AHL内酯酶在蜡状芽胞杆菌中可增强ZwA抗软腐病作用

双效菌素(Zwittermicin A, ZwA)是一种广谱、新型的抗生素，对很多植物病原菌具有抑制作用；酰基高丝氨酸内酯酶(AHL内酯酶)通过降解植物病原菌群体感应（Quorum-Sensing）系统的信号分子，减弱致病基因的表达从而达到抗病的效果。结合这两种物质的不同抗病机理，本研究将来自苏云金芽胞杆菌中的AHL内酯酶基因导入到ZwA产量不同的蜡状芽胞杆菌中，得到相应的重组菌株。实验表明，AHL内酯酶基因在重组菌中可正常表达，并且不影响受体菌ZwA的表达和产量；感病实验证明，同时表达ZwA和AHL内酯酶的重组菌对于胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯所引起的病害的抗病效果比单独含产ZwA或AHL内酯酶的蜡状芽胞杆菌的抗病效果有明显增强。说明结合ZwA和AHL内酯酶的不同抗病机理来提高抗病效果是可行的。     

酰基高丝氨酸内酯酶在蜡状芽胞杆菌中可增强双效菌素抗软腐病

双效菌素(zwittermicin A,ZwA)是一种广谱、新型的抗生素,对很多植物病原菌具有抑制作用;酰基高丝氨酸内酯酶(AHL)通过降解植物病原菌群体感应(quorum-sensing)系统的信号分子,减弱致病基因的表达从而达到抗病的效果。结合这两种物质的不同抗病机理,将来自苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)中的AHL基因导入到蜡状芽胞杆菌(B.cereus)中,得到相应的重组菌株。实验表明,AHL基因在重组菌中可正常表达,并且不影响受体菌ZwA的表达和产量;感病实验证明,同时表达ZwA和AHL的重组菌对于胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)感染马铃薯(Solanum tuberosum)所引起的病害的抗病效果比单独含产ZwA或AHL的蜡状芽胞杆菌的抗病效果有明显增强。说明结合ZwA和AHL的不同抗病机理来提高抗病效果是可行的。     

苏云金芽胞杆菌类ABC transporter基因zwa-FEG能提高双效菌素的抗性

双效菌素(zwittermicin A,ZwA)是一种氨基多元醇类新型广谱抗生素,zmaR为其抗性基因。在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)YBT-1520菌株ZwA合成基因簇末端存在一个类似ABC transporter的序列(命名为zwa-FEG)。将zwa-FEG基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达,大肠杆菌能获得ZwA的抗性;将zwa-FEG转移到产ZwA的蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)菌株UW85中,能使其ZwA产量显著提高。推测zwa-FEG是一种ZwA专一性的ABC transporter,它能将ZwA分泌到胞外,从而增强ZwA的合成和ZwA的抗性。     

玉米根际土壤芽胞杆菌的多样性

为了解玉米(Zea mays)不同品种根际芽胞杆菌种群多样性信息,本研究采用稀释平板法,对10个玉米品种根际的芽胞杆菌进行了分离,并对其进行16S r RNA序列分析。结果表明,从10个玉米品种根际共分离到69个形态差异的芽胞杆菌菌株;16S r RNA序列分析表明,69个菌株鉴定为23个种,归属于3个属,芽胞杆菌属(Bacillus)、赖氨酸芽胞杆菌属(Lysinibacillus)和嗜冷芽胞杆菌属(Psychrobacillus),其中芽胞杆菌属的种类和数量最多。玉米不同品种根际的芽胞杆菌的种类数量不同,QB662×QB2219和QB1013×QB446根际分离到的芽胞杆菌种类最多,均为8种;J106×QB572的芽胞杆菌菌落含量最高。玉米根际的优势种群主要为嗜气芽胞杆菌(B.aerophilus)、阿氏芽胞杆菌(B.aryabhattai)、简单芽胞杆菌(B.simplex)和苏云金芽胞杆菌(B.thuringiensis),其他芽胞杆菌种类仅在一种或少数的玉米品种出现。QB662×QB2219根际的芽胞杆菌种类香农-威纳(Shannon-Wiener)指数(H)最大;QB948×QB48根际的芽胞杆菌种群香农-威纳多样性指数次之,但均匀度指数最高;J106×QB572的多样性指数和均匀度指数皆最低。菌株FJAT-17411、FJAT-17472、FJAT-17430和FJAT-17442与Gen Bank中已报道16S r RNA基因序列的相似性为97%~98%,可能为芽胞杆菌的新种。本研究结果表明,玉米根际具有较为丰富的芽胞杆菌种群多样性,并存在一些潜在的新的微生物菌种资源。本研究对芽胞杆菌资源的开发和利用提供良好的实验材料和理论基础。     

