巴西橡胶树HbNAC1基因启动子的克隆及序列分析

NAC转录因子是植物特有的一类转录调控因子,在植物的生长发育、激素调节和境胁迫应答中具有重要的功能。为研究NAC转录因子在巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）抗逆胁迫中的功能,本项目组根据巴西橡胶树NAC转录因子-HbNAC1基因序列,通过Genome Walking方法从巴西橡胶基因组DNA中获得了长度为1861bp的HbNAC1基因的5＇调控区片段,序列分析表明该段序列含有一个典型的真核生物核心启动子区域,转录起始位点T位于起始密码子上游52bp处。该启动子序列除了含有TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件外,还具有茉莉酸响应元件以及大量光顺式作用元件和逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,这表明HbNAC1基因在橡胶树逆境胁迫应答过程具有重要功能,其启动子可能是一个光诱导型和组织特异性启动子。     

毛白杨PtSEP3-1基因启动子的克隆分析及其表达载体构建

SEP（SEPALLATA）类基因属于花器官发育ABCDE模型中的E类基因,拟南芥中的研究表明该类基因可能具有控制花器官形态发育以及激活其它类型基因的功能,是一类花发育过程中的关键基因。因此,研究杨树SEP类基因启动子表达特性对于杨树的开花调控研究具有重要意义。本文根据毛白杨SEP3基因和毛果杨基因组序列设计引物,通过PCR获得了PtSEP3-1,基因上游2000bp的序列。序列分析结果表明该序列具有启动子的基本元件TATA—box和CAAT-box,还包含大量光响应元件ACE、BoxI和Box4等,此外还有脱落酸响应元件ABRE,赤霉素响应元件GARE—motif以及胁迫响应元件HSE、TC—richrepeats等。进一步构建了一个以PtSEP3-1启动子驱动GUS基因的植物表达载体pPtSEP3-1,protest,为该启动子的功能鉴定奠定了基础。     

番茄LeNCED1基因5''-侧翼序列克隆及LeNCED1p:GUS融合基因构建

从番茄基因组中克隆LeNCED1基因5'-侧翼1456 bp调控序列,经生物信息学分析表明,LeNCED1基因上游调控序列中存在响应昼夜节律的顺式作用元件Circadian、光响应元件BoxⅠ、逆境胁迫响应元件(TC-rich repeats)、ABA响应元件ABRE等,构建了LeNCED1基因上游调控序列与报告基因GUS融合的植物双元表达载体pLeNCED1p:GUS.     

番茄LeNCED1基因5′-侧翼序列克隆及LeNCED1p:GUS融合基因构建

从番茄基因组中克隆LeNCED1基因5′-侧翼1456 bp调控序列,经生物信息学分析表明,LeNCED1基因上游调控序列中存在响应昼夜节律的顺式作用元件Circadian、光响应元件Box I、逆境胁迫响应元件(TC-rich repeats)、ABA响应元件ABRE等,构建了LeNCED1基因上游调控序列与报告基因GUS融合的植物双元表达载体pLeNCED1p:GUS。     

杨树葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）基因启动子的克隆与分析

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是磷酸戊糖途径的关键性调控限速酶,其主要功能是为脂肪酸合成、氮还原和谷胱甘肽等生物分子合成提供还原力NADPH,也为核酸合成提供戊糖;此外,还参加非生物逆境胁迫应答反应。因此,G6PDH对植物的生长发育起着非常重要的作用。本文利用甜杨G6PDH基因和毛果杨基因组序列,通过PCR获得了甜杨G6PDH基因上游1400bp的序列。序列分析结果表明,该序列具有启动子的基本元件TATA-box、CAAT-box。此外,还包含多个胁迫诱导元件,如低温诱导元件LTR,盐诱导元件GT-1,抗冻、缺水、脱落酸、抗寒元件MYB和MYC,以及光响应元件L-box、G-box、3AF-1、TC丰富区等。     

