蓖麻蚕核型多角体病毒p6.9基因的克隆及序列分析

基于丰富蓖麻蚕核型多角体病毒(Philosamia cynthia ricininucleopolyhedrovirus,PcrNPV)分子信息的目的,对PcrNPV DNA部分片段进行了测序分析,获得1个DNA结合蛋白基因p6.9的完整序列。该基因的读码框由240个核苷酸组成,编码79个氨基酸,分子质量约为9.8 kD,转录起始位点ATG侧翼序列符合Kozak规则,其上游34bp处具有晚期基因转录的保守起始序列taag,表明该基因为晚期表达基因。将PcrNPV与12种昆虫核型多角体病毒P6.9蛋白氨基酸序列作同源性比较的结果显示:PcrNPV P6.9蛋白氨基酸序列与家蚕(Bombyx mori)NPV P6.9的同源性为59%,与柞蚕(Antheraea pernyi)NPV的同源性为100%,表明PcrNPV与ApNPV的亲缘关系很近。     

山羊痘病毒反向末端重复序列的克隆与序列分析

应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y、B-株反向末端重复序列片段,将其克隆至pMD18-T载体,构建了重组质粒pMD18-ITR,再将该重组质粒转化DH5α感受态细胞进行培养,对通过PCR、酶切鉴定为阳性的重组菌进行序列测定,并将所得序列与GenBank收录的2株山羊痘病毒、3株绵羊痘病毒全基因序列进行比较分析。结果:所测4个毒株序列与GenBank上收录的山羊痘病毒该片段核苷酸序列的同源性均为100%,与绵羊痘病毒该片段核苷酸序列的同源性均为98.3%。研究结果表明,山羊痘病毒反向末端重复序列与已收录的羊痘毒株之间该片段的同源性非常高,为今后兽医临床上应用PCR方法检测羊痘病毒提供了另一更为特异、保守的基因片段。     

家蚕核型多角体病毒CQ1分离株与T3株的单核苷酸多态性分析（英文）

依据基因组中的单核苷酸多态性(SNPs)位点对不同来源家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)进行地理株系溯源,有利于Bm NPV的分子流行病学研究以及对病害流行的预防性控制。采用霰弹法对Bm NPV重庆分离株CQ1进行全基因组测序,获得了1 052条reads序列,测序深度为3.5倍,覆盖基因组95%以上的区域。采用生物信息学方法,将这些序列与Bm NPV日本分离株T3的基因组序列进行比对分析,在2个株系间共鉴定获得400个候选SNPs。与T3株基因组唯一位点匹配的386个SNPs中,有77%的SNPs属于转换,23%的SNPs属于颠换;15个SNPs位于基因间区,其余都分布在基因编码区;115个非同义SNPs(c SNPs)分布于67个基因的编码序列中,其中11个基因有至少3个非同义SNPs,例如CQ1分离株的非必需基因orf74有5个非同义SNPs。结构预测显示,CQ1分离株的几丁质酶基因中3个非同义SNPs引起变化的氨基酸位点均位于几丁质酶的三维结构表面。研究结果表明,Bm NPV CQ1和Bm NPV T3株系之间存在丰富的单核苷酸多态性。     

高丹草超低氢氰酸含量ISSR特征片段的克隆及序列分析

为明确高丹草超低氢氰酸含量ISSR特征片段的DNA分子特征,以散穗高粱×黑壳苏丹草杂种F2的3个超低氢氰酸含量ISSR特征片段H-1、H-2、H-3和散穗高粱×白壳苏丹草杂种F2的3个超低氢氰酸含量ISSR特征片段B-1、B-2、B-3为材料,对6个不同的ISSR特征片段进行了克隆和测序分析.结果表明:克隆的特征片段H-1序列全长为1377bp,序列包含1个357bp的完整编码区(ORF),位于743～1099bp区域,共编码119个氨基酸,片段与小麦亚种蛋白b的同源性为60％.片段H-2序列全长2268bp,序列包含1个279bp的ORF,位于735～1013bp区域,共编码93个氨基酸,片段与高粱假设蛋白SORBIDRAFT_05g027190同源性为63.9％,与水稻粳稻组假设蛋白OsJ_07776同源性为62％.片段H-3序列全长2614bp,序列包含1个339bp的ORF,位于1024～1362bp区域,共编码113个氨基酸.片段B-1序列全长1432bp,序列包含1个300bp的ORF,位于700～999bp区域,共编码100个氨基酸.片段B-2序列全长1363bp,序列包含1个228bp的ORF,位于603～830bp区域,共编码76个氨基酸.片段B3序列全长2751bp,序列包含1个186bp的ORF,位于2534～2719bp区域,共编码62个氨基酸.片段H-3、B-1、B-2、B-3与现有已知的植物碱基序列和氨基酸序列没有同源性,可能是与高丹草超低氢氰酸含量关系更为密切的DNA新序列.     

