在板栗疫病菌线粒体中检出低毒病毒编码蛋白p29

p29蛋白是低毒病毒基因组编码的一个木瓜蛋白酶样蛋白。前人研究发现,在宿主板栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）体内表达p29,会引起真菌毒力降低,色素产生减少,丧失产生无性孢子的能力。除已知p29与源于高尔基体的膜结构共分离之外,p29在细胞内的其它分布形式未明。本研究在成功制备p29特异抗体和高效分离板栗疫病菌线粒体的基础上,尝试用p29抗体检测线粒体中是否存在p29蛋白。Western印迹结果表明,受CHV1-EP713感染的EP713菌株线粒体中存在与p29抗体特异作用的病毒蛋白。本研究结果暗示,低毒病毒蛋白p29可能参与调控宿主线粒体功能。     

低毒病毒及板栗疫病菌低毒力机制

低毒病毒是一类存在于板栗疫病菌细胞质中自主复制的无衣壳正链RNA病毒。感染低毒病毒后,板栗疫病菌的致病力显著降低,色素分泌减少,菌丝体由感染病毒前的桔黄色变为白色,产孢量降低或不产孢,漆酶表达水平明显下降。低毒病毒侵染性克隆的获得以及高效转化和转染体系的建立,使得低毒病毒成为目前唯一可以进行全面遗传操作的真菌病毒。利用低毒病毒作为探针来探测板栗疫病菌的致病力组成和毒力调节机制,己获得了一些很有意义的发现。本文介绍近几年低毒病毒及其与真菌相互作用的研究进展,包括低毒病毒的基因组和功能基因研究、低毒病毒和线粒体损害引起的板栗疫病菌低毒力机制、板栗疫病菌的RNA沉默系统以及低毒病毒抗RNA沉默的机制。低毒病毒／板栗疫病菌系统已经成为研究病毒与宿主相互作用以及病原真菌致病机理的很好的模式系统。     

低毒病毒-板栗疫病菌系统作为抗正链RNA病毒化合物筛选模型的研究

板栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）是引起板栗疫病的病原真菌。低毒病毒是一类侵染板栗疫病菌的无衣壳正链RNA病毒。无病毒栗疫病菌野生型菌株在PDA培养基上形成桔黄色菌落,而带毒株在则形成白色菌落。本研究利用已知的不同机制的抗病毒药物处理无病毒和感染病毒的板栗疫病菌菌株,观察菌丝体颜色变化并检测菌丝体中病毒双链RNA（dsRNA）的含量。结果显示,抗病毒药物处理后,带毒株系EP721和Euro7的菌丝体颜色表型发生明显变化,且病毒dsRNA累积量与菌丝体颜色变化存在明显相关性：随着药物浓度增大,菌丝体颜色加深,病毒dsRNA积累量下降。因此,可以根据菌株颜色的变化判断药物对病毒复制或症状表现是否有效,从而极大简化抗RNA病毒药物的初步筛选过程。     

大规模板栗疫病菌cDNA文库的特征和冗余序列的排除

低毒病毒/板栗疫病菌是一个研究病毒宿主相互作用的优良的实验系统.为了更好的了解病毒与宿主相互作用的机制,我们建立了一个野生型无病毒板栗疫病菌菌株EP155和受低毒病毒感染的菌株EP713的cDNA混和文库,以进行表达序列标签（EST）测定.对543个克隆的外源片段的分析表明,该文库克隆中含外源片段的比例为89.8%;通过小规模测序,发现空质粒与小片段克隆占测序总数的10.1%;表达丰度最高的4个克隆出现次数的总和占测序总数的9.6%.通过设计引物进行PCR和原位杂交,对cDNA文库2万多个克隆进行了筛选,共筛除了占总数19.7%的空质粒与小克隆和5.5%的高丰度克隆,为高效率的大规模EST测序准备了条件.     

