农杆菌介导棉花基因转化的研究

以棉花无菌苗下胚轴为外植体,通过愈伤组织培养,使供试的20个棉花新品种(系)中19个培养出体细胞胚或再生植株.在此基础上,选用易获得再生植株的邯93-2、邯无2031、衡无89-30、C201、C312,利用农杆菌介导转化Bt基因,抗卡那霉素愈伤组织诱导率约为50%,其中约40%表现GUS阳性.从邯93-2 GUS阳性愈伤中获得再生植株,其50%呈GUS阳性,且Bt基因的导入经Southern杂交验证.     

转GbNPR1基因提高烟草抗病性

病害是造成烟草减产和品质降低的主要因素,而利用生物技术提高烟草抗病性是解决此问题的有效途径,其中包括利用与植物抗病性密切相关的关键因子如病程相关基因非表达子(non-expressor of pathogenesis-related genes1,NPR1)。本研究利用源于海岛棉的Gb NPR1基因,表皮特异性启动子CUT1和组成型启动子35S构建两个植物表达载体35S-Gb NPR1和CUT1-Gb NPR1,经农杆菌介导法分别转化烟草。T0代及T1代转化植株PCR检测证明,目的基因已整合到核基因组中。T1代植株RT-PCR分析表明,Gb NPR1基因在转录水平得以表达。bar试纸条检测为阳性,证明和Gb NPR1连锁的草甘膦基因能够正常转录和翻译表达。将阳性植株进行烟草病菌赤星病、炭疽病和低头黑病等三种病害的病原菌离体接菌实验,研究结果表明:转CUT1-Gb NPR1载体的转基因烟草虽然较转35S-Gb NPR1载体的烟草对三种病菌的抗性稍低,但较野生型烟草相比具有较高抗性。转Gb NPR1基因的烟草能提高对低头黑病和炭疽病的抗性为首次报道。     

棉花外源基因导入及转基因再生植株条件的研究

用５～６ｄ的棉花无菌苗下胚轴切段与农杆菌共培,菌株质粒中Ｇｕｓ基因为标记基因,ＮＰＴⅡ基因为选择基因。在含０．１ｍｇ·Ｌ－１２,４－Ｄ和０．１ｍｇ·Ｌ－１ＫＴ的ＭＳ培养基上共培４８ｈ,转移到添加头孢霉素５００ｍｇ·Ｌ－１,卡那霉素５０ｍｇ·Ｌ－１的ＭＳ培养基中诱导和筛选抗性愈伤组织,７０～８０ｄ时,进行ＧＵＳ检测,选择ＧＵＳ阳性愈伤组织,经体细胞分化生成转基因再生植株。     

农杆菌介导FT基因转化嘎拉苹果的研究

用农杆菌介导法对苹果品种嘎拉转化FT基因进行了研究,建立了苹果离体叶片高效再生体系,在含BA 5mg／L＋IAA 0．5mg／L的MS培养基上,以离体叶片远轴面（叶背面）向上,经过14d的暗培养获得再生不定芽和再生植株,再生率达97％。在转基因再生体系中,以头孢噻肟钠500mg／L和卡那霉素5mg／L,作为脱菌培养和选择培养的条件,经过感染携带拟南芥FT基因的农杆菌,获得了一批转FT基因的植株,经PCR检测,目的基因已经整合到苹果基因组中。     