蓖麻蚕核多角体病毒核糖核酸的限制性内切酶酶解图谱和电镜观察

从感染NPV的蓖麻蚕(Philasomiaricini)血淋巴收集NPB.NPB经0.01M Na_2CO_3—0.05M NaCl作用后,用水饱和苯酚—十二烷基硫酸钠提取DNA.NPV DNA的电镜观察表明其环状分子长度差异很大,最大的环和最小的环相差6倍多.测量了9个环状分子长度,长度在36±4μm,相当75±8×10~6道尔顿分子量的分子占总数近60%.NPV DNA用限制性内切酶BglⅡ,BamHI:XhoⅠ,XbaⅠ酶解分别出现6,4,15和8个片段,用片段总和法计算的平均分子量为74.7×10~6道尔顿.     

柞蚕NPV多角体膜蛋白类似基因的克隆和序列分析

为探明柞蚕核型多角体病毒(Anthraea pernyi nucleopolyhedrovirus,ApNPV)基因组信息,从柞蚕尸体中分离纯化ApNPV,提取其基因组DNA,分别建立ApNPV DNA的HindⅢ和SalⅠ酶切片段文库。对插入片段进行测序,经过同源性分析发现,在2．9kb的SalⅠ片段上包含1个多角体膜蛋白类似基因,其读码框编码289个氨基酸,是一个晚期表达基因。氨基酸同源性比较的结果表明,ApNPV的多角体膜蛋白基因与云杉卷叶蛾(Choristioneure fumiferana)NPV的同源性较高,达91．7%,而与家蚕(Bombyx mori)NPV及苜蓿尺蠖(Autographa califorlica)MNPV的同源性较低,分别为65．1%和63．0%。该结果说明ApNPV与CfNPV在进化关系上较近,而与BmNPV和AcNPV在进化关系上较远。比较多种核型多角体病毒的多角体膜蛋白和多角体蛋白的氨基酸序列发现,这两种多角体结构蛋白的同源性具有相似的变化趋势。     

牦牛铜锌超氧化物歧化酶基因cDNA克隆测序及其分子进化研究

对牦牛Cu／Zn—SODcDNA进行克隆测序。所扩增片段长度为842bp,编码区长度为459bp。扩增片段与奶牛Cu／Zn-SODcDNA序列比较发现有16个碱基存在差异。通过与已知Cu／Zn-SODcDNA序列的7个物种：人、猪、鼠、大鼠、奶牛以及马的cDNA序列的比较构建了分子进化系统树。对所得序列的ORF分析发现,牦牛Cu／Zn—SOD由152个氨基酸组成,并对氨基酸序列进行了比对分析。     

山羊高繁殖力相关基因的筛选与分析

为查找与山羊繁殖力相关的基因,进一步研究繁殖力调控的遗传机制,本研究选用12只冀中山羊,按照其繁殖记录分为高产和低产2组,应用差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)技术,分析了山羊在发情期卵巢组织基因表达的差异。经二次扩增、反式Northern以及半定量PCR验证分析,最终得到4个表达量差异的阳性片段。所得片段经克隆测序提交至GenBank,并进行BLAST分析。结果,4个差异片段中2条为新发现的表达片段,在NCBI中未发现高度同源序列。1条与野猪中获得的克隆片段THY010003E05同源性为81%,但功能未知。另1条差异片段的序列与牛PCNP的mRNA序列的同源性为94%。结果提示,该片段所属基因应属于PCNP基因,结合对其功能的分析结果,推测PCNP可能通过参与卵细胞生成过程中的细胞周期调控影响山羊繁殖力。     

牦牛铜锌超氧化物歧化酶基因cDNA克隆测序及其分子进化研究

对牦牛Cu/Zn-SOD cDNA进行克隆测序。所扩增片段长度为842bp,编码区长度为459bp。扩增片段与奶牛Cu/Zn-SOD cDNA序列比较发现有16个碱基存在差异。通过与已知Cu/Zn-SOD cDNA序列的7个物种:人、猪、鼠、大鼠、奶牛以及马的cDNA序列的比较构建了分子进化系统树。对所得序列的ORF分析发现,牦牛Cu/Zn-SOD由152个氨基酸组成,并对氨基酸序列进行了比对分析。     

堆形艾美球虫广东株Ea1A基因的扩增与序列测定

根据GenBank上登录的堆形艾关球虫Ea1A基因序列，设计了1对引物，以抽提的广东株的总RNA为模板，利用反转录一聚合酶链反应(RT—PCR)扩增获得了Ea1A基因部分片段，并将此片段克隆至pGEM—T载体中，经PCR、限制性内切酶分析和克隆片段序列测定、比较，证实了克隆片段的可靠性。     

