大白菜BrWRKY33基因上游调控序列的克隆及其功能研究

根据大白菜EST和基因组序列,利用PCR技术从大白菜品种龙白二号（Brassica rapa subp.pekinensis cv.LongbaiⅡ）基因组中克隆转录因子基因BrWRKY33起始密码子上游大小1755bp的调控序列。然后,构建5＇端缺失突变体,与gus基因融合,构建植物表达载体。将载体转化拟南芥（Arabidopsis thaliana）哥伦比亚生态型（Columbia ecotype）,进行植物组织GUS化学染色分析。结果表明,BrWRKY33密码子上游-1755～-315区域存在的多个W-box元件可能与该基因表达的负调控相关,-315bp区域含有BrWRKY33基因转录必需的基本元件。对接种软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora subsp.carotovora）后不同时期的植株进行染色,发现该病原菌侵染使转基因植株gus基因表达量增加,表明BrWRKY33基因在植物对软腐病抗性反应中具有一定的作用。     

含两种抗真菌基因植物表达载体的构建

近年来,植物抗真菌病害基因工程研究日益受到重视．并取得了显著进展,目前主要是通过转几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因来提高这两种酶在植物体内的表达水平,以此增强抗真菌病害的能力。体外抑菌实验表明：β-1,3-葡聚糖酶能够抑制某些真菌的生长,而一旦与几丁质酶共同作用时,其抑菌作用会大大增强。本实验将几丁质酶和葡聚糖酶     

橡胶树hbYKt基因植物表达载体构建及亚细胞定位

SNAREs（soluble-N-ethyl-maleimide-sensitive factor attachment protein receptor,可溶性N-乙基马来亚酰胺敏感因子附着蛋白受体）参与囊泡运输,在植物中具有非常广泛和重要的生物学功能。我们从橡胶树胶乳消减cDNA文库中筛选获得橡胶树的SNARE基因,命名为hbYKt。为进一步研究该基因功能,构建了以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）为报告基因的融合植物表达栽体pCAMBIAl304h-bYKt,通过农杆菌介导法分别转化洋葱表皮细胞和烟草表皮细胞。荧光显微镜检测结果表明hbYKt定位在洋葱表皮细胞和烟草表皮细胞的细胞质膜中。     

植物表达载体构建和转基因烟草抗除草剂及耐盐性的分析*

利用基因重组,将来自于拟南芥（Arabidopsis thaliana)的发生单个碱基突变的als基因插入含有AtNHXI1基因的质粒pCAMBIA1300中,由CaMV35S启动子分别启动AtNHX1和als的表达,得到了兼有除草剂抗性基因和耐盐相关基因的植物表达载体。用烟草叶盘转化法获得了转基因植株。Southern杂交检测表明,外源基因已经整合到烟草(Nicotiana tobacum)基因组中。抗性测定发现,转基因植株除草剂抗性至少提高了1000倍,而耐盐性提高了约1．0％NaCl浓度,即带有同样启动子的不同外源基因赋予转基因植株的抗性程度有明显差异。     

酿酒酵母耐铜基因CUP1的克隆及其植物表达载体的构建

酿酒酵母铜金属硫蛋白（ｃｏｐｐｅｒ ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ,Ｃｕ－ＭＴ）,属于第Ⅱ型金属硫蛋白,Ｃｕ－ＭＴ由酿酒酵母耐铜基因ＣＵＰ１编码,由６１个氨基酸残基组成,其中半胱氨酸残基１３个,占Ｃｕ－ＭＴ总氨基酸数的２１．３％,Ｃｕ－ＭＴ与铜离子有较强的结合力,在酵母细胞中主要参与过量铜的解毒作用。本研究通过ＰＣＲ方法,从酵母基因组ＤＮＡ中扩增出了ＣＵＰ１基因,克隆于ｐＵＣ１９的多克隆拉点。扩增     

转录因子DREB1A基因的克隆及植物表达载体的构建

研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用。根据GenBank中登录的DREB1A基因的序列设计引物,用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因,利用基因重组技术成功构建了植物表达载体pCAMB1A1300-DREB1A。该结果为进一步利用DREB1A基因做遗传转化研究奠定了基础。     