敖汉细毛羊BMP4基因质粒的构建及在成纤维细胞中表达量的研究

旨在构建敖汉细毛羊BMP4基因的质粒及转染成纤维细胞后研究基因表达量的变化。以30日龄的敖汉细毛羊胚胎为研究对象。首先,通过RNA的提取反转录成cDNA参照GenBank中BMP4基因序列信息设计1对引物,通过PCR反应扩增获得BMP4基因片段、将得到的BMP4基因连接到pEASYTM-T1载体,构建pEASYTM-T1-BMP4重组质粒并转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建pcDNA3.1-BMP4重组质粒,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞;其次对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将重组pcDNA3.1-BMP4表达载体转染成纤维细胞,后检测BMP4基因在mRNA和蛋白水平上表达量的变化。结果显示:pcDNA3.1-BMP4构建成功后转染成纤维细胞BMP4基因的mRNA和蛋白表达量均显著上升,且转染组的表达量极显著地高于对照组(P0.01)。成功构建了敖汉细毛羊BMP4基因的质粒,并且成功转染成纤维细胞,基因在细胞中过表达,结果可为进一步研究其功能奠定基础。     

乙醇酸氧化酶基因植物表达载体构建及转化苹果的研究

为了研究GO基因在植物中的功能,获得转基因植株,用限制性内切酶将乙醇酸氧化酶(GO)基因从克隆载体pBSSP5上切下,连接到植物双元表达载体pBin117的CaMV 35S启动子和NOS 终止子之间,成功构建了GO基因植物表达载体pBinGO.在此基础上以嘎拉苹果叶片为受体,通过根癌农杆菌介导法将GO基因导入苹果,获得了2个抗性芽,PCR检测初步表明GO基因已整合到嘎拉苹果基因组中.     

转Bt-CpTI-GNA基因棉花的研究

采用农杆菌介导法将外源三价抗虫基因(Bt-CpTI-GNA)导入常规棉花品种中,获得转基因再生株,分子检测表明外源基因已在棉花体内表达,并遗传给后代材料。PCR分子检测与转化的标记基因和外源目的基因抗性三者极有规律性。其所携带的基因在转基因棉花中有分离现象,这可能是外源基因整合到受体棉株体内“基因沉默”而引起所致。     

转植酸酶基因玉米phyA2基因标准质粒分子构建及其检测应用

质粒分子以其良好的适应性被较多地用作转基因标准材料的替代品。本文根据转植酸酶基因玉米phyA2基因设计引物与探针,并构建了一种包含phyA2基因片段(243 bp)和内标基因片段(178 bp)的质粒分子pPZ。选取不同转基因模板DNA作用于phyA2特异性引物,PCR结果显示只有转植酸酶基因玉米出现131 bp的目的条带;选取不同转基因作物检测体系作用于质粒分子pPZ,只有以pPZ DNA为模板时出现目的条带(131 bp和88 bp)。同时采用pPZ质粒分子和转基因玉米阳性基因组DNA为标准对4个转植酸酶基因玉米混合样品(3.0%、1.0%、0.5%和0.1%)进行定量检测,t检验表明,2种标准产生的斜率、线性相关系数和定值结果没有显著差异。这些结果表明,pPZ质粒分子可以作为转植酸酶基因玉米替代品用于定性和定量检测。     

Mini-Ti质粒在农杆菌菌株间的转移

用农杆菌介导法将外源基因导入植物是植物遗传转化的一种首选方法。为了获得较高的转化率,往往需要选择对转化目标植物敏感的农杆菌菌株。本实验利用冻融法将农杆菌LBA4404/pCG-Ⅱ中的目的片段转移到农杆菌EHA105中,通过PCR扩增、斑点杂交和测序,证明了农杆菌LBA4404/pCG-Ⅱ中的目的片段已成功转移到农杆菌EHA105中。利用该方法更换农杆菌菌株,可满足不同植物对不同农杆菌菌株的要求。     

玉米淀粉分支酶SBEIIb基因遗传转化玉米自交系的研究

以玉米自交系丹黄25为试材,用农杆菌介导法将玉米淀粉分支酶SBEIIb基因转入玉米中,探讨了农杆菌介导玉米愈伤组织转化的影响因素.结果表明:愈伤组织经过9d的继代,菌液中乙酰丁香酮(AS)浓度为10 mg/L,侵染时间为20 min,共培养60 h为最佳转化条件.获得的4株再生植株经PCR分析鉴定,其中3株表现阳性,证...     