参与逆境应答的小麦RBCS11基因启动子功能分析

光合作用相关的核基因(photosynthesis-associated nuclear genes,PhANGs)可以响应包括光照、干旱、糖以及脱落酸(abscisic acid,ABA)等多种环境信号,目前己发现并报道了多种PhANGs启动子上关于光调控的顺式作用元件,但是关于干旱以及ABA等响应元件仍然缺乏系统性研究.本研究主要对核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基基因(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit,RBCS)启动子区域响应逆境胁迫的顺式作用元件进行分析.首先从中国春小麦(Triticum aestivum)基因组中分离得到TaRBCS11基因上游1 839 bp的核苷酸序列,对该启动子进行结构分析的结果表明,转录起始位点位于起始密码子上游59 bp;经PlantCARE数据库分析,发现该启动子序列上除大量保守光调控元件外(如Box Ⅰ、G-Box、I-box和GATA-motif等),还包含多种应答干旱、盐及激素等逆境因子的保守顺式作用元件(如MYB结合位点(MYB binding site,MBS)、CCAAT-box、乙烯响应元件(ethylene-responsive element,ERE)和赤霉素应答元件(gibberellin-responsive element,GARE-motif)等);从小麦基因组数据库分离得到TaRBCS11、TaRBCS13、TaRBCS10和TaRBCS14启动子序列,序列比对显示,其具有极高的同源性,同时还发现多个保守光调控元件(如MNF1、GATA-motif、I-box、G-Box和Spl)位于这4段启动子近侧区(-200bp～ATG);根据TaRBCS11启动子结构特征及调控元件分布情况,设计5条上游引物及1条下游引物用于启动子缺失片段扩增,长度分别为1 656、1 258、866、533和277 bp;随后对该启动子5’端进行缺失并构建了5个不同长度片段融合报告基因β-葡萄糖醛酸酶基因(β-glucuronidase,GUS)的缺失表达载体,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的烟草(Nicotiana tabacum)叶片瞬时表达体系研究酶活变化情况.组织化学染色与酶活分析表明,光能明显提高GUS酶活,进一步分析表明,随启动子片段的缩短,启动子片段上光调控元件缺失,启动子活性依次下降;此外,对不同启动子缺失材料进行干旱、高盐、ABA、黑暗及恢复光照处理,发现干旱、高盐、ABA和黑暗均对全长启动子(P1656)有显著的抑制作用,-804～-474 bp的区域对该段启动子响应干旱及高盐胁迫具有重要作用,而参与ABA响应的核心调控区域位于-1 597～-1 198bp.本研究验证了TaRBCS11基因的表达受干旱、高盐、ABA和光调控影响,并鉴定出其启动子上参与响应非生物胁迫的重要调控区域,研究结果为今后深入研究PhANGs表达调控机制提供了重要参考.     

WRKY转录因子调控植物养分吸收利用及重金属解毒的研究进展

WRKY蛋白是植物特有的一类重要转录调控因子，它们通过与下游基因启动子上的W-box元件特异性结合诱导或抑制相关基因的表达，从而调控植物生长发育以及植物对生物和非生物胁迫的响应。植物WRKY基因组数目多，在拟南芥、大豆和水稻基因组中已经分别鉴定出74、182和109个，在植物对干旱、盐害、高温、养分匮乏和病原体感染等各种生物、非生物胁迫的响应过程中起关键作用。例如AtWRKY45和AtWRKY75参与调控拟南芥应答低磷养分胁迫，GmWRKY142正向调控拟南芥对镉胁迫的耐受性。在植物面对逆境胁迫时，WRKY蛋白通过与养分相关基因启动子的W-box元件特异性结合，进而实现自我调节或交叉调节，激活或抑制下游基因的转录以应对各种逆境胁迫。众多WRKY下游靶基因也已被鉴定出来，例如PHT家族成员与磷营养相关；3个拟南芥WRKY基因和6个大豆WRKY基因参与调控植物对氮素的吸收利用；6个拟南芥WRKY基因、10个大豆WRKY基因和5个水稻WRKY基因调节植物应对低磷胁迫；2个拟南芥WRKY基因和6个大豆WRKY基因影响植物对钾的吸收利用；3个大豆WRKY基因参与调控植物对硫营养的吸收利用；1个拟...     