多选择标记植物表达载体的构建

具有多选择标记的植物基因表达载体有利于转基因植物研究中的转基因植株的筛选。本研究对植物基因表达载体pCAMBIA1301进行了改造,产生了1个具有可溶性的红移绿色荧光蛋白基因（smRS-GFP）、抗除草剂Basta、葡萄糖苷酸酶（GUS）及潮霉素（Hpt）的多选择标记的新的植物基因表达载体。运用这一表达载体的多选择标记可以有效降低检测和筛选转化植株时的假阳性率。此外,如此的基因表达载体也能满足实验室的不同筛选方法的需求。     

Col生态型拟南芥AP3基因启动子克隆及植物表达载体构建

隶属于MADS-Box基因家族的拟南芥花器官B类特征基因APETALA3（AP3）在花瓣和雄蕊中特异性地表达;AP3基因编码转录因子,与A类和C类特征基因协同作用控制双子叶植物花瓣和雄蕊的发育。研究表明AP3基因启动子为花特异表达启动子。因此,AP3基因启动子的克隆及功能鉴定对于园林植物与花相关的商业性状的定向改良具有重要作用。本文根据GenBank数据库报道的Ler生态型拟南芥（Arabidopsis thaliana）AP3基因启动子序列（U30729）设计了一对特异性扩增引物,基于PCR技术,用高保真的KOD-plusDNA聚合酶扩增了长度为1767bp的Col生态型拟南芥AP3基因启动子,并命名为pAtAP3,其Gen-Bank登录号为FJ619533。Bl2seq在线分析表明pAtAP3与U30729序列的相似性达98%,与Col生态型拟南芥BAC克隆T12E18（AL132971）9264~11030之间的碱基序列相似性达100%,且该段序列的下游基因编码AP3蛋白（CAB81799）,说明克隆序列为Col生态型拟南芥AP3基因的启动子。PLACE在线分析表明pAtAP3具有基本的启动子元件TATA-box和CAAT-box,还包含大量与花特异表达相关的顺式元件CArG1、CArG2、CArG3和anther-box等。本试验进一步构建了植物表达载体pAtAP3：：GUS,为该启动子的功能鉴定奠定了基础。     

新抗菌素防治大白菜软腐病试验初报

应用新抗菌素618防治大白菜软腐病的田间试验,结果表明:618发酵液对大白菜软腐病有一定的防治效果,其中开盘期喷施的防病效果为65.5％,开盘后10天喷施一次的防病效果为53.6％,而喷施二次的防病效果可达82.3％。     

用EST—SSR分子标记技术构建大白菜核心种质及其指纹图谱库

摘要利用EST-SSR分子标记对大白菜种质资源基因库中686份样品所代表的1900份大白菜种质资源进行分析研究。构建大白菜种质资源的核心种质并且形成核心种质的EST—SSR指纹图谱库。结果表明利用4组鉴定白菜品种的EST—SSR的特异性标记组合,获得近158个EST—SSR多态的标记,对大白菜种质资源基因库中686份样品所代表的1900份大白菜种质资源进行核心种质的构建提供了分析数据。形成的核心种质包括168份样品,占库存资源的8．8％,它的多态位点百分率保持了原群体的100％。所构建的核心种质涵盖了原资源的绝大部分区域来源的品种,包含了早、中、晚熟品种中所有典型的大白菜类型和其相关的特征特性。并进一步进行了核心种质资源遗传多样性分析。核心种质的EST—SSR指纹图谱库中,每一份样品的指纹都是唯一的,为登记、评价、整理、分发、繁殖等种质资源库的管理和育种者对其材料的利用提供了重要的有价值的信息。EST-SSR标记组合是构建中国大白菜核心种质及其指纹图谱的经济、高效的方法。     

Molybdenum Affects Photosynthesis and Ionic Homeostasis of Chinese Cabbage under Salinity Stress

A pot trial was conducted to clarify the effects of molybdenum (Mo) on photosynthesis and ionic homeostasis of Chinese cabbage under salinity stress. Mo was applied at three levels (0, 0.15, 0.3 mg kg^?1). Ten days after sowing, 500 ml of 0.8% of NaCl solution was added to half of the plants for each treatment every 10th day for three consecutive times. The results revealed that fresh weight was significantly increased by application of Mo under salt stress; contents of chlorophyll a, chlorophyll b, carotene, and total chlorophyll were all raised by application of Mo; photosynthesis rate was enhanced by nonstomatal factors by application of Mo; and the ratios of potassium/sodium ions (K⁺/Na⁺), calcium/sodium ions (Ca²⁺/Na⁺), and magnesium/sodium ions (Mg²⁺/Na⁺) were all increased by application of Mo under salt stress. The study suggests that the application of Mo enhances salinity stress tolerance in Chinese cabbage by increasing the photosynthesis rate and the ionic homeostasis adjustment.     