板栗疫病菌低毒力遗传转化株LC的构建

低毒病毒—板栗疫病菌组合是研究病毒—宿主相互作用的模式系统之一。通过构建含板栗疫病菌低毒病毒CHV1-EP713的全长cDNA和苯菌灵抗性基因的表达质粒pXB3F2,并用于转化野生型无毒株EP155,获得了以苯菌灵抗性为筛选标记、具有dsRNA病毒再生能力的低毒力遗传转化株LC,为深入研究病毒—真核宿主相互作用的分子机制提供了新的研究材料。     

利用cryparin基因的启动子构建板栗疫病菌高效表达载体

低毒病毒／板栗疫病菌是研究植物病原菌致病机理和病毒与宿主相互作用的一个优秀模式系统。本研究克隆了板栗疫病菌转录水平最高的crypari凡基因的启动子,并构建了由该启动子控制的表达载体。构建的载体能成功表达GFP蛋白。利用该载体表达积累量较高的CHV1-Eur07病毒的病毒量控制基因,能提高细胞内CHV1-EP721的积累量,反式互补效率从常用的gpd启动子控制的低于10％提高至67％和80％。高效表达载体的成功构建,为研究板栗疫病菌功能基因以及低毒病毒与宿主板栗疫病菌的相互作用提供了新的工具。     

同源片段大小对板栗疫病菌同源重组频率的影响

低毒病毒／板栗疫病菌系统是一个具有独特优点的、崭新的研究病毒与宿主相互作用的模型系统。以同源重组为基础的基因打靶是研究基因功能和病毒与宿主相互作用分子机制的重要手段。为了研究在板栗疫病菌同源重组遗传操作中同源片段大小对同源重组频率的影响，利用一段5．4kb板栗疫病菌染色体DNA序列，构建了以潮霉素抗性基因为遗传转化筛选标记的3个同源双交换片段以及3个同源单交换质粒，分别转化板栗疫病菌EPl55原生质体，检测筛选同源重组转化子并计算发生同源重组频率。结果表明，在板栗疫病菌中3个同源双交换片段FHA1（1．7～2.0kb）、FHA2（1.0～1.2kb）和FHA3（0.5kb）的同源重组频率分别为3．73％、2。06％和0；3个同源单交换质粒pFHl（1．76kb）、pFH2（1．23kb）和pFH3（O．54kb）的同源重组频率分别为0.95％、0和0。这些结果为板栗疫病菌同源重组遗传操作中同源片段大小的设计提供了依据。     

同源片段大小对板栗疫病菌同源重组频率的影响

低毒病毒/板栗疫病菌系统是一个具有独特优点的、崭新的研究病毒与宿主相互作用的模型系统.以同源重组为基础的基因打靶是研究基因功能和病毒与宿主相互作用分子机制的重要手段.为了研究在板栗疫病菌同源重组遗传操作中同源片段大小对同源重组频率的影响,利用一段5.4 kb板栗疫病菌染色体DNA序列,构建了以潮霉素抗性基因为遗传转化筛选标记的3个同源双交换片段以及3个同源单交换质粒,分别转化板栗疫病菌EP155原生质体,检测筛选同源重组转化子并计算发生同源重组频率.结果表明,在板栗疫病菌中3个同源双交换片段FHA1 (1.7～2.0 kb)、FHA2 (1.0～1.2 kb)和FHA3 (0.5 kb)的同源重组频率分别为3.73% 、2.06%和0;3个同源单交换质粒pFH1 (1.76 kb)、pFH2 (1.23 kb)和pFH3(0.54 kb)的同源重组频率分别为0.95% 、0和0.这些结果为板栗疫病菌同源重组遗传操作中同源片段大小的设计提供了依据.     