谷子GRAS转录因子家族的全基因组鉴定、表达分析及标记开发

为了鉴定谷子GRAS家族基因并揭示SiGRASs响应外源植物激素和逆境胁迫过程的表达规律,本研究采用生物信息学方法对谷子GRAS转录因子家族进行全基因组鉴定,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行4种激素和2种胁迫处理后的表达分析,并根据SiGRAS23序列差异开发分子标记。结果表明,谷子全基因组共包含52个GRAS转录因子基因,大部分编码亲水性蛋白;82.69%的基因编码酸性蛋白,长度为362~734 aa,分子量为39.81~100.09 kDa,等电点为4.85~9.53。系统发育分析将谷子GRAS家族划分为10个亚家族。组织表达量分析表明,各亚族基因具有明显的组织表达特异性,LISCL、DELLA和SHR亚族基因分别在叶、茎和根中有较高的表达量,PAT1和HAM亚族大部分基因为组成型表达,但在叶中的表达量最高。SiGRASs启动子区含有多种植物激素、逆境响应相关的顺式作用元件;qRT-PCR结果显示,SiGRASs在不同激素和非生物胁迫下的表达水平存在较大差异,其中PAT1亚族中Seita.2G369400对6种不同的处理响应最为敏感;少数SiGRASs基因在各组织和各种激素和非生物胁迫处理下,表达量均在极低水平。DELLA亚族中的SiGRAS23在遗传群体AJF₅的双亲矮宁黄和晋谷21号间存在序列差异,据此开发的分子标记D8-1与该群体株高性状紧密连锁。本研究为解析谷子GRAS家族基因参与激素信号转导及逆境胁迫响应的功能研究奠定了基础,SiGRAS23的分子标记可用于今后谷子种质资源株高等位变异的筛选。     

玉米乙烯应答元件结合蛋白基因启动子克隆与功能验证

为了给玉米转基因研究提供更多的非生物逆境诱导启动子,寻找只在逆境胁迫条件下适当驱动外源抗逆基因的表达,在生物信息学分析的基础上,克隆与水稻DREB1B转录因子基因同源的玉米乙烯应答元件结合蛋白基因sb CBF6的启动子psb CBF6,在非生物逆境应答元件分析和实时定量PCR验证其非生物逆境胁迫响应特性后,用以构建驱动报告基因GUS的表达载体,并使用基因枪法转化玉米愈伤组织,通过愈伤组织的GUS荧光值与荧光素酶发光值的比值,评价psb CBF6启动子在非生物逆境胁迫及激素诱导条件下的驱动活性。结果表明,sb CBF6基因在各种非生物逆境胁迫下差异表达。psb CBF6启动子长1 479 bp,存在多种与非生物逆境胁迫应答相关的调控元件,可在非生物胁迫条件下驱动外源抗逆基因在转基因植物中诱导表达。试验结果为研究抗逆转基因玉米提了供参考。     

白菜型油菜BrBBX家族的鉴定与BrBBX46和BrBBX53基因的胁迫响应分析

BBX是一类重要的锌指蛋白转录因子家族,包含1~2个高度保守位于蛋白质序列N端的BBX结构域,在调控植物的生长发育和响应环境胁迫中发挥着重要作用。利用生物信息学分析手段,在白菜型油菜中鉴定出59个BrBBX家族成员,对它们的染色体定位、基因结构、蛋白保守结构域,以及BrBBX46和BrBBX53基因的启动子进行了分析,并用qRT-PCR技术鉴定了BrBBX46和BrBBX53基因在模拟干旱和盐胁迫下的表达水平。结果显示,59个BrBBXs不均匀地分布于白菜型油菜基因组的10条染色体。通过对系统进化、基因结构、蛋白保守 结构域的分析,59个BrBBXs被分为5个亚族,每个亚族的基因结构、蛋白结构域和保守基序均相对保守,同一亚族的成员具有相似的基因结构和保守结构域。对启动子的分析结果显示,BrBBX46和BrBBX53基因的启动子中均含有大量的胁迫相关响应元件,尤其是干旱胁迫响应元件,二者均有14个;在40% PEG和120 mmol/L NaCl处理下,二者的表达水平均显著上升,说明BrBBX46和BrBBX53基因能够响应干旱和盐胁迫的诱导,可能在干旱和盐胁迫下发挥着重要功能。以上结果为进一步了解和利用BrBBX家族成员改良白菜型油菜耐旱耐盐新品种提供了良好的基因资源。     