多粘类芽胞杆菌菌株M-1启动子片段的克隆及绿色荧光蛋白的表达

应用启动子探针载体pECE7,从多粘类芽胞杆菌（Panebacillus polymyxa）菌株M-1基因组克隆到一系列启动子活性片段,通过氯霉素（chloramphenicol chloromycetin,Cm）浓度梯度筛选出Cm抗性较强的3个片段。将这3个具有启动子活性的片段与来自GFP表达载体pGFP78的gfpmut3a基因插入Escherichiacoli-Bacillus穿梭载体pHY300PLY中,获得GFP表达载体pGFP5,pGFP8和pGFP17。通过热激转化E.coliDH5α,荧光显微镜下观察到明亮的绿色荧光,表明筛选到的启动子片段具有良好的启动外源基因gfp转录的功能。同时利用此表达载体标记本实验筛选得到的生防蜡样芽胞杆菌（Bacilluscereus）菌株B905,获得了GFP标记的工程菌Bacillus cereus B905（gfp-5、gfp-8和gfp-17）,通过荧光显微镜观察,发现转入GFP表达载体pGFP5和pGFP8后,菌体有明亮的绿色荧光,而转入pGFP17的菌体荧光相对较弱。     

鸿雁线粒体DNA全基因组序列测定及分析

线粒体基因组(mitochondrial genome,mt DNA)具有进化速率快、多态性丰富、无重组、母系遗传等特点,是开展群体遗传学、系统发育学、分子生态学、分类学等研究的理想分子标记。本研究根据鸿雁(Anser cygnoides)同属近缘物种豆雁(Anser fabalis)线粒体全基因组序列(EU009397.1)设计引物,采用直接测序技术对鸿雁线粒体基因组全序列进行了综合分析,结果显示,鸿雁线粒体基因组序列(Gen Bank登录号:KJ124555)全长16 739 bp,包含22个t RNA、2个r RNA基因、13种蛋白质编码基因和一个D-loop区。碱基组成T占22.49%,C占32.24%,A占30.21%,G占15.06%,无明显的AT偏好性。22种t RNA都为典型的三叶草结构,参照原鸡(Gallus gallus)、黑尾地鸦(Podoces hendersoni)的12Sr RNA,对鸿雁12Sr RNA的二级结构进行了预测,含有4个结构域、37个茎环和13个突出部。对D-loop控制区序列分析发现,含有LSP/HSP、ETAS1-2、Goose hairpin、E-box、F-box、D-box、C-box、Bird similarity-box、CSB1-box、CSB-like和OH。以原鸡作为外群,采用邻接法(N-J)和最大拟然法(ML)算法以及贝叶斯法,基于线粒体基因组全序列分别构建系统进化树,结果显示,鸿雁与灰雁(Anser anser)、豆雁(Anser fabalis)、白额雁(Anser albifrons)和加拿大黑雁(Branta canadensis)处于一个分支,亲缘关系较近。该研究结果丰富了鸭科线粒体基因组全序列,为研究鸿雁的系统发生和分子进化研究以及种质资源保护和合理利用提供新的基础资料。     

