新城疫病毒分离株融合蛋白基因的遗传变异分析

根据GenBank中报道的NDV融合蛋白基因(F)序列,设计了一对特异性引物,用该引物对所分离的LN-SN株进行了RT-PCR扩增;将扩增得到的PCR片段纯化后与pGEM-T连接得到重组质粒pGEM-F,用于核苷酸序列测定。结果该基因ORF长1662bp,编码553个氨基酸;将LN-SN毒株与GenBank中已报道的NDV毒株进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在83.1%～98.9%之间,推导的F蛋白氨基酸序列的同源性在88.1%～99.5%之间。     

东北地区不同宿主NDV的分离鉴定与系统发育进化分析

针对我国东北地区获得高免新城疫（Newcastle Disease，ND）抗体鸡群仍然发生新城疲（ND）的情况，应用分子流行病学技术。对所分离的18株鸡菲新城疲病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）和1株鸽源NDV进行系统发育进化分析。将NDV分离株通过差速离心纯化．以SDS-蛋白酶K（或Trizol法）提取病毒RNA，RT—PCR扩增其融合蛋白（F）基因532bp或280bp关键片断，经回收克隆到pMD 18-T载体上进行核苷酸序列测定（GenBank序列号：AY208680-AY208698）。核苷酸和氧基酸序列进行同源性比较，结果表明各毒株之间核苷酸同源性为83．1％-100％，氨基酸同源性为85．5％-100％；系统发育进化时分析显示．其中JL-12、HLJ-3为弱毒株．与疫苗株V4同属于基因Ⅰ型；其余17株均为强毒袜．其中HLJ-4、JL-14为Ⅵ型，其余15株均为基因Ⅶ型，由此可见东北地区目前新城疲的流行是由3种不同基因型的NDV毒珠（Ⅰ型、Ⅵ型、Ⅶ型）所发．但以基因Ⅶ型为主．速与我国其他地区和世界上其他国家ND的流行情况趋于一致。     

东北地区不同宿主NDV的分离鉴定与系统发育进化分析

针对我国东北地区获得高免新城疫(NewcastleDisease,ND)抗体鸡群仍然发生新城疫(ND)的情况,应用分子流行病学技术,对所分离的18株鸡源新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus,NDV)和1株鸽源NDV进行系统发育进化分析。将NDV分离株通过差速离心纯化,以SDS-蛋白酶K(或Trizol法)提取病毒RNA,RT-PCR扩增其融合蛋白(F)基因532bp或280bp关键片断,经回收克隆到pMD18-T载体上进行核苷酸序列测定(GenBank序列号:AY208680-AY208698)。核苷酸和氨基酸序列进行同源性比较,结果表明各毒株之间核苷酸同源性为83.1%～100%,氨基酸同源性为85.5%～100%;系统发育进化树分析显示,其中JL-12、HLJ-3为弱毒株,与疫苗株V4同属于基因Ⅰ型;其余17株均为强毒株,其中HLJ-4、JL-14为Ⅵ型,其余15株均为基因Ⅶ型,由此可见东北地区目前新城疫的流行是由3种不同基因型的NDV毒珠(Ⅰ型、Ⅵ型、Ⅶ型)所发,但以基因Ⅶ型为主,这与我国其他地区和世界上其他国家ND的流行情况趋于一致。     

