受精胚胎获得了传3代的牛类胚胎干细胞（类ES细胞）。通过体外分析试验，对所得类ES细胞的多能性进行了鉴定。结果在培养2d后，牛类ES细胞分化形成了类似于扩张囊胚的结构，悬浮于培养液中。     

牛体外受精胚胎衍生干细胞能力影响因素的研究

以牛卵巢卵母细胞体外受精获取囊胚期胚胎，比较体外受精牛胚胎不同获取内细胞团的方法和不同培养液对体外培养胚胎干细胞能力的影响。结果表明，囊胚期胚胎不除去透明带而直接培养产生胚胎干细胞，初次克隆率为55％；胰酶法去透明带分离的内细胞团（ICM）培养产生胚胎干细胞，初次克隆率为90％。免疫外科法去透明带分离的ICM在4种不同的培养液中，初次克隆率分别为16．4％、11．5％、21．8％、18．2％，但是其分离的ICM经传代后形成的衍生细胞不易发生分化，经过4～6代的传代，仍然保持其完整的形态，说明免疫外科法是一种理想的牛ICM分离法，培养液为D20＋LIF（40ng／mL）可用于牛胚胎干细胞培养。     

牛体外受精胚胎细胞核移植的实验研究

将采自肉联厂屠宰车间的牛卵巢中的卵母细胞置于ＴＣＭ－１９９＋１０％ＥＣＳ（０ｄ）＋ＦＳＨ（１万ＩＵ／Ｌ）＋ＬＨ（５ｍｇ／Ｌ）中培养成熟，用含０．３％透明质酸酶的消化液将卵母细胞周围的卵丘细胞去掉，并以７．５ｍｇ／Ｌ的ＣＢ液处理后，用微吸管吸去透明带内的第一极体及极体下面的部分卵母细胞质，然后将经体外受精并发育至８～１６细胞期胚胎的卵裂球注入去核卵母细胞的卵周隙中，再将移核胚置于电融合槽内进行融合（电场强度为１２００Ｖ／ｃｍ，持续时间为８０μｓ，１次脉冲刺激）。将融合的胚胎移入生长有单层贴壁颗粒细胞的发育培养液（ＴＣＭ－１９９＋１０％牛血清）中培养，观察移核胚的融合率及发育率，部分去核卵母细胞经染色后观察去核率。结果表明：（１）移核胚的融合率为８６．９％（５３／６１）；（２）发育至２～８细胞期的胚胎占培养的移核胚胎总数的２１．３％（１０／４７）；（３）卵母细胞的去核率为６８．２％（４５／６６）。     

体外受精后不同时间收集的牛胚胎的冷冻效果

比较了体外受精后不同时间收集的牛囊胚期胚胎冷冻后的存活率。试验一收集受精后第６，７，８和９天出现的胚胎，分３步加入０．７５ｍｏｌ／Ｌ甘油和０．５ｍｏｌ／Ｌ丙二醇，将胚胎装入０．２５ｍＬ细管后，放入已降温至５℃的冷冻机内，立即以２℃／ｍｉｎ的速率降温至－７℃，停留５ｍｉｎ后植冰。植冰后５ｍｉｎ，以０．３℃／ｍｉｎ的速率降温至－２５℃，取出胚胎，并立即投入液氮中保存。解冻时，先让细管在空气中暴露１０ｓ     

牛体外受精胚胎工厂化生产技术的探讨

牛体外受精胚胎工厂化生产的目的是获得大量优良遗传性状的胚胎,用于胚胎移植。作者就该技术的5个主要环节,即活体采卵、体外成熟、体外受精、体外培养、胚胎冷冻及发展前景等作一综述。     

牛体外受精低品质胚胎冷冻保存效果

体外受精胚的品质和耐冻性较体内受精胚差、妊娠率低 ,特别是低品质冻胚的妊娠率更低。为了改善低品质冻胚的妊娠率 ,我们设 10 %乙二醇 (EG)、 8%EG和 5%EG +5 % 1,2 丙二醇 (PD) 3种不同处理的防冻剂就牛体外受精低品质胚胎的冷冻效果进行了初步的探讨。结果用这 3种防冻剂冷冻保存的胚胎 ,解冻后用TCM - 199+10 %犊牛血清 (FCS) +10 0 μmol/Lβ 巯基乙醇 (β ME)培养 72h的孵化率分别为 11 1%、 2 1 4 %和 2 0 6 % ,后两者明显地高于前者     

混合防冻剂、投液氮温度及解冻温度对牛体外受精胚胎活力的影响

试验一按正交设计比较了三种浓度（０．５Ｍ，０．７５Ｍ和１．０Ｍ）的甘油和丙二醇、三种投液氮温度（－２５℃，－３５℃，－４５℃）、三种解冻温度（１０℃，２０℃，３７℃）对第７、第８天囊胚存活率的影响。结果甘油浓度以１．０Ｍ和０．７５Ｍ的效果较好，胚胎成１６率分别为５４．０％和５３．１％；而丙二醇以０．５Ｍ水平的成活率最高，为６１．６％；投液氮温度以－２５℃的效果最好；（成活率为５６．１％）；解冻温度则以２０℃、３７℃优于１０℃，成活率分别为５７．６％，５８．９％及３７．１％。试验二用０．７５Ｍ甘油十０．５Ｍ雨二醇及１．０Ｍ甘油＋０．５Ｍ丙二醇作为防冻剂，将胚胎降温至－２５℃后投入液氮，在２０℃水浴中解冻。结果两组胚胎的成活率均较高，分别为７９．０％和８０．０％（Ｐ＞０．０５）。     

