谷子脂转移蛋白cDNA的克隆及特性研究

摘要：首次报道了从谷子(Stetaria italica )未成熟种子cDNA文库中克隆到1个与其它物种脂转移蛋白（LTP）具有较高同源性的脂转移蛋白基因Siltp。将核苷酸序列和推断的氨基酸序列在GenBank中进行比较，发现Siltp与大麦脂转移蛋白LTP7a2b和LTPcw-19,玉米脂转移蛋白，欧洲油菜的脂转移蛋白基因的核苷酸序列的同源性分别为72%,70%,60%,54%；氨基酸序列的同源性分别为79%,73%，65%，57%。序列分析表明，编码区含363个碱基 ，编码121个氨基酸，其中包括26个氨基酸的信号肽序列，分子量为9.3 kD。基因组Southern杂交结果表明，Siltp在基因组中以单拷贝存在。Northern杂交研究Siltp的时空表达特异性，发现Siltp仅在茎、叶、穗中表达。利用软件PAUP对17种植物的LTP进行进化分析，从进化系统树可以看出LTP有4个分支，其中，小麦发生分化较早，其它几种单子叶植物如玉米、谷子、大麦和水稻分化较晚，说明发生了早期的基因复制事件。在整个系统图中，双子叶比较分散，说明LTP基因的进化是个复杂的过程；禾本科作物的脂转移蛋白基因是由一个原始基因分化而产生的不同分支，Siltp与大麦LTP亲缘关系最近。     

人的β干扰素基因在烟草中整合及表达

本研究把含有β干扰素基因的植物表达载体ｐＧ２１（含有β干扰素基因的信号肽）和ｐＧ１１通过三亲结合转移到了农杆菌Ｃ５８Ｃ１（ｐＧＶ２２６０）中，并与ｐＧＶ２２０６０发生同源重组而稳定存在于它Ｔｉ质粒ｐＧＶ２２６０上，进一步用此载体把β干扰素工因转移到了烟草细胞中Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析证明了此基因已整合到染色体上，ＲＮＡ点杂交及ＮＰＴⅡ酶分析显示此基因植物细胞中得到了表达，实验中还发现含有ｐＧ２１的农杆     

含GFP报告基因的伪狂犬病病毒上海株gE-gI基因部分缺失株的构建

在伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV)上海株gI基因和gE基因克隆鉴定的基础上，进一步构建了转移载体质粒，为PRV－SH的gE－gI基因部分缺失毒株的构建作准备，将gI和gE基因克隆入pUC18中构建pgEI载体，利用gE基因中的酶切位点缺失掉gE基因5′端363bp，并把录色荧光蛋白（GFP）基因表达盒插入到缺失部分。通过酶切鉴定，表明GFP基因已3插入到pgEI中，构建了含GFP的缺失转移载体pgEI-GFP。用DOTAP试剂将pgEI-GFP转染感染了PRV－SH株的兔肾（RK）细胞，待出现80％以上的细胞病变时收获病毒，并以GFP为标志，通过蚀斑法得到纯化重组病毒，命名为PFDE／DI。     

猪霍乱沙门氏菌C500株crp-/gfp+缺失株的构建及鉴定

为研究crp（cAMP受体蛋白）基因缺失及插入绿荧光蛋白基因gfp后对猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500株的毒力及免疫原性的影响,同时为下一步构建以crp基因缺失C500为载体的外源基因-猪霍乱沙门氏菌双价口服疫苗奠定理论基础与技术基础,本文构建了C500株的crp缺失并插入gfp基因的crp-/gfp+缺失株。首先构建含缺失320bp的crp基因并插入gfp基因的重组自杀性质粒,与C500接合转移,两步法筛选无抗性的crp-/gfp+缺失株,经PCR和荧光显微镜观察证实在C500的基因组上缺失crp基因并正确插入gfp基因。     

肉桂地链霉菌接合转移体系的构建及nsdA基因中断对其次级代谢的影响

以pSET152和pHL212为出发质粒，通过供体大肠杆菌ET12567（pUZ8002）和S17-1属间接合转移肉桂地链霉菌（Streptomyces cinnamonensis），首次构建并优化了肉桂地链霉菌的接合转移系统。利用PCR介导的基因置换技术快速构建了肉桂地链霉菌nsdA基因 （negative regulator of Streptomyces differentiation）中断载体，通过接合转移导入肉桂地链霉菌工业菌株BIB2005，筛选得到一株遗传稳定表型为AmR、KmS的接合子BIB309。PCR分析结果显示该接合子即为nsdA中断突变株。与出发工业菌株相比，在摇瓶水平上nsdA中断突变株BIB309莫能菌素产能提高了2.7倍。     