转Cry1Ab-Ma基因抗虫玉米植株的获得及其后代分析

本研究使用In-Fusion TM试剂盒构建植物表达载体p TF101.1-P35S::Cry1Ab-Ma,以玉米杂交种HiⅡ幼胚为受体材料,采用农杆菌介导法将P35S驱动的抗虫基因Cry1Ab-Ma基因转入玉米,经双丙氨膦筛选后的抗性愈伤分化出43株玉米幼苗,经目的基因PCR及表达蛋白检测,其中的28株呈阳性。T1代植株叶片蛋白粗提物经Cry1Ab免疫试纸条检测,结果表明目的基因表现出分离,在部分转基因植株后代中获得了表达。本研究为培育优良的抗虫玉米自交系奠定了基础。     

水稻OsAAA1基因超表达载体构建及遗传转化

为了构建带Flag标签的OsAAA₁超表达载体,获得阳性转基因植株并分析其OsAAA₁基因表达情况。以日本晴的cDNA为模板,将OsAAA₁克隆至pU1301-Flag载体;重组质粒通过PCR、酶切及测序鉴定正确后,以农杆菌为介导进行遗传转化至日本晴;转基因植株通过分子鉴定正确后,采用Real-time PCR检测OsAAA₁基因的mRNA表达水平变化。成功构建了OsAAA₁-pU1301-Flag重组载体;遗传转化后获得33株转基因植株;通过分子鉴定筛选出26株阳性转基因植株;荧光定量PCR结果分析发现23株阳性转基因植株OsAAA₁基因的表达出现不同程度上调。与日本晴相比,有8株表达量达到30倍以上,其中有5株表达量超过40倍。成功构建了带Flag标签的OsAAA₁超表达载体;遗传转化结果表明OsAAA₁-Flag能整合到日本晴的基因组DNA中,从而使OsAAA₁基因的表达水平增加。本研究为后续通过Flag标签,在水稻植物体内直接挖掘与OsAAA₁互作的功能蛋白奠定了基础。     

棉花αccD基因植物表达载体的构建与遗传转化的研究

转基因烟草植株.T1代转基因拟南芥和转基因烟草植株经卡那霉素检测、PCR、RT-PCR检测后,初步表明目的基因已在植株中转化成功,并可以正常转录.     

棉花accD基因植物表达载体的构建与遗传转化的研究

摘要：乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化脂肪酸合成的第一步,是脂肪酸合成的限速酶。本研究采用PCR方法分别从陆地棉和拟南芥基因组中扩增出ACCase羧基转移酶β-CT亚基编码基因accD,ACCase羧基转移酶α-CT亚基编码基因CAC3的定位于叶绿体的转运肽序列。将CAC3基因转运肽序列与accD基因进行体外重组,构建融合植物表达载体pBI-CAC3tp-accD。重组质粒通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101。渗透法转化拟南芥,收种子,在含卡那霉素的MS培养基中发芽筛选。用叶盘法转化烟草,经不定芽诱导、生根培养,获转基因烟草植株。T1代转基因拟南芥和转基因烟草植株经卡那霉素检测、PCR、RT-PCR检测后,初步表明目的基因已在植株中转化成功,并可以正常转录。     

上西早生柿ETR5基因RNAi植物表达载体构建及遗传转化研究

据已测序的上西早生柿ETR5基因序列,设计了2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个ETR5-Uenishiwase基因片段。2个片段经单酶切消化后连接成反向互补的大片断。连接片断经双酶切消化后,定向连接到植物表达载体pSMAK321的35S启动子和NOS终止子之间,构建成Uenishiwase-ETR5基因的RNA干扰植物表达载体。载体质粒经酶切鉴定正确后通过冻融法转入根癌农杆菌EHA101中。以上西柿组培苗叶片为外植体,优化遗传转化体系,结果表明:农杆菌重悬液和共培养基中均添加200μmol/L的AS及Spc梯度筛选能有效提高转化率。转化植株经PCR检测得到7株阳性植株。     