6株水产动物源气单胞菌安徽分离株的毒力基因的克隆与序列分析

根据气单胞菌主要黏附素基因（ahal）、溶血素基因（hly）和细胞兴奋性肠毒素基因（alt）完整开放阅读框（0RF）设计3对特异性引物，对6株气单胞菌安徽分离株进行ahal、hly和alt基因的PCR扩增、克隆和测序。测序结果显示，安徽分离株aim、hly和alt基因的ORF大小分别为1056--1068bp、1482bp和1104N1107bp，各编码351-355、493和367-368个氨基酸。序列分析显示：（1）属于alt^＋aim^＋hly^＋毒力基因型的3个安徽分离株间aha1核苷酸序列和推测的氨基酸序列同源性均很高，分别为98.8％-99．3％和97％-97．6％，且与国内参考株mh／Trionyx sinensis／Guangzhou（Guangdong）／AF276639的同源性高达98．5％-99％和96.8％-97．6％。而alt^＋ahal^＋hly^-HA6安徽分离株与国外参考株Ah／Fish／Barcelona（Spain）／AF183931间的核苷酸序列和氨基酸序列同源性较高，分别为95.8％和97．2％。（2）不同表型种气单胞菌安徽分离株之间及其与国内外其他分离株之间的hly核苷酸序列和推测的氨基酸序列同源性均较高，分别介于88．4％-100％之间和90.8％-98．7％之间。（3）5个安徽分离株（RA16、CA1、HA6、HA7和GA1）之间及其与惟一参考株之间的alt核苷酸序列和推测的氨基酸序列同源性分别高达93．5％-99．9％和80．2％-98．3％，但与BA17分离株间的核苷酸序列同源性（81．6％-81．7％）和推测的氨基酸序列同源性（77．5％-84．9％）均较低。这些结果表明，气单胞菌ahal和alt基因在不同毒力基因型间存在一定差异性，hly基因在不同表型种间存在较高保守性，该基因可作为研制气单胞菌基因工程亚单位疫苗的候选成分。     

斜带石斑神经坏死病毒外壳蛋白基因克隆与序列分析

从患病毒性神经坏死病的斜带石斑鱼(Epinephelus coioids)的头部提取总RNA，根据已发表的神经坏死病毒外壳蛋白基因设计引物进行RT-PCR扩增，得到预期大小的基因片段。将此基因片段转入pET载体进行序列测定和分析，结果表明：编码斜带石斑神经坏死病毒(Orange-spoued grouper nervous necrosis virus，OGNNV)外壳蛋白基因的阅读框核苷酸数为1017bp，编码338个氨基酸；基因的核苷酸序列与野田村病毒科(Nodaviridae)的几种病毒的外壳蛋白基因序列比较结果显示，该病毒与p野田村病毒属(Betanodavirus)中的赤点石斑神经坏死病毒(red-spotted grouper nervous necrosis virus，RGNNV)的同源性最高(99％)，说明该病毒株是RGNNY血清型的成员。     

WSSV-VAP1基因克隆与序列分析

根据已测序的WSSV-VAP1全基因序列设计1对引物，经PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳分析，扩增出约838bp的特异条带，将其回收后克隆入pGAPZα-A载体中，并进行序列测定与分析。结果表明，扩增序列与GeneBank登录序列(GenBank No．AF41634)核苷酸同源性100％。序列分析表明，WSSV-VAP1基因编码蛋白无跨膜区域，有多个蛋白激酶C、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和糖基化位点，并含有RGD序列，预示其为WSSV浸染中的一个重要蛋白。     

禽多杀性巴氏杆菌PlpB基因交叉保护力研究

根据报道的PM70菌株的PlpB基因序列,设计PlpB基因一对寡核苷酸引物。以C48-1菌株为实验材料,成功扩增PlpB基因的全序列,该片段共831bp。将扩增基因插入原核表达载体pGEX-KG,成功构建了重组表达质粒pKG-PlpB,并对pKG-PlpB重组表达质粒进行序列测定,结果表明:扩增序列与GenBank上所报道的PM70株的PlpB基因序列核苷酸同源性在99%以上。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经诱导获得大小约56KDa的表达蛋白。Western blot检测表明,该表达蛋白具有良好的反应原性。     

