快速鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种双重PCR方法的建立

本试验旨在建立一种快速、特异、敏感的双重PCR鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种病原检测方法。根据猪链球菌GDH蛋白和马链球菌类 M 蛋白的基因保守区分别设计引物,优化了该双重PCR检测方法的引物浓度及比例,并筛选了其最佳退火温度;用该双重PCR反应体系以其他几株阴性菌株为对照,检测了该反应体系的特异性。以新鲜培养的猪链球菌倍比稀释后进行菌落计数,对该检测方法的敏感性进行了鉴定。M-like和GDH引物的加入量均为1 μL(20 pmol/L),最佳退火温度为52.3℃;该双重PCR反应体系有较高敏感性,检测马链球菌兽疫亚种和猪链球菌的敏感度分别达100和10 CFU;特异性试验结果显示,常见的5种病原菌在该双重PCR体系中无特异性条带出现;临床应用该方法分离鉴定了1株猪链球菌和2株马链球菌兽疫亚种。本试验建立了一种能同时检测猪链球菌和马链球菌兽疫亚种的双重PCR方法,且该方法应用快速、特异且敏感。     

猪链球菌病及其疫苗研究进展

猪链球菌病(Streptococcosis suis)是由多种不同群的链球菌引起的不同临诊症状传染病的总称〔1〕。该病以导致猪败血症、化脓性淋巴结炎、脑膜炎、关节炎为主要特征,在某些特定诱因作用下,发病猪群死亡率可达80%左右。我国将猪链球菌病列为二类动物疾病〔1,2〕。近年来,我国南方大部分地区发生和流行的猪链球菌病的主要病原是猪链球菌2型(Streptococcus suis type2)及马链球菌兽疫亚种(Streptococcusequine subspecies.zooepidemicus)。本文着重对这2种不同型猪链球菌的病原学、流行病学及疫苗的研究近况进行了综述。1病原学猪链球菌为需…     

双重实时荧光PCR快速检测猪链球菌2型方法的建立及应用

根据GenBank上公布的MRP与CPS2J的开放性阅读框保守序列,运用BEACON Desigener 2.0软件设计和合成了2对引物和其相应的荧光探针,优化各个反应物的浓度和实时荧光PCR循环程序,建立从组织中直接检测2型链球菌主要毒力因子MRP与CPS2J的实时荧光PCR方法.双重实时荧光PCR检测2型猪链球菌方法能够从病料中直接检测2型猪链球菌并可以检测出该菌的主要毒力基因MRP,运用该方法可以最低检测到24CFU/mL 2型猪链球菌,并且与其他血清型链球菌和其他病原菌无交叉反应.特异性良好.通过对8个样品在3个不同时间的检测.结果显示该方法的稳定性和重复性均很好.     

猪链球菌2型与马莲球菌兽疫亚种生物学特性的初步比较

１９９８年从病死猪分离了数株莲球菌,其中２株编号为９８０１、９８０２。经鉴定,９８０１株为猪链球菌２型,９８０２株为马链球菌兽疫亚种。９８０１株系从暴发流行地区的病猪中分离,同时在该流行地区还发生畜禽从业人员感染相同血清型的链球菌而死亡的病例;９８０２株系从散发病猪中分离。临床有共同点,又有各自特点。病理变化均呈现典型的败血症变化,但肝、脾、肺等病变上有一些差别,而染色镜检基本一致。对免均敏感,对     