蒙古冰草肌动蛋白基因片段的克隆与组织表达分析

本研究利用同源序列法分离蒙古冰草Actin基因同源片段,并分析蒙古冰草Actin基因在根、茎、叶中的表达特征。根据禾本科植物小麦Actin基因的保守序列设计1对引物A1,经RT-PCR扩增,从蒙古冰草cDNA中克隆到1个长度为541 bp的Actin基因片段,使用DNAman和DNAUSER等分子生物学软件进行序列分析,结果表明,该序列编码179个氨基酸,并推测该片段具有Actin超基因家族的保守结构域,含有1个ATP结合位点,抑制蛋白结合位点和胶溶蛋白结合位点;该基因片段的氨基酸序列与小麦Actin基因的同源性为99%,与玉米同源性为96%,与水稻同源性为93%。组织器官特异性表达分析结果表明,该基因在根、茎、叶中的表达量恒定。将该基因片段命名为MwACT1,并在GengBank中登记注册,登录号为FJ490410。     

小反刍兽疫灭活抗原RT—PCR检测方法的建立及其相关序列分析

以灭活的检测用抗原为材料,抽提灭活小反刍兽疫病毒的基因组RNA作为模板,根据参考文献及GenBank下载的序列,设计3对位于F基因的引物（2对为套式引物）,进行RT-PCR扩增及扩增片段的T载体克隆、序列分析。结果显示,所设计引物单独或套式RT—PCR对模板均有预期大小的片段扩增;扩增片段经核苷酸序列测定和分析,表明所扩增片段为小反刍兽疫病毒的F基因片段。且所设计引物对同属牛瘟病毒、犬瘟热病毒无扩增,证明所用引物为小反刍兽疫病毒特异性引物,此3对引物可用于小反刍兽疫与牛瘟等同属病毒的鉴别诊断。     

小反刍兽疫灭活抗原RT-PCR检测方法的建立及其相关序列分析

以灭活的检测用抗原为材料,抽提灭活小反刍兽疫病毒的基因组RNA作为模板,根据参考文献及GenBank下载的序列,设计3对位于F基因的引物(2对为套式引物),进行RT-PCR扩增及扩增片段的T载体克隆、序列分析。结果显示,所设计引物单独或套式RT-PCR对模板均有预期大小的片段扩增;扩增片段经核苷酸序列测定和分析,表明所扩增片段为小反刍兽疫病毒的F基因片段。且所设计引物对同属牛瘟病毒、犬瘟热病毒无扩增,证明所用引物为小反刍兽疫病毒特异性引物,此3对引物可用于小反刍兽疫与牛瘟等同属病毒的鉴别诊断。     

鸡白痢沙门菌基因组差异片段的筛选与分析

采用抑制性消减杂交技术（SSH）对鸡白痢沙门菌C79-13株与鸡伤寒沙门菌Sg9株进行了基因组差异片段分析.结果,从C79-13株中共检出13个特异性差异片段.经同源分析,这些序列可分为3类：噬菌体相关序列、质粒相关序列和已知功能序列.这些差异片段包含一些重要的沙门菌毒力相关基因,如编码大肠杆菌素、IpaJ蛋白、尾突蛋白、切除酶的基因.结果表明,鸡白痢沙门菌C79-13株与鸡伤寒沙门茵Sg9株基因组问存在较多差异基因,这些差异片段为确定鸡白痢沙门菌特异性遗传标志,建立分子鉴别新体系提供了基础.     

猪瘟病毒辽宁株E2蛋白部分基因片段的序列分析

应用RT-PCR方法对辽宁地区8份猪瘟临床病料进行了E2蛋白部分基因片段扩增,其中有5份病料扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳获得大小约为210bp的目的基因片段.经对目的基因片段回收纯化后进行核苷酸序列测定,并与国内外发表的18株猪瘟病毒株的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比较表明,所分离的5株猪瘟病毒株核苷酸序列及氨基酸序列与C1W、C2W等8个毒株的同源性较高,而与国内的疫苗株和强毒株的同源性则较低,基因型差异比较明显,并不归属于同一个基因亚群.本研究通过对E2基因片段扩增以及相应的核苷酸序列和氨基酸序列分析,揭示了本地区猪瘟病毒的分子流行病学背景.     