板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光蛋白共定位载体的构建

低毒病毒-板栗疫病菌组合是研究病毒与宿主相互作用的一个优秀的模式系统。我们构建了含绿色荧光蛋白基因gfp的载体pCPXHY2GFP与含红色荧光蛋白基因rfp的载体pCPXG418RFP,并用于转化野生型菌株EP155,获得了以潮霉素为筛选标记、表达绿色荧光蛋白的转化株pCPXHY2GFP/EP155和以G418为筛选标记、表达红色荧光蛋白的转化株pCPXG418RFP/EP155。将载体pCPXG418RFP转化pCPXHY2GFP/EP155,获得的转化株能观察到绿色荧光蛋白与红色荧光蛋白共定位的现象。板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光共定位载体pCPXHY2GFP与pCPXG418RFP的构建,为深入研究病毒与宿主相互作用的分子机制提供了强有力的研究材料。     

一种用于板栗疫病菌基因打靶系统的新型抗性筛选标记

板栗疫病菌是研究病原真菌的模式物种之一。目前应用于板栗疫病菌遗传转化的筛选标记有潮霉素、苯菌灵和G418抗性基因。随着板栗疫病菌致病分子机理研究的深入,需要更多的遗传筛选标记用于多重基因的遗传转化分析。本研究通过融合PCR技术,成功利用博莱霉素抗性基因Bleor进行了板栗疫病菌高丰度分泌表达基因的打靶实验,证实了Bleor作为板栗疫病菌基因筛选标记的可行性。     

同时测定食品中维生素B_1和维生素B_2的高效液相色谱方法

介绍了高效液相色谱法同时测定维生素Ｂ１和维生素Ｂ２的方法，该方法色谱条件为μＢｏｎｄｐａｋＣ（１８）柱；甲醇／水４０／６０（Ｖ／Ｖ）为流动相，流速为０．８ｍＬ／ｍｉｎ；采用荧光检测器（λ（Ｅｘ）＝３６５ｎｍ，λ（Ｅｍ）＝４２５ｎｍ）．维生素Ｂ１和维生素Ｂ２的平均回收率分别为９５．５０％和９５．８２％，变异系数分别为０．３７％和０．４８％．该方法具有简单、省时、干扰小等优点，并有较高的灵敏度、准确度和宽的应用范围。     

牛病毒性腹泻病毒E2结构蛋白的原核表达、纯化及鉴定

根据GenBank中已发表的牛病毒性腹泻病毒囊膜糖蛋白E2基因设计1对特异性引物,以Oregon CV24株为模板,PCR扩增目的片断后与pET-32a原核表达载体连接,转化大肠杆菌Transetta（DE3）感受态细胞,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物,结果表明重组E2蛋白在体外得到较好表达,表达的融合蛋白分子量为57.7 ku。可溶性分析表明重组E2蛋白以包涵体的形式存在,经镍柱His标签蛋白纯化后进行western-blot检测。结果表明：E2重组蛋白均具有反应原性,能与BVDV的阳性血清进行反应。     

基于液质联用技术的坛紫菜甘油-3-磷酸胁迫响应分析

甘油-3-磷酸作为渗透压调节物红藻糖苷的合成前体物,参与藻类抗逆应答过程。为了解坛紫菜的抗逆机制,通过超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC-MS)建立甘油-3-磷酸的定量分析方法,分析非生物(温度、盐度和干出)胁迫下的甘油-3-磷酸响应规律。结果表明,温度胁迫1 h后,甘油-3-磷酸的含量快速变化,当温度高于23℃时,甘油-3-磷酸含量与胁迫温度成正比,而在12℃低温下,甘油-3-磷酸的含量反而下降;盐度胁迫促使甘油-3-磷酸的含量快速上升,且高盐胁迫下的变化显著高于低盐环境;而短时间1 h干出胁迫后的甘油-3-磷酸含量略有上升(1.19倍,与对照组相比),但随着干出时间继续延长,甘油-3-磷酸含量总体呈现下降趋势。温度、盐度和干出胁迫后的坛紫菜进行恢复培养后,甘油-3-磷酸含量均趋于对照组水平。综上可知,甘油-3-磷酸可快速响应环境胁迫,这为坛紫菜红藻糖苷抗逆机制的多层次研究奠定了基础。     