蜡状芽孢杆菌抗重金属性能及对镉的累积

所研究的蜡状芽孢杆菌RC可以在镉浓度为200mg·L-1的固体培养基平板上生长良好,表明菌株具有强抗镉的能力。该菌株在液体培养基中Cd2＋、Cr3＋、Pb2＋浓度均为75mg·L-1和Mn2＋浓度为100mg·L-1培养时,菌株生长正常。在重金属Cr3＋、Pb2＋、Mn2＋存在时,采用红外光谱与原子吸收光谱分析菌株对Cd2＋的积累,结果表明,培养基中其他重金属离子的加入,会影响菌株对Cd2＋的积累率;当Cr3＋存在时,Cr3＋可以增加细胞壁上有效官能团活性,明显提高RC菌体对Cd2＋的积累率,而其他重金属组合对Cd2＋吸附积累能力影响不大;RC细胞壁上活性基团-OH、-NH-、-COOH、-PO34-和-M-O（O-M-O）活跃参与Cr3＋、Pb2＋、Mn2＋和Cd2＋多种重金属离子的络合作用。通过高温和十二烷基硫酸钠处理菌株进行质粒消除试验,未发现该菌株的抗镉性质与抗性质粒的存在相关。     

两株蜡状芽孢杆菌对毒死蜱的降解动力学研究

利用微生物消除农药污染是一项安全、经济、有效的方法,降解动力学模型的构建有助于理解污染物的生物降解行为和估测系统中特征污染物的浓度变化,菌株对高浓度污染物的降解效果是降解菌在受污染水体中实际应用的关键。本研究采用基础培养基中定量添加毒死蜱和定时取样分析毒死蜱残留浓度的方法,探讨两株蜡状芽孢杆菌(HY-1和HY-2)的接种体培养时间、接种量和降解菌对毒死蜱的降解动力学,同时研究了降解菌对高浓度毒死蜱的降解率。结果表明:HY-1和HY-2最适接种体培养时间分别为10 h和19 h,接种体培养时间对菌株降解毒死蜱的影响较大。两菌株最适接菌量为8%(v/v),接种量从4%增至8%时,接种量对HY-1降解毒死蜱的影响大于HY-2。当毒死蜱的初始浓度为40 mg.L 1、80 mg.L 1、100 mg.L 1和120 mg.L 1时,一级动力学方程ln(C0/Ct)=kt可以用来拟合两菌株对毒死蜱的降解动力学及确定降解动力学参数,当毒死蜱初始浓度再次增加时,仅HY-2对毒死蜱的降解符合一级动力学方程。当毒死蜱初始浓度为40~120 mg.L 1时,菌株HY-1对毒死蜱的降解速率常数分布在0.013 5~0.015 7;当毒死蜱初始浓度为40~200 mg.L 1时,菌株HY-2的降解速率常数分布在0.008 0~0.015 3。菌株HY-2比HY-1可以在较高的毒死蜱浓度下发挥降解作用,且降解率较高。因此,两菌株在毒死蜱污染水体的净化去毒方面具有重要意义。     

利用苏云金芽胞杆菌非芽胞特异性的启动子表达cry1Ac10和cry1C基因

利用重叠延伸ＰＣＲ技术,将苏云金芽胞特异性的ｃｒｙ３Ａ基因的启动子替换ｃｒｙ１Ａｃ１０和ｃｒｙ１Ｃ基因的启动子序列,并用ｃｒｙ１Ａｃ１０基因的终止序列,替换ｃｒｙ１Ｃ基因终止密友子下淳的序列,得到改造的ｃｒｙ１Ａｃ１０和ｃｒｙ１Ｃ基因,改免与其内源杀虫晶体蛋白基因竞争转录因子（σ因子）从而提高杀虫晶体蛋白的表达量,为构建高效杀虫工程菌提供了有效的基因。     

胶质芽胞杆菌及其突变株生理特性的初步研究

本文对经过筛选培育出的分解硅酸盐能力较强的胶质芽胞杆菌突变株 UV0 9K及抗高温、耐酸碱菌株 p Ht10 K的生理特性进行了研究。其中 ,最佳氮源为麦麸汁 ,与出发菌株相比 ,分解硅酸盐能力分别提高 164%、12 .7%。最佳碳源为葡萄糖 ,与出发菌株相比 ,产酸能力分别提高2 60 %、155%。金属离子、培养温度、p H、气 /液比等也对突变株的生长有一定影响。其结果可作为选定工业化条件的参考。     