猪链球菌2型与马链球菌兽疫亚种生物学特性的初步比较

１９９８年从病死猪分离了数株链球菌（其中２株编号为９８０１,９８０２）,经鉴定,９８０１株为猪链球菌２型,９８０２株为马链球菌兽疫亚种。９８０１株系从暴发流行地区的病猪中分离,同时在该流行地区还发生畜禽从业人员感染相同血清型的链球菌而死亡的病例;９８０２株系从散发病猪中分离。临床有共同点,又有各自特点。病理变化均呈现典型的败血症变化,但肝、脾、肺等病变上有一些差别,而染色镜检基本一致。对兔均敏感,对小鼠和猪的敏感性有所不同。９８０１株菌落灰色,中心浑浊,直径０．５ｍｍ,α溶血,有草绿色色素沉着;９８０２株菌落湿润,半透明,直径１．５－２ｍｍ,β溶血。９８０１株对氧哌嗪青霉素、头孢他啶、氨苄青霉素最敏感;９８０２株对氧哌嗪青霉素、复方磺胺、头孢哌酮、呋喃妥因最敏感。     

猪链球菌2型PCR诊断方法的建立

根据猪链球菌2型荚膜多糖基因序列设计1对引物,建立了猪链球菌2型PCR诊断方法,该方法对猪链球菌2型的扩增结果为阳性,对照菌株扩增结果均为阴性,对猪链球菌2型检测的灵敏性为1 pg总DNA量。并用建立的PCR诊断方法检测40份猪链球菌疑似病料,检出阳性病例12份。以上结果表明,该PCR方法特异性强、敏感性高、简便、快速,可用于猪链球菌2型疾病的诊断。     

猪链球菌2型引致的猪链球菌病

2005年6月至8月间在四川暴发的导致猪和人死亡的猪链球菌病，是由致病性链球菌2型感染引起的一种人畜共患病。根据《中华人民共和国动物防疫法》及其有关规定．猪链球菌病为二类动物疫病。多种猪源链球菌均可导致猪链球菌病．可致病的猪源链球菌中．最常见的是猪链球菌2型及马链球菌兽疫亚种（旧称兽疫链球菌）。     

猪链球菌2型与马链球菌兽疫亚种生物学特性的初步比较

1998年从病死猪分离了数株链球菌 ,其中 2株编号为 980 1,980 2。经鉴定 ,980 1株为猪链球菌 2型 ,980 2株为马链球菌兽疫亚种。 980 1株系从暴发流行地区的病猪中分离 ,同时在该流行地区还发生畜禽从业人员感染相同血清型的链球菌而死亡的病例 ;980 2株系从散发病猪中分离。临床有共同点 ,又有各自特点。病理变化均呈现典型的败血症变化 ,但肝、脾、肺等病变上有一些差别 ,而染色镜检基本一致。对兔均敏感 ,对小白鼠和猪的敏感性有所不同。 980 1株菌落灰色 ,中心浑浊 ,直径 0 5mm ,α溶血 ,有草绿色色素沉着 ;980 2株菌落湿润 ,半透明 ,直径 1 5～ 2mm ,β溶血。 980 1株对氧哌嗪青霉素、头孢他啶、氨苄青霉素最敏感 ;980 2株对氧哌嗪青霉素、复方磺胺、头孢哌酮、呋喃妥因最敏感     

猪链球菌病概述

猪链球菌病是链球菌属中马链球菌兽疫亚种马链球菌类马亚种、Lancefield分群中D、E、L、群链球菌以及猪链球菌引致猪的疫病的总称。其中猪链球菌是引起猪链球菌的最主要病原,可引起败血症化脓性淋巴结炎、脑膜炎以及关节炎等症状。根据荚膜抗原的差异,猪链球菌分为35个血清型（1-3及1/2）及相当数量无法定型的菌株,其中1、2、7、型是猪的致病菌。2型最常见,也最为重要,     

猪链球菌病的防治

猪链球菌病是近年来流行于世界许多国家的一种传染病，其病原体主要是C群兽疫链球菌（Stneptocaccus，Zooepidcmicus）和马链球菌（S.equisimilis），D群猪链球菌（S.suis）、L群链球菌及E群链球菌也可使猪致病。本文对其临床症状、病理变化、诊断方法、治疗方法及防治措施加以阐述。     