菜心BrcuFCA基因的克隆与表达分析

本文以菜心（Brassica campestris L.ssp.chinensis（L.）Makino var.utilis）为实验材料,比较了Trizol法、改进Trizol法及改良SDS法提取菜心总RNA的效果。结果表明改进Trizol法集中了操作简单、耗时短、所需试剂种类少,且完整性好,产量和纯度均高等多重优点,成为提取菜心总RNA首选方案。同时文章以甘蓝型油菜及其它物种的FCA保守区设计引物,将质量高的菜心总RNA反转录合成cDNA,通过RT-PCR从菜心的早、晚熟品种中均克隆得到与开花有关的基因片段,将之命名为BrcuFCA,片段长1001bp,GenBank登录号为EU700363,与甘蓝型油菜及拟南芥FCA氨基酸同源性分别达到了98%和82%。另一方面,本研究还利用半定量RT-PCR研究了BrcuFCA不同时空表达特性,并结合已发表的开花调控遗传途径中两个关键基因BrcuFLC和BrcuFRI时空表达特性研究结果,推测菜心主要的抽薹开花途径不是春化和FRI-依赖途径,而很可能是自主开花途径。本研究为菜心抽薹开花分子机理的研究提供理论依据。     

结球白菜带柄子叶外植体不定芽离体再生能力的遗传分析

解析控制植物不定芽离体再生能力的遗传因素,有助于从根本上提高离体培养困难材料的不定芽再生能力,是植物基因工程遗传改良的基础。本研究以结球白菜4个纯合亲本及其杂交后代的带柄子叶为外植体,建立了高频率离体不定芽再生技术。据此我们还对白菜不定芽再生能力进行遗传分析,并开展亲本与后代杂种的离体培养及反应研究,包括对培养基的激素需求,不定芽形成频率,不定芽形成数量,芽形态等系列特征。研究结果表明,杂种与亲本在培养基的激素浓度上有类似需求;杂交后代的不定芽再生率均至少高于一方亲本,在一些组合中可以高于双亲;在适宜的杂交组合及培养条件下,结球白菜带柄子叶外植体的不定芽再生率可以达100％,每一外植体上的不定芽数达3～7个。方差分析表明,结球白菜的不定芽离体再生能力存在基因的加性效应。     

大白菜-结球甘蓝易位系AT4系列抽薹相关基因表达差异的cDNA-AFLP分析

抽薹开花时间是大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)的重要性状,未熟抽薹直接影响大白菜的产量和品质.本研究以添加结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)4号染色体片段的大白菜-结球甘蓝易位系AT4系列为材料,结合抽薹性鉴定,获得了45株耐抽薹和15株易抽薹植株;利用cDNA-扩增片段长度多态性(cDNA-amplified fragment length polymorphism,cDNA-AFLP)技术,对不同春化处理的耐抽薹和易抽薹植株叶片差异表达片段进行分离,获得了126条与抽薹性相关的差异表达条带,这些差异包括条带的有无和表达量的差异;通过差异条带回收、克隆和测序,获得了74条差异表达序列.同源性比对结果表明,61条差异表达序列具有同源序列,其中41条差异表达序列功能预测涉及代谢、能量、细胞物质运输、信号转导、表达调控、DNA修饰、细胞周期等,20条差异表达序列功能未知;13条在NCBI中找不到同源序列,可能是一些新基因.本研究获得了耐抽薹大白菜-结球甘蓝易位系,为耐抽薹大白菜新品种的培育提供新材料;同时获得了耐抽薹和易抽薹材料间的差异表达序列,为获得影响大白菜抽薹性的关键基因,揭示大白菜抽薹开花机制提供支撑.     