枯草芽孢杆菌群β-甘露聚糖酶基因克隆及同源性分析

本文对33株枯草芽孢杆菌群菌株进行β-甘露聚糖酶活性筛选,其中的32株具有β-甘露聚糖酶活性,只有1株无β-甘露聚糖酶活性。通过基因克隆测序的方法获得33株枯草芽孢杆菌群菌株β-甘露聚糖酶基因编码区全序列,对酶基因进行同源性分析并构建系统发育树;在β-甘露聚糖酶基因系统发育树中,33株枯草芽孢杆菌群菌株聚为3个分支,分别是枯草芽孢杆菌分支、地衣芽孢杆菌分支和解淀粉芽孢杆菌分支;枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌β-甘露聚糖酶基因种内同源性大于91％,而种间同源性为60％～69％。     

蜡状芽孢杆菌HY-1降解甲基对硫磷和毒死蜱的影响因素研究

采用富集驯化培养和紫外分光光度计定量的方法,从农药生产企业的废水处理系统中分离筛选出1株能够降解甲基对硫磷和毒死蜱的蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus）HY-1,并系统研究了影响其降解甲基对硫磷和毒死蜱的主要因素。研究表明,菌株HY-1能够利用甲基对硫磷和毒死蜱为唯一磷源降解农药。HY-1降解甲基对硫磷的适宜条件为：培养温度30～35℃,pH为6～8,甲基对硫磷初始浓度为10～50mg·L^-1,接种量20%（体积比,菌体密度：稀释到菌悬母液（OD600=3.0）的0.8～1倍）,添加葡萄糖不能促进菌株对甲基对硫磷的降解。HY-1降解毒死蜱的适宜条件为：葡萄糖浓度6g·L^-1,培养温度30～35℃,pH为7.0,毒死蜱初始浓度80～200mg·L^-1,接种量20%（体积比,菌体密度：稀释到菌悬母液（OD600=3.0）的0.8～1倍）。结果表明,HY-1菌株降解甲基对硫磷和毒死蜱的适宜条件相类似,只是降解所需的最适葡萄糖浓度和底物浓度不同。     

蜡样芽孢杆菌ATCC14579毒力基因plcR缺失株的构建及其一般特性

蜡样芽孢杆菌是土壤中的优势菌,具有作为益生菌的潜在能力,同时它也是条件致病菌,能引起食物中毒等。蜡样芽孢杆菌的多种毒力因子受到多效性调控子（pleiotropic regulator,plcR）的调控,在其条件致病性作用中起着重要作用。真养产碱杆菌JMP34（Alcaligenes eutrophus）质粒上的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D）单加氧酶（tfdA）基因可以降解2,4-D。本研究利用同源重组技术使tfdA基因置换掉蜡样芽孢杆菌的plcR基因,构建了蜡样芽孢杆菌ATCC14579突变株B.cereus△plcRΩtf-dA,并对其毒性、一般生理生化特性进行分析。研究结果表明,突变株B.cereus△plcRΩtfdA的毒性显著减弱;生理生化实验结果显示突变株与野生株并没有明显区别,且突变株并没有表现出tfdA酶活性。所有的结果表明plcR控制着蜡样芽孢杆菌ATCC14579的致病性,同时剔除plcR并不破坏其酶系统。本研究为今后构建蜡样芽孢杆菌工程菌提供了新的思路和依据。     

Bt cry I A(c)杀虫基因向棉花内生细菌Bacillus cereus染色体中整合的研究

将来自Bacillusthuringiensis subsp.kurstaki的BtcryIA(c)杀虫基因通过综合质粒载体pBC601,整合到棉花(Gossypium hirsutum)优势内生细菌Bacillusceieus(Bc9002)的染色体上,得到的工程菌对棉铃虫(Helicoverpa armigera Hb.)有杀虫活性.此综合质粒含有能在营养期表达Btcry IA(c)基因的强启动子、cryIA纠杀虫基因、四环素抗性标记基因tet'、8.0kb的EcoRI-NcoIB.ceieus染色体片段.将综合质粒通过电击导入B.cereus(Bc9002)中,综合质粒因含B.cereus染色体片段,可与B. cereus染色体发生同源重组,从而将BtcryIA(c)基因整合到B.cereus的染色体上.通过对转化子的DNA酶切分析、PCR扩增、SDS-PAGE凝胶电泳检测、ELISA检测、电镜观察、毒力测定,结果表明Btcry IA(c)基因已经整合到内生细菌Bc9002的染色体上,并可高效表达.     