毛白杨杂种外源基因稳定性及对土壤微生物的影响

转基因植物外源基因的稳定性、对土壤微生物种群数量的影响以及外源基因是否水平转移到土壤微生物中,是评估转基因植物生态安全性的重要组成部分。本研究利用PCR技术,分析了种植于山东省东营市试验林达3年的转AhDREB1基因毛白杨杂种(毛新杨×毛白杨)的外源基因稳定性,表明AhDREB1基因仍然存在于转基因植株中。采用平板稀释法对转基因与非转基因植株的根系土壤微生物进行种群数量分析,计数结果表明转基因植株与非转基因植株间根系土壤3大类微生物（细菌、放线菌和真菌）数量无显著差异。利用AhDREB1基因特异引物对土壤总DNA以及菌株DNA进行PCR扩增,均未检测到外源基因扩增产物。研究结果表明该转基因毛白杨杂种对土壤微生物系统尚无明显的影响。     

水稻密码子优化基因Mat#增强草铵膦抗性

来自细菌Nocardia sp.AB2253的蛋氨酸砜N-乙酰基转移酶基因(methionine sulfone Nacetyltransferase gene,Mat)编码产物具有N-乙酰基转移酶活性,能解除灭生性除草剂草铵膦的毒性,但在植物中表达效率较低.本研究用水稻(Oryza sativa)偏爱密码子优化的Mat#基因转化籼稻品系9K(Oryza sativa ssp.indica),经过PCR和Southern杂交验证,证明该基因已经整合至水稻基因组中.除草剂抗性检测结果显示,该转化体的芽期草铵膦耐受浓度至少为600 mg/L、秧苗期草铵膦耐受浓度至少为1 000 mg/L,对草铵膦的抗性水平不低于转双丙氨酰膦抗性基因(bialaphos resistance gene,Bar)水稻9KA2.酶活性测定结果显示,该转化体叶片中的N-乙酰基转移酶活性约为非转基因对照中的6.6倍.说明优化后的Mat#基因增强了草铵膦抗性,可作为转化筛选标记和抗除草剂目的基因应用于转基因作物育种.     

猪生殖和呼吸综合征病毒中国分离株B13株ORF5基因在杆状病毒系统中的表达

本研究将PRRSV B13株ORF5基因克隆到杆状病毒转移载体质粒pVL1393中,构建了重组转移载体质粒pVL1393-ORF5.用该重组转移载体质粒与线性化苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV-SVI-G)基因组DNA(BaculoGold Linearized Baculovirus DNA)共转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda,sf9)细胞,得到重组病毒AcMNPV-OCC-- ORF5 .在感染了重组病毒的sf9细胞中成功地检测到分子量为25kD的ORF5基因表达产物,其能被猪抗PRRSV B13株多克隆血清特异识别.表明sf9细胞表达了所期望的产物,进而也说明基因片段的正确性.猪抗PRRSV VR-2332株多克隆血清对ORF5基因的表达产物无反应,而猪抗LV株多克隆血清则能特异识别,说明PRRSV中国分离株B13株在抗原性上更接近欧洲亚群分离株LV株的抗原性,进一步证实了PRRSV中国分离株B13株属于欧洲亚群.ORF5基因表达产物与天然蛋白分子量十分接近,说明杆状病毒表达系统能较适当的进行合成蛋白的加工和修饰.本研究的结果为PRRS基因工程疫苗的研究奠定了基础.     

离子注入在生物改良上的应用

本文简述近年来离子注入应用于植物，动物，微生物品种改良及离子束介导外原基因转移等方面的研究进展。     

根瘤菌结瘤基因与竞争结瘤基因的研究进展

根瘤菌的结瘤基因与竞争结瘤基因在根瘤菌与结瘤的过程中起着关键的作用。随着研究的深入,已经发现,分离和定位了数十个结瘤基因和几个与竞争结瘤有关的基因,本文将简要地介绍了这方面的研究成果。