应用二温式PCR检测家蚕核型多角体病毒的方法

为了简便、快速、准确地检测家蚕核型多角体病毒(Bm NPV),以Bm NPV广西分离株的多角体蛋白基因(polh)序列(Gen Bank登录号:JQ991011.1)设计引物,以感染Bm NPV(广西宜州分离株)2 h的5龄家蚕幼虫中肠组织提取的DNA为模板,建立二温式PCR检测Bm NPV的方法,最终确定的最佳反应体系为:10×PCR buffer 1.5μL,5 mmol/L Mg Cl22μL,2.5mmol/L d NTP 0.5μL,10μmol/L上、下游引物各1μL,5 U/μL Taq DNA聚合酶0.1μL,18 ng/μL模板DNA 1μL,加水至总体积15μL。确定的最佳反应条件为:94℃预变性3 min;95℃15 s,延伸和退火温度合并为62℃30 s,共25个循环。按上述条件PCR扩增得到大小约309 bp的特异性片段,测序结果与已知polh基因序列的相似度为100%。与普通PCR检测方法比较,采用二温式PCR方法对样本的检测时间节省1.5 h,反应特异性强,灵敏度高(能被检测的最小感病组织基因组DNA的质量浓度为1.8 pg/μL),并且选择最初2 h感病的幼虫中肠组织为检测材料,因而可用于家蚕血液型脓病的早期诊断。     

捻转血矛线虫Hc38保守结构域所在基因片段的真核表达载体构建

根据捻转血矛线虫Hc38基因产物(登录号AY749124)保守结构域所在核酸序列设计1对引物,该引物包含Kozak序列、HindⅢ酶切位点、Xba Ⅰ酶切位点.以含有捻转血矛线虫Hc38基因保守结构域片段的pMD19-T为模板,经PCR扩增获得Hc38基因保守结构域片段,用HindⅢ、Xba Ⅰ双酶切该片段,回收后将此基因片段克隆至相同酶切回收后的真核表达载体pcDNA3.1(+)中,获得重组质粒pcD-NA3.1-Hc38.经酶切分析、序列测定和PCR鉴定,证实了重组质粒的正确性.     

猪瘟病毒辽宁株E2蛋白部分基因片段的序列分析

应用RT-PCR方法对辽宁地区8份猪瘟临床病料进行了E2蛋白部分基因片段扩增，其中有5份病料扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳获得大小约为210bp的目的基因片段。经对目的基因片段回收纯化后进行核苷酸序列测定，并与国内外发表的18株猪瘟病毒株的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比较表明，所分离的5株猪瘟病毒株核苷酸序列及氨基酸序列与C1W、C2W等8个毒株的同源性较高，而与国内的疫苗株和强毒株的同源性则较低，基因型差异比较明显，并不归属于同一个基因亚群。本研究通过对E2基因片段扩增以及相应的核苷酸序列的氨基酸序列分析，揭示了本地区猪瘟病毒的分子流行病学背景。     

猪传染性胃肠炎华毒弱毒株纤突蛋白B、C抗原位点片段基因的克隆与序列分析

猪传染性胃肠炎华毒（TGEV H）是我国分离的代表毒株,H弱毒株是我国自行培育成功的具有良好免疫原性的疫苗株。应用RT－PCR方法扩增出1．3kb的目的片段,包括S基因的编码的B、C两个主要抗原位点的片段,目的片段与pUC19质粒载体进行连续,转化,鉴定后得到阳性重组质粒,命名为pTS1,将重组质粒插入的目的基因片段进行序列分析和比较,其结果表明TGEV H株和S基因5’端B、C位点片段1190bp的核苷酸序列与国外的TGEV毒株Miller、Purdue-115、FS772／70及台湾省TFI毒株序列均具有很高的同源性,达94．72以上。推导的氨基酸序列同源性为94．70％以上。编码抗原位点C的序列与其它毒株完全一致,但在B位点发生改变,即第97个氨基酸发生改变,由Trp突变为Ser。该核苷酸该片段全长1261bp,包括起始密码子ATG及基因间的共同序列ACTAAAC。本研究首次报道了国内的TGEV分离株－H弱毒株S基因的RT－PCR扩增及其编码的B、C抗原位点片段的分子克隆及序列分析,为进一步揭示TGEV强弱毒差别的分子机制、开展新型疫苗及进行分子诊断的研究奠定了重要基础。     

新城疫病毒F_(48)E_9株P基因的克隆及鉴定

根据NDVP蛋白己知基因序列设计合成了一对引物PU/PL ,利用RT_PCR扩增出了F4 8E9株P基因 12 72bp的片段 ,将该片段克隆到pMD18_TVector上 ,并对所得到的重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定 ,结果证明我们得到了这个基因片段的阳性重组子。为了更充分证实所得阳性质粒的可靠性 ,采用Sanger’s双脱氧末端终止法对阳性重组子从 5’端进行核苷酸序列测定 ,获得了F4 8E9株P基因片段 5’端的基因序列 ,利用DNASIS分析软件 ,将F4 8E9株与LaSota株的相应序列进行比较 ,其核苷酸序列同源性为 83 7%。至此 ,我们获得了F4 8E9株P基因的全长克隆