猪链球菌2型多重PCR检测方法的建立及应用

设计3对引物,分别扩增链球菌属特异性gdh、猪链球菌种特异性16S rRNA和猪链球菌2型特异性cps2J等基因,目的片段大小分别为725bp、523bp和387bp。利用合成的3对引物并通过对反应条件与反应体系的优化建立了多重PCR。应用该多重PCR检测了分离到的链球菌1105株,检出猪链球菌667株,猪链球菌2型33株。研究结果表明,该方法特异性高、敏感性强,可广泛应用于猪链球菌病的快速诊断及流行病学调查。     

猪链球菌2型多重PCR快速检测方法的建立

根据猪链球菌16SrDNA基因的种特异性基因序列和CPS基因的2型（1或／和2型）型特异基因序列设计了4条引物，建立了快速检测猪链球菌2型（1或／和2型）的多重PCR方法。利用保存的猪链球菌2型菌株和其他相关标准菌株作为参考菌株对该方法进行了敏感性和特异性试验。结果显示，所建立的多重PCR方法特异、敏感，对组织中的猪链球菌2型（1或／和2型）的最低检出水平为30CFU／mL。用所建立的多重PCR方法对采自江西、北京、珠海、天津、四川等省市的猪扁桃体样品进行了检测，并通过细菌分离和玻片凝集试验对其检测结果进行了验证，结果显示，检出阳性符合率为100％，证实建立的多重PCR方法可用于猪链球菌2型的快速检测。     

多重荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌方法的建立及应用

建立了一种快速检测Ⅱ型猪链球菌（Streptococcus suis）的多重荧光PCR（multiplex real-time polymerase chain reaction）方法。首先，从GenBank中获得Ⅱ型猪链球菌荚膜抗原编码基因簇中的cps2I和溶菌素释放蛋白基因mrp，用PrimerExpress2．0设计引物和Taqman荧光探针，在ABl7500荧光PCR仪上进行荧光PCR检测。荧光曲线表明该多重荧光PCR可以特异性地检测Ⅱ型猪链球菌，而参考猪链球菌、大肠杆菌等细菌和空白对照均为阴性；检测方法灵敏度达10个细菌的最小检测量，整个过程仅需60min；稳定性试验表明，2次检测所得的ct值之间无统计学差异（P〉0．05）。本试验建立的多重荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌的方法快速、特异性强，灵敏度高，稳定性好，适合于大批量样品的检验，可广泛用于出入境检疫和动物防疫监督部门的疫情监测。     

2种猪源链球菌对猪、兔的致病性试验

检测了4株猪链球菌2型(Streptococcus suistype 2,SS2)和2株马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equisubsp.zooepidem icus,SEZ)对猪、兔的致病性。SS2-1、SS2-H及SS2-006444株均分离自发病猪内脏,前2株毒力因子表现型为MRP+EF+SLY+,后者为MRP-EF-SLY-;SS2-D株为国外引进的SS2人源株,作为对照,其毒力因子的表现型为MRP+EF*SLY+;SEZ-CY和SEZ-CN株均分离自发病猪并经鉴定。SS2-1、SS2-H、SEZ-CY和SEZ-CN株对猪(2~3头/组)的最小致死量分别为106、107、104和108cfu;对兔(2~3只/组)的最小致死量分别为100~1 000、1 000、100和105cfu;SS2-D株108cfu对猪不致死,对兔的最小致死量为108cfu,而SS2-006444对猪、兔无致病性。显示SS2毒力因子与其对猪、兔的致病性有关;SS2与SEZ菌株对兔或猪的致病性一致,可用兔取代猪做试验;SS2和SEZ菌株通过腹腔、皮下、肌肉或静脉注射均可感染兔(2~4只/组),并致死,SEZ还可经口、鼻感染;SEZ与SS2静脉感染猪后10 m in即可检出细菌,此后2~4 h为无菌血症阶段,之后重新出现。     