广东佛山地区鸭圆环病毒分子流行株遗传变异分析

目的 研究广东佛山地区鸭圆环病毒(DuCV)流行毒株的遗传变异情况。方法 采用常规PCR方法，对采自广东佛山的3份阳性鸭组织样品中扩增Rep基因部分片段和Cap基因，进行核苷酸序列测序，并将Rep基因部分片段、Cap基因推导的氨基酸序列与30株参考序列进行同源性比较和遗传变化分析。结果 3份阳性样品分别扩增出相应的基因片段；Rep基因部分片段、Cap基因推导的氨基酸序列进化树和同源性分析显示，3株DuCV流行株与台湾株(AY3947213)在同一进化支，均属于DuCV-2型，与同分支的参考毒株相似性分别为97.2%～100%和96.9%～100%,2个基因型中Rep基因同源性高于Cap基因；氨基酸序列的变异分析表明，与中国台湾株(AY3947213)相比较，Rep部分氨基酸和Cap氨基酸分别发生相同位置的氨基酸置换和单独突变，Cap氨基酸突变位点多于Rep氨基酸。结论 研究测得的3株DuCV流行株均属于DuCV-2型，在广东地区有一定范围的流行，且CAP蛋白的变异程度高于REP蛋白，为鸭圆环病毒感染的监控和诊断提供了依据。     

虎纹蛙病毒主要衣壳蛋白基因的克隆及其序列

从新分离感染虎纹蛙的病毒培养细胞中提取病毒DNA作模板，用分别对应于蛙病毒－3型（FV3）主要衣壳蛋白（Major Capsid Protein,MCP）基因读码框两侧的寡核苷酸片段作引物进行PCR扩增，得到预期大小基因片段，进一步将此基因片段插入到pGEM-T载体中，进行全长片段的序列测定和分析。结果表明，编码虎纹蛙病毒的MCP基因的读码框核苷酸数为1392bp，编码463个氨基酸；基因的核苷酸序列与其他脊椎动物虹彩病毒的MCP基因序列比较结果显示，该病毒与蛙病毒属的FV3的同源性（98％)明显高于囊肿病毒属的FLDV－1（52％），并且与虹彩病毒科其他成员的MCP基因序列均有所不同，说明该病毒株是虹彩病毒科蛙病毒属的新成员。     

猪圆环病毒2型分离株的基因组克隆、序列测定与分析

设计合成两对覆盖PCV2基因组奎长的引物，对PCV2分离株S2、P11、L进行全基因测序。将所测序列与GenBank上已公布的PCV2毒株序列进行同泺性比较，并绘制系统发育进化树。结果显示。所测毒株与其它地城的24株PCV2分离株的基因组序列同源性很高。3个分离株之问的奎基因核苷酸同源性在95.4％-99.3％。序列分析表明欧洲分离株和美洲分离株分别构成PCV2的两个夫的分支：欧洲系和美洲系。S2、P11属于欧洲系，L属于美洲系。     

热应激对剑尾鱼HSP70家族两成员基因表达的影响

采用RT-PCR方法扩增实验动物剑尾鱼（Xiphopohorus helleri）纯系RR-B的HSP70家族两个成员的eDNA片段，并将其克隆到PMD18-T载体中测序，将测序结果与GenBank中的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行同源性比较。同时利用RT-PCR半定量方法研究热应激时两个成员在剑尾鱼组织中的表达。通过克隆获得了剑尾鱼的HSP70家族两个新成员的cDNA片段，两序列均包含HSP70家族的特征性签名序列和热休克蛋白的定位序列；通过对克隆片段与已发表的青锵（Oryzias latipes）等鱼类HSP70的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列同源性比较，发现核苷酸序列同源性较高，成员一和成员二分别为85％-89％和82％-99％；氨基酸序列同源性更高，成员一和成员二分别为97％-99％和93％-99％。一般条件下，两成员在剑尾鱼肝脏、脾脏、肾脏和心脏中不表达，但热应激能刺激成员一在剑尾鱼脾脏中表达，成员二在肝脏、脾脏、肾脏和心脏中强烈表达，并可能在参与热应激保护方面起更大作用。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS的克隆与序列分析