穿心莲内酯超临界CO2重结晶工艺初探

采用单因素实验法探讨超临界CO₂重结晶压力、温度、时间对穿心莲内酯的纯度和结晶率的影响，并借助扫描电镜进行晶体形貌考察，利用高效液相色谱仪进行纯度检测。结果表明，采用超临界CO₂重结晶技术得到的穿心莲内酯晶体形貌更加细小，并呈絮状分布在结晶板上；选择较佳纯化工艺参数为重结晶压力14 MPa，温度55℃，时间60 min，CO₂流量20 L/min时，得到的穿心莲内酯纯度达90%以上，结晶率超过45%。     

猪细小病毒VP2蛋白主要抗原域在毕赤酵母中的表达及鉴定

猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是一自主型细小病毒(Autonomous parvovirus),它是引起母猪繁殖障碍的主要因素之一。目前国内外的诊断方法多以全病毒为抗原,存在很大的局限性,而重组蛋白无感染性,易于生产和纯化。因此用重组蛋白来检测猪细小病中抗体水平对于猪细小病的防     

Optimization and modeling of glyphosate biodegradation by a novel Comamonas odontotermitis P2 through response surface methodology

Glyphosate is an important organophosphonate herbicide used to eliminate grasses and herbaceous plants in many vegetation management situations.Its extensive use is causing environmental pollution,and consequently,there is a need to remove it from the environment using an eco-friendly and cost-effective method.As a step to address this problem,a novel bacterial strain Comamonas odontotermitis P2,capable to utilize glyphosate as a carbon(C) and/or phosphorus(P) source,was isolated from a glyphostate-contaminated field soil in Australia and characterized.Response surface methodology(RSM)employing a 23 full factorial central composite design was used to optimize glyphosate degradation by C.odontotermitis P2 under various culture conditions.The strain C.odontotermitis P2 was proficient in degrading 1.5 g L~(-1) glyphosate completely within 104 h.The optimal conditions for the degradation of glyphosate were found to be pH 7.4,29.9℃,and an inoculum density of 0.54 g L~(-1),resulting in a maximum degradation of 90%.Sequencing of glyphosate oxidoreductase(GOX) and C-P lyase(phnJ) genes from C.odontotermitis P2 revealed 99% and 93% identities to already reported bacterial GOX and phnJ genes,respectively.The presence of these two genes in C.odontotermitis indicates its potential to degrade glyphosate through GOX and C-P lyase metabolic pathways.This study demonstrates the potential of C.odontotermitis P2 for efficient degradation of glyphosate,which can be exploited for remediation of glyphosate.     

黄芩苷对热应激条件下猪近端肾小管(LLC-PK1)细胞凋亡率及B细胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白基因(Bax)表达的影响