蜡样芽孢杆菌及其生物被膜对有机酸及乙醇的抗性比较

为比较蜡样芽孢杆菌及其生物被膜对环境压力的抗性,该文主要研究了4种有机酸（乙酸、柠檬酸、乳酸和苹果酸）和乙醇对蜡样芽孢杆菌及其生物被膜存活率的影响。结果表明：生物被膜态蜡样芽孢杆菌对乙酸的抗性高于浮游态菌。扫描电镜结果显示,经乙酸处理后,浮游态蜡样芽孢杆菌的细胞表面严重受损,而生物被膜态菌的表面形态未发生明显变化。在柠檬酸、乳酸、苹果酸和乙醇存在的条件下,生物被膜态蜡样芽孢杆菌比浮游态菌表现出更强的压力抗性,特别是在高浓度（有机酸16%～20%,乙醇50%～60%）的情况下,该现象尤为显著。因此,在食品工业中控制被膜态蜡样芽孢杆菌对预防和阻止食品腐败非常重要。该研究结果为实际生产中有效控制蜡样芽孢杆菌及其生物被膜的形成提供参考。     

高静压对蜡样芽孢杆菌的致死与损伤效应

本试验采用响应曲面法的Box-Behnken设计,研究了高静压处理对蜡样芽孢杆菌生命活动的影响。结果表明压力处理导致了蜡样芽孢杆菌的致死作用与损伤效应。利用Design Expert软件建立了致死率的响应模型,Y=62.8+27.2x1+7.3x2+3.2x3+1.0x21+2.6x22+1.0x23-2.0x1x2-1.0x1x3-0.7x2x3。方差分析表明模型达到极显著水平,模型的系数显著性检验提示压力、温度、时间以及压力与温度的交互作用对致死率有显著影响。试验还运用VITEK细菌鉴定方法快速检测了蜡样芽孢杆菌压致生理生化损伤,结果证明压力导致菌体对外界营养分子利用以及药物敏感性等方面的特性发生了改变。     

青枯病生防菌蜡状芽孢杆菌（ANTI-8098A）的绿色荧光蛋白基因（gfp）转导及其生物学特性的变化

采用质粒pCM20进行青枯病生防菌蜡状芽孢杆菌(Bacillus ceFeus,ANTI-8098A)的电击转化,对电击转化条件的优化结果表明,当电击条件为2.5 kV,200Ω,25μF时,转化的最佳条件为质粒DNA含量118 ng,感受态细胞浓度为1.14×108CFU/mL.转化子ANTI-8098A:pCM20在无红霉素选择压力的LB培养基转接16次后,绿色荧光的表达仍为100%.对其生长曲线的测定结果表明,青枯病生防菌ANTI-8098A的生长速度和ANTI-8098A:pCM20基本一致.不同培养温度和培养转速对ANTI-8098A:pCM20生长的影响较大,当培养温度为35℃时,ANTI-8098A:pCM20的含量为60.0×108 CFU/mL,当培养转速为250 r/min时,ANTI-8098A:pCM20的含菌量为50.33×108CFU/mL.青枯病生防菌ANT18098A:pCM20和ANT18098A对不同作物分离的青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)具有明显的抑制作用,抑菌效果无显著差异.     

苏云金芽孢杆菌基因组研究概况

迄今为止,全球已有2个Bt株菌株完成了全基因组测序,1个Bt菌株正在拼接中,15个Bt菌株正在进行测序中。已有22个晚质粒完成了全序列测定。助是作为生物农药使用最广泛的微生物菌株,也是最为成功地将其杀虫晶体蛋白基因应用于植物转基因的微生物。在基因组进化、新基因发现、基因表达调控等方面一直是科学家研究的热点,并取得了相当多的成果。本文概述了苏云金芽孢杆菌基因组测序现状、基因组特征及比较基因学等方面的研究进展。