根据已发表的外膜蛋白基因ompⅡ的核苷酸序列设计引物，从分离 自患红底板病的中华鳖的嗜水气单胞菌中扩增得到了ompTS基因，对ompTS 基因进行序列分析，发现其与ompⅡ基因的核苷酸序列有83.5%的同源性。ompTS基因最长的开放阅读框（ORF）为1068nt，编码由355个氨基酸组成，分子量为38.9kDa的蛋白质OmpTS，其氨基酸序列的前20个氨基酸残基可能组成信号肽。由ompTS基因的编码氨基酸序列与其它细菌外膜蛋白的氨基酸序列的比较结果，进一步证实细菌外膜蛋白氨基酸序列的N端存在高度保守区。根据序列分析结果推测，ompTS基因很可能是一个新的基因，编码38.9kDa的嗜水气单胞菌外膜蛋白OmpTS，该蛋白质在膜中极有可能形成孔道，具备与孔蛋白相似的性质。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SCQ株的分离鉴定

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）病毒属动脉炎病毒科动脉炎病毒属，是引起母猪繁殖障碍的重要病原之一。本研究以出现繁殖障碍的母猪并通过ELISA检测为抗体阳性者的血清为材料，于2000年首次从重庆地区分离出PRRS病毒。母猪血清接种Marc-145单层细胞，经盲传至第四代时出现典型的细胞痛变效应（CPE）；细胞培养物经电镜观察，发现其中有球形的病毒粒子，粒子大小为40～80nm，核心直径为20-40nm；病毒TCID50为10—4．46／0．05mL；用抗PRRSV特异性抗体能特异地中和病毒，中和指数为100，并将该地方分离株命名为PRRSV—SCQ株。根据Genbank中PRRSV北美洲株ATCC VR-2332的序列设计一对特异性引物，以PRRS V—SCQ RNA为模板，通过RT—PCR扩增其GP5基因片段．并将该片段插入克隆载体pMD18一T的EcoRV住点；测序结果表明该GP5基因序列与PRRSV—VR2332、LV株的GP5基因核苷酸序列同源性分别为99．34％和62．14％，GP5蛋白氨基酸推导序列的同源性分别为97．51％和54．37％，揭示SCQ地方分离株与VR2332株在基因型上更为接近，应属于美洲型。     

草鱼Mx蛋白基因的克隆与原核表达

根据已报道的Mx蛋白cDNA序列设计合成特异引物，应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，从草鱼呼肠孤病毒(GCRV)诱导的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝脏总RNA中扩增获得Mx蛋白cDNA，回收纯化后克隆到pGEM-T Easy Vector系统的T载体上。重组子的序列分析表明：所克隆的Mx蛋白cDNA长722bp，编码240个氨基酸，包括1个三联GTP结合区域和1个发动蛋白(dynamin)族特征的序列。与已知鱼类Mx蛋白基因序列比较表明，草鱼Mx蛋白基因序列与其它鱼类Mx基因相应序列具有较高的同源性，其中与斑马鱼Mx蛋白E型基因碱基序列比较同源性最高，为87．1％。将此基因改造后定向克隆至原核表达质粒pBV220，构建成重组草鱼Mx蛋白基因表达质粒pBVgcMx，并在大肠杆菌中获得高效表达，重组草鱼Mx蛋白的表达量占菌体总蛋白的26．6％。Q-sephrose FF层析柱分离纯化的重组草鱼Mx蛋白纯度达95．6％。     

WSSV-VP39基因克隆与结构分析

根据已公布的WSSV-VP39全基因序列(GenBank No.AAL89161)设计1对引物,经PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳分析,扩增出约898bp的特异条带,将其回收后克隆入pGAPZα-A载体中,并进行序列测定与分析。结果表明,扩增序列与Gene Bank登录序列(GenBank No.AAl89161)核苷酸同源性100%。序列分析表明,WSSV-VP39基因编码蛋白无跨膜区域,有多个蛋白激酶C、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和酪氨酸硫酸化位点,1个糖基化位点。蛋白序列比对结果表明,WSSV-VP39与WSSV-VP37具有较高的同源性,其在WSSV侵染中的作用值得关注。     