大白菜InDels标记开发及其在剩余杂合体鉴定中的应用

大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)参考基因组序列的公布及测序成本的降低为大规模开发插入/缺失(Insertion/Deletion,InDel)标记提供了可能.本研究以性状差异明显的大白菜自交系He102与06-247为亲本,开展了全基因组重测序、标记开发和验证工作.二者测序深度分别为10×和8×,经筛选共获得330 218个InDels差异位点,出现频率为1.2个/kb,其中有11 238个差异位点位于编码区,包括5 184个差异基因,每个基因平均包含2.2个差异位点.分别以He102与06-247测序数据中筛选出的多态性InDels位点为参照,从10条染色体上随机选择933个位点进行了PCR扩增及电泳检测验证.结果表明,测序深度对假阳性率有直接影响,以测序较深的材料中筛选到的差异位点为参照,其验证结果的假阳性率亦较高,反之则较低.本研究中以He102与06-247为参照选择InDels位点验证的平均假阳性率分别是51.9％和22.5％.从933个位点中共筛选出593个在亲本之间实际表现为多态性的位点,这些差异位点中有375个位于编码区,是潜在的功能性标记.利用上述差异位点,检测了He102与06-247衍生的F7代重组自交系群体,明确了F7代各株系在593个位点的纯/杂合状态,为利用剩余杂合株系精细解析和精准定位大白菜耐抽薹、抗病毒、抗干烧心等重要农艺性状奠定了基础.     

油菜叶绿体多顺反子定点整合表达载体的构建

根据拟南芥叶绿体基因组序列设计PCR引物,从我国甘蓝型油菜栽培品种F4叶绿体基因组中克隆了长度为1.5kb的trnI和trnA2个基因序列,核酸序列分析表明它们与拟南芥基因的同源性高达94%和99%,这两个克隆的油菜叶绿体基因组序列trnI和trnA被用于构建叶绿体定点整合表达载体。利用烟草叶绿体基因强启动子Prrn和终止子TpsbA,以及筛选标记基因aadA和目的基因HSA,构建了多顺反子表达盒Prrn-aadA-HSA-TpsbA,将表达盒置于油菜叶绿体trnI和trnA序列之间,最后构建成油菜叶绿体多顺反子定点整合表达载体pIPaHTA。酶切鉴定及序列分析证实,构建的表达载体具有预期的调控元件及结构,这为后期油菜叶绿体转化体系的建立奠定了基础。     

EuFPS基因表达载体构建及对杜仲遗传转化的研究

本实验用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切植物表达载体pSH737和含有目的基因的pUC-FPS,定向连接得到重组质粒pSH-FPS,将其导入农杆菌EHA105。采用农杆菌介导法对杜仲进行遗传转化,研究了卡那霉素(kanamycin,Km)浓度、预培养时间、菌液浓度及侵染时间、乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)浓度、共培养时间等对杜仲遗传转化效率的影响。结果表明,选择无菌苗苗龄15d的杜仲下胚轴,卡那霉素浓度50mg/L,农杆菌浓度OD600值0.3~0.6,侵染时间8min,侵染时菌体重悬液中添加50μmol/L乙酰丁香酮,共培养时间3d,抗性芽的获得率最高。对再生植株进行GUS检测发现有45%的植株呈阳性。     

Impact of molybdenum on Chinese cabbage response to selenium in solution culture

Molybdenum (Mo) and selenium (Se) are both essential micronutrients for animals and humans. Increasing Mo and Se contents in food crops offers an effective approach to reduce Mo and Se deficiency problems. A hydroponic trial was conducted to investigate the interactions of Mo and Se on uptake, transfer factors (TF _shoot ) as well as distribution coefficients (DC) of Mo and Se on Chinese cabbage (Brassica campestris L. ssp. Pekinensis). In Experiment 1 three concentrations of Mo (0.01, 0.1 and 1?mg?L^?1) and four concentrations of Se (0, 0.01, 0.1 and 1?mg?L^?1) were arranged with a randomized block design. In Experiment 2, there were three treatments, 0.1?mg?L^?1 Mo, 0.1?mg?L^?1 Se and a combination of 0.1?mg?L^?1 Mo?+?0.1?mg?L^?1 Se. Experiment 1 showed that Se decreased Mo concentrations in shoots and roots. The impact of Mo on Chinese cabbage response to uptake of Se varied, depending on whether the root Se concentration was saturated or not; Experiment 2 showed that there is a strong antagonism between Mo and Se on nutrition uptake when Mo and Se deficiencies persist for long periods; Mo and Se were easily translocated from solution to plants and from roots to shoots. The results will also be of help in cultivating Mo-enriched and Se-enriched crops.