2种猪源链球菌菌体细胞表面疏水性及体外结合纤连蛋白的检测

采用盐析法测定了马链球菌兽疫亚种ATCC35246株（简称35246）和猪链球菌2型9801株（简称HA9801）的表面疏水性。35246在浓度为1．0mol／L的硫酸铵中2min内析出，HA9801在0．6mol／L的硫酸铵中析出。用不同浓度的人纤连蛋白（Fn）包被ELISA板，采用ELISA方法检测了对数生长后期的35246和HA9801体外结合固定Fn的情况。35246的D415随细菌浓度的升高而增大，而9801的D415与对照相比，经t检验差异不显著（P〉0．05）。采用间接免疫荧光试验，对二者体外结合游离的人Fn的情况进行了检测，结果在2种细菌周围均见绿色荧光。结果表明，二菌均为表面疏水菌；35246株既可结合固定的Fn，又可结合游离的Fn；而HA9801株仅与游离的Fn结合。     

鸭疫里默氏菌病和大肠杆菌病多重PCR诊断方法的建立

参考GenBank中鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的外膜蛋白A(OmpA)基因序列,应用PrimerPremier5.0软件在二者高度保守区设计了2对引物,建立了适合鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的快速检测的多重PCR检测方法。以该方法对已分离并保存的鸭疫里默氏菌和大肠杆菌进行PCR扩增,分别扩增出与试验设计相符的670、408bp的特异性DNA片段。将扩增所得的DNA片段进行克隆测序,测序结果表明分别为鸭疫里默氏菌和大肠杆菌OmpA基因序列。该方法对鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的检测下限分别为4×104CFU/mL和3×104CFU/mL。表明所建立的PCR方法具有特异、快速和敏感的特点,可用于诊断鸭疫里默氏菌、大肠杆菌以及两者的混合感染。     

类M蛋白亚单位疫苗的佐剂筛选

将铝胶、ISA206和CpG三种佐剂分别与热盐酸提取的马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus)ATCC35246株类M蛋白配合,制成疫苗接种20日龄的小鼠,并设不加佐剂的类M蛋白亚单位疫苗免疫对照组.二次免疫后用ATCC35246株活菌攻击,铝胶、ISA206、CpG和对照组的保护率分别为75%(12/16)、81.25%(13/16)、68.75%(11/16)和56.25%(9/16).试验结果表明ISA206的免疫增强作用高于其他两种佐剂,可望与类M蛋白亚单位疫苗配合,用于预防猪链球菌病.     

PCV2、PRV和PRRSV多重PCR方法的建立及其应用

根据GenBank登录的猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的参考基因序列,设计3对引物分别用于扩增PCV2的ORF2基因、PRV的gE基因、PRRSV的N基因的目的片段,通过优化反应中各个影响因素,建立了PRV、PCV2、PRRSV的多重PCR（mPCR）检测方法。敏感性和特异性的结果表明,该方法对这3种病毒的最低核酸检出量分别为32.5（PRV）、25.2（PCV2）、35.9pg（PRRSV）。该方法对猪流感病毒（SIV）、猪圆环病毒1型（PCV1）、大肠杆菌、猪瘟病毒（CSFV）、猪流行性腹泻病毒（TGE）等病毒的检测结果均为阴性。200份临床样品的多重PCR结果表明,PCV2感染率为80%（160/200）,PRV感染率为21%（42/200）,PRRSV的感染率为78%（156/200）。200份临床样品主要为PCV2和PRRSV混合感染,阳性率达56.0%（112/200）。该方法的建立对这3种病毒病的早期快速检测和指导临床实践具有十分重要的意义。     

猪链球菌2型及其毒力因子检测多重PCR的建立与应用

根据相关文献设计并合成引物，建立了能同时检测猪链球菌2型（cps）及其重要毒力因子溶菌酶释放蛋白（mrp）和细胞外因子（epf）的多重PCR方法。目的片段的大小分别为885bp（mrp）、675bp（cps）和443bp（epf）。对参考菌株、人工攻毒病料和临床收集病料的检测结果显示，该多重PCR特异性强、敏感性高，可直接从临床病料中检测出猪链球菌2型，并能鉴定其毒力因子表型。