不同冷冻方法对牛体外受精胚胎冷冻效果的影响

通过采用程序降温法(试验1:分步法10%甘油;试验2:直接法1.8mol/L乙二醇+0.1mol/L蔗糖)和玻璃化法(试验3:20%甘油+0.3M蔗糖+0.3M木糖+3%聚乙二醇+20%乙二醇)对牛体外受精胚胎进行冷冻保存及解冻后进行孵化培养试验,用囊胚孵化率对各方法进行了比较。结果表明,10%甘油组、1.8mol/L乙二醇+0.1mol/L蔗糖组及玻璃化组胚胎存活率分别为85%、82.5%、90%;囊胚孵化率分别为50%、55%和80%(P<0.05)。体外受精胚用玻璃化法保存显著优于程序降温法,可获得较高的胚胎存活率(90%)和囊胚孵化率(80%)。     

牛早期胚胎体外发育条件的研究

本试验研究了精卵共育时间和培养液等因素对牛早期胚胎体外发育的影响。精卵共育6～12h能显著提高受精卵的囊胚发育率,受精卵的囊胚发育率为23．2％～25．3％,共育时间为24h时,囊胚发育率降低,但精卵共育6h时卵裂率较低;TCM199、mBECMaa、mSOFaa均能支持体外受精卵的发育,其囊胚发育率分别为18％、30．7％和29．2％。试验结果表明：精卵于BM受精液中共育9h后,将其置于添加5％OCS的mBECMaa或mSOFaa中培养,能得到较高的体外生产胚胎的囊胚发育率。     

环境因素与牛早期胚胎死亡

本文从胚胎自身因素,母体因素有生殖道环境三个方面论述了牛早期胚胎死亡的原因,并提出了相应的防治措施。     

牛体外受精胚胎早期发育过程中基因差异表达的研究

本研究旨在筛选牛体外受精胚胎早期发育差异表达基因,并进行差异表达分析。选取牛卵母细胞、体外受精8细胞期和囊胚期胚胎为试验材料,进行mRNA差异表达研究。初步克隆出4个牛卵母细胞和早期胚胎发育不同阶段差异表达的基因,同源性分析显示,它们分别与高移动样蛋白盒结构域4基因(HMGXB4)、热休克蛋白40亚家族C成员8基因(Dnajc8)、突触膜胞吐调节2基因(RI MS2)和核糖体蛋白L31基因(RPL31)高度同源。RT-PCR检测验证,HMGXB4、Dnajc8、RI MS2和RPL31在牛卵母细胞和早期胚胎发育过程中mRNA表达量存在时间性差异,可能与其参与不同的生理活动有关。     

不同浓度防冻剂和投液氮温度对牛体外受精胚胎冷冻效果的影响

比较了3种不同浓度的甘油（1.4,1.0,0.7mol/L）和投液氮温度（-25℃、-30℃和-35℃）对牛体外受精胚胎冷冻效果的影响。结果发现,最终投液氮温度为-25℃时,胚胎冻后存活率以1.4mol/L甘油组为最高,同1.0mol/L甘油组相比,差异显著（78.5%vs 64.5%,P〈0.05）;与0.7mol/L甘油组相比,差异极显著（78.5%vs53.5%,P〈0.01）。以1.0mol/L的甘油冷冻,-30℃投液氮的效果优于-25℃的,它们之间冻后胚胎的孵化率差异显著（77.1%vs 64.5%,P〈0.05）。用0.7mol/L甘油冷冻,投液氮温度以-30℃的为最好,冻后胚胎的孵化率（73.3%）极显著（P〈0.01）高于-25℃的（53.5%）。用1.4mol/L甘油冷冻,以-25℃投液氮为最好,冻后胚胎的孵化率（78.5%）显著（P〈0.05）高于-35℃的（65.7%）。结果表明,不同的甘油浓度和投液氮温度对牛体外受精胚胎的冷冻效果有显著的影响。     

牛体外受精技术研究进展

１卵母细胞的体外成熟１．１卵母细胞的获取自卵巢获取卵母细胞的方法主要有４种。机械分离法，系自屠宰场废弃的卵巢表面获取卵母细胞的常用方法，主要有抽吸法、切割法和剥离法。抽吸法操作迅速，但易损伤卵丘细胞，取卵数量较少；切割法在最短时间内获卵数量较多，但易出现裸卵和损伤卵丘细胞；剥离法操作繁琐，但对卵丘细胞损伤较小。机械分离和酶消化结合法，系自屠宰场废弃的卵巢内获取卵母细胞的常用方法，可克服机械分离时间长的特点，又减轻了酶消化过程中对细胞细微结构的破坏。腹腔镜和超声扫描活体取卵法，系自活体卵巢内获取卵…