为探讨不同浓度黄芩苷对热应激条件下猪近端肾小管细胞(pig kidney proximal tubular cells,LLC-PK1)细胞凋亡率及B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cellymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白基因(Bcl-2 associated X protein,Bax)表达的影响,将培养的LLC-PK1细胞随机分为7个组,Ⅰ组为37℃空白对照组,Ⅱ组为42℃单纯热应激1 h组,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ组分别为用不同浓度黄芩苷(0.01、0.1、1、10和100μg/m L)处理组后42℃热应激1 h组,运用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测Bcl-2和Bax基因及蛋白的表达,流式细胞仪(Annexin V-FITC/PI双染法)检测细胞凋亡率。结果表明,与Ⅰ组相比,Ⅱ组能显著诱导LLC-PK1细胞Bcl-2 m RNA的表达(P0.05),极显著诱导细胞Bax m RNA和蛋白的表达(P0.01),能极显著降低细胞Bcl-2和Bax m RNA和蛋白的比值(P0.01),极显著增加细胞凋亡率(P0.01),但对细胞Bcl-2蛋白的表达无显著影响(P0.05)。黄芩苷处理组与Ⅱ组相比,Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组LLC-PK1细胞Bcl-2 m RNA的表达量均升高,其中Ⅴ组差异极显著(P0.01),Ⅳ及Ⅵ组差异显著(P0.05),Ⅲ及Ⅶ组差异不显著(P0.05),而细胞Bcl-2蛋白的表达量与Ⅱ组相比均差异不显著(P0.05);同样与Ⅱ组相比,黄芩苷处理的各组细胞Bax m RNA及蛋白的表达量均降低,其中Ⅴ及Ⅵ组差异极显著(P0.01),其余各组差异显著(P0.05);除Ⅲ组外,其他各组细胞Bcl-2和Bax m RNA及蛋白的比值与Ⅱ组相比均显著升高(P0.05),其中Ⅴ组细胞Bcl-2和Bax蛋白的比值差异极显著(P0.01);细胞凋亡率仅有Ⅲ组与Ⅱ组相比差异不显著(P0.05),而Ⅴ及Ⅵ组细胞凋亡率极显著低于Ⅱ组(P0.01),其余的Ⅳ和Ⅶ组显著低于Ⅱ组(P0.05)。一定浓度范围内的黄芩苷(0.1~100μg/m L)可能通过下调热应激条件下LLC-PK1细胞Bax的表达,从而提高Bcl-2和Bax的比值,降低细胞的凋亡率,对细胞起到保护作用。本研究从分子水平研究黄芩苷缓解热应激对猪LLC-PK1细胞的损害作用,可为明确其解热机制提供理论基础,并为其在临床上的应用提供有价值的参考资料。     

超临界CO2杀灭大肠杆菌过程中菌体蛋白变化的研究

通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,结合超临界CO₂对大肠杆菌的杀菌曲线,研究超临界压力、温度和处理时间对大肠杆菌菌体蛋白的影响。结果表明：超临界CO₂在杀灭大肠杆菌过程中,可显著降低菌体碱溶性（pH8.0）蛋白的溶解性,但对菌体总蛋白含量和种类没有影响;37 ℃下超临界CO2处理大肠杆菌30 min,压力为10MPa时,大肠杆菌存活率为2.8%,菌体碱溶性蛋白的溶解性显著降低,但当压力增加到50MPa时,大肠杆菌存活率和碱溶性蛋白溶解性变化不明显;超临界温度和处理时间对菌体碱溶性蛋白溶解性的影响与大肠杆菌在超临界CO₂中的存活趋势基本一致可,随处理时间的延长和温度的增加大肠杆菌存活率逐渐降低到0,碱溶性蛋白溶解性逐渐降低,直至部分蛋白带消失,但菌体总蛋白含量和种类并没有明显变化;升高温度比增加压力更能显著地导致菌体碱溶性蛋白变性,溶解性下降。     

猪背膘组织二脂酰甘油酰基转移酶基因(DGAT1和DGAT2)的发育性表达分析

酰基辅酶A:二脂酰甘油酰基转移酶(acyl-coA:diacylglycerol acyltransferase,DGAT)是催化甘油三酯合成最后一步反应的关键酶,包括DGAT1和DGAT2两种;阐明其在发育过程中的表达规律对于找到控制中外猪种脂肪沉积能力差异的基因十分必要.本研究分别用RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR的方法分别对莱芜猪和杜洛克3日龄仔猪和成年猪背膘组织中DGAT1和DGAT2 mRNA表达量进行了分析.结果表明,莱芜猪和杜洛克成年猪DGAT1 mRNA的表达量均高于3日龄仔猪,分别为5.0倍和2.7倍;成年猪DGAT2 mRNA表达量高于3日龄仔猪,分别为27.6倍(P＜0.01)和4.8倍(P＜0.05).两品种成年猪和3日龄仔猪DGAT2基因表达量的变化均高于DGAT1.品种间同一发育时期比较,杜洛克3日龄仔猪背膘组织中DGAT2基因的表达量高于莱芜猪,但成年莱芜猪背膘组织中DGAT2基因的表达量高于杜洛克,差异均不显著(P＞0.05).提示DGAT2基因可能与中外猪品种脂肪沉积能力的差异有关.