猪圆环病毒2型分离株的基因组克隆、序列测定与分析

设计合成两对覆盖PCV2基因组全长的引物,对PCV2分离株S2、P11、L进行全基因测序。将所测序列与GenBank上已公布的PCV2毒株序列进行同源性比较,并绘制系统发育进化树。结果显示,所测毒株与其它地域的24株PCV2分离株的基因组序列同源性很高。3个分离株之间的全基因核苷酸同源性在95.4%～99.3%。序列分析表明欧洲分离株和美洲分离株分别构成PCV2的两个大的分支:欧洲系和美洲系。S2、P11属于欧洲系,L属于美洲系。     

嗜水气单胞菌J-1株丝氨酸蛋白酶基因克隆与序列分析

根据已发表的气单胞菌胞外蛋白酶基因核苷酸序列，设计和合成了一对引物，以嗜水气单胞菌AhJ—1的基因组DNA为模板，通过PCR技术，扩增到约900bp的丝氨酸蛋白酶基因片段，并克隆到质粒载体pGEM—T中进行测序和分析，结果表明扩增的丝氨酸蛋白酶基因片段与已发表的嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶Ahe2的同源性有87％，扩增片段编码343个氨基酸，推测的分子量为35700，计算机软件分析表明编码的氨基酸有较高的抗原性，可作为核酸疫苗的侯选基因片段。     

重庆5个地区PRRSV ORF7基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR方法,对来自重庆合川、长寿、綦江、大足、开县等5个区县的5个猪场的PRRS病料进行了ORF7基因的扩增,并克隆、测序和序列比对。结果发现,这5株与美洲型代表毒株VR-2332的核苷酸序列同源性为98.5%,其推导的氨基酸序列同源性为92.6%;与已发表的ORF7序列CQ0703、JX0602、HB0602比对,核苷酸同源性为99.6%,其推导的氨基酸同源性为98.0%;与疫苗株RespPRRSMLV核苷酸同源性为98.6%,氨基酸同源性为94.3%,与欧洲型代表株LV株ORF7基因序列差异较大,核苷酸同源性仅有56.6%,而且推导的氨基酸数比LV株少5个,二者同源性仅为58.1%。结果表明5个区县流行的PRRSV与VR-2332和RespPRRSMLV亲缘关系很近,均为美洲型毒株。     

罗非鱼嗜水气单胞菌气溶素毒素基因的克隆及功能分析

根据已发表的嗜水气单胞菌气溶素(Aer)毒素基因的序列,设计1对特异性引物,应用PCR技术,扩增GXL3、GXL5、GXL9共3株罗非鱼嗜水气单胞菌的气溶素成熟蛋白基因,克隆到pMD18-T载体上进行序列测定.测序结果表明,3个菌株Aer毒素成熟蛋白的核苷酸序列为1 335bp,编码445个氨基酸,其与分离株No.BAA83088的成熟蛋白基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为90.9%、91.4%、91.4%和96.2%、96.6%、96.6%,具有很高的同源性.应用分子生物软件分析广西分离株GXL9 Aer成熟蛋白,该蛋白无跨膜区,拥有较多的疏水区和抗原位点,等电点为5.5.     

二倍体泥鳅线粒体细胞色素b基因的序列分析

对二倍体泥鳅的线粒体细胞色素b基因进行PCR扩增和正反测序，在5个个体中均得到序列一致的细胞色素b基因片断，长度为1140bp，A、T、G、C含量分别为313（28％）、358（31％）、170（15％）、300（26％），A＋T〉C＋G，与其他水生动物相同基因片段碱基序列含量相似，该基因中密码子第1位核苷酸中4种碱基组成较为均衡；第2位核苷酸中T的使用率较高，为33．4％，G的使用率较低，为17．1％；密码子第3位A的使用率高，为34．2％，而G的使用率较低，仅为7．9％；由泥鳅细胞色素b基因片断推导出对应的氨基酸序列，在氨基酸序列中Leu占11．％，远高于其他氨基酸。