紫花苜蓿LEA蛋白基因ihpRNA表达载体构建及烟草转化

根据紫花苜蓿LEA蛋白MsLEA3-1基因(GenBank登录号： EU665182)序列,设计两对含有酶切位点的特异性引物LEAf1/ LEAf2和LEAr1/ LEAr2,以构建好的PMD-LEA质粒为模板,分别合成用于构建干扰载体的正反义片段pMD-F和pMD-R,将正反义片段分别插入表达载体pART27的相应位置,构建成含有发夹结构的RNAi载体pART-F-R,经过Not I酶切鉴定,证明载体构建成功。通过农杆菌介导的方法,以干扰表达载体pART-F-R转化烟草,经过PCR检测,得到16株阳性转基因植株,为MsLEA3-1基因的功能研究奠定基础。     

番茄中SlHB8植物超表达载体构建及遗传转化

SlHB8属于HD-ZipⅢ转录因子家族,通过分析番茄已有的RNA-seq数据,发现SlHB8可能对单性结实的形成具有一定的调控作用。为了研究SlHB8对番茄单性结实形成的生物学功能,本研究利用Gateway克隆技术,通过SlHB8的同义突变SlHB8Ris的miR165/166识别位点来构建该基因的植物超表达载体。通过农杆菌介导法对番茄进行遗传转化,PCR检测鉴定阳性转化植株,对T0代阳性植株进行qRT-PCR表达量分析,结果表明阳性转化植株中SlHB8基因的表达量均有不同程度的提高,从而为阐明SlHB8基因的生物学功能提供了一定的理论参考。     

ProDH基因反义表达载体的遗传转化

利用农杆菌介导的叶盘法将ProDH基因反义表达载体分别导入番茄品种‘耐运2000’和烟草中,建立并优化了番茄子叶再生体系。同时采用操作简单、再生周期短、转化效率较高的烟草进行了遗传转化体系的建立。试验获得49个烟草抗性芽和177个番茄抗性芽,用特异性引物对其做PCR扩增验证,共获得9个PCR呈阳性的抗性芽,其中7个烟草抗性芽、2个番茄抗性芽,因此证明外源基因已成功转入番茄的基因组中,为进一步番茄转基因工程的研究奠定基础。     

大豆GmMYB12B2植物表达载体的构建及转化烟草

为研究大豆MYB转录因子-GmMYB12B2在转基因植物类黄酮代谢中的作用,利用吉林大学植物种质资源与利用研究室前期克隆的GmMYB12B2基因,以PPZP质粒为表达载体,构建了由组成型CaMV35S启动子驱动GmMYB12B2基因的植物表达载体PPZP-GmMYB12B2;然后,采用冻融法转入农杆菌EHA105菌株,通过叶盘法对烟草进行遗传转化。经PCR随机扩增鉴定9株转基因烟草,其中有6株是阳性植株,初步证明已获得转大豆GmMYB12B2基因的烟草。     

烟草叶绿体转化载体的构建及转基因植株的获得

选择烟草叶绿体基因组同源片段ｒｐ１２－ｔｒｎＨ－ｐｓｈｂＡ和ｔｒｎＫ－ＯＲＦ５０９Ａ,及ａａｄＡ抗壮观霉素基因,构建烟草叶绿体转化载体ｐＴＲＺ,制备ｐＴＲＺＤＮＡ金粉子弹,通过基因枪轰击烟草幼苗叶片,经壮观霉素筛选获得了愈伤组织和转化再生植株,对烟草叶绿体转化植株进行ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析,结果证明其中Ｎｏ１３,１６,２３为整入了外源ａａｄＡ的叶绿体转基植株,同时其子代呈现壮观霉素抗性ａａＤ