西瓜CGMMV胁迫下MIR319家族成员及靶基因的鉴定分析

为明确MIR319家族成员(miR319、miR319a及miR319a-3p)在黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)胁迫应答中的作用,本研究将MIR319的成熟序列与西瓜基因组进行Blast比对获得其前体基因,利用MEGA对前体基因进行系统进化分析,PlantCARE对前体基因启动子区的顺式作用元件进行分析,降解组测序对MIR319的靶基因进行分析,转录组测序及qRT-PCR分析MIR319靶基因的表达模式。研究结果获得MIR319家族成员共同前体基因Pre-MIR319,其长度为170 bp,含有完整的茎环结构;序列比对显示,MIR319家族成熟序列在5'端第2~第14位碱基高度保守;西瓜Pre-MIR319与35个物种的116条miR319前体序列经系统进化分析后分为四个分支,其中西瓜Pre-MIR319与马铃薯miR319a前体基因(MI0025952)距离最近;Pre-MIR319启动子区含有光响应元件、赤霉素响应元件、乙烯响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、MYB和MYC等多个顺式作用元件;降解组测序获得MIR319家族成员的5个靶基因,其中Cla019567、Cla013523、Cla023342和Cla002428注释为TCP转录因子,Cla013668注释为MYB转录因子,剪切位点位于MIR319家族成员成熟序列5'端的第10位碱基;靶基因编码氨基酸数目为319~554 aa、分子量为34.94~61.21 kDa、理论等电点为5.29~7.80,定位于细胞核/细胞质中,均不含跨膜结构域;转录组测序及qRT-PCR分析表明miR319a负调控靶基因Cla013523(TCP)的表达。本研究结果进一步明确了MIR319家族成员在CGMMV胁迫应答中的作用及其对靶基因的调控作用。     

F-box蛋白家族在植物抗逆响应中的作用机制

SCF复合体泛素连接酶E3介导的泛素化蛋白降解是翻译后水平上对生命进程进行调控的一个重要方式。它的关键组分F-box蛋白负责识别被降解的靶底物蛋白。植物F-box基因家族成员众多,极具多样性。F-box蛋白N端常含F-box基序,C端常为蛋白互作保守结构域,该结构具多样性,可识别不同底物,是F-box蛋白分类的依据。研究表明,F-box蛋白参与调控植物的许多生命进程,包括抗逆反应。本文就近年来F-box蛋白在植物抗逆反应中的作用机制进行总结。F-box蛋白大多以SCF复合体泛素连接酶E3介导的泛素化蛋白降解目标蛋白的方式调控抗逆反应,也有不依赖形成SCF复合体的方式行使功能,不少F-box蛋白参与了植物激素信号传导,通过调控转录因子活性而改变下游基因的表达,由此影响了植物的抗逆反应。基因表达谱的生物信息学预测表明,大多数F-box基因参与了植物抗逆反应,目前只有其中一小部分已报道了其抗逆调节功能。在此综述了这些F-box蛋白在植物抗逆胁迫中的研究进展。在干旱和盐碱胁迫反应中,F-box基因常通过影响植物激素脱落酸、乙烯等植物激素信号传导而调控抗逆。由于干旱和盐碱胁迫具协同性,不少F-box基因同时参与抗旱和抗盐碱胁迫,但调节方式有所不同,一些F-box基因对抗干旱和盐碱的反应具协同性,从总体上调控植物的渗透胁迫和离子毒害反应;而另一些F-box基因对干旱和盐胁迫反应的调节作用相反,它们可能在植物抗逆的精细调节中起作用。在低温胁迫反应中,F-box蛋白可调节植物抗低温的CBF信号途径。在生物胁迫反应中,F-box基因常通过影响植物激素茉莉酸和水杨酸途径来调控抗病,病原菌也以攻击植物SCF复合体使植物致病。此外,植物激素信号途径之间相互作用,共同影响抗逆反应。     

甘蓝型油菜SAMDC3基因及其启动子的克隆与分析

S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC）是植物体内亚精胺和精胺前体物质形成的关键酶。本研究克隆了甘蓝型油菜（Brassica napus）BnSA MDC3基因家族2个成员的全长cDNA和启动子序列,并对其诱导表达特性进行了鉴定。BnSAMDC3—1（GenBank accession No．HM013966）和BnSAMDC3—2（GenBankac．cession No．HM013967）的全长cDNA分别为1746bp和1754bp,开放阅读框（ORF）长度分别为1101bp和1104bp,在大ORF上游132bp处均包含一个171bp的小ORF。BnSAMDC3基因在叶片中表达量较高,受高温和干旱抑制。6-BA、GA,和SA抑制BnSAMDC3—1的表达,而GA,和甘露醇诱导BnSAMDC3—2表达上调。BnSAMDC3基因启动子具有多个与胁迫和激素诱导相关的顺势调控元件,表明BnSAMDC3可能通过ABA、6-BA和SA信号途径介导植物对非生物胁迫的响应。本研究将有助于进一步探讨甘蓝型油菜抗逆的分子机理,为甘蓝型油菜的栽培和品质改良奠定基础。     

玉米转录因子ZmBES1/BZR1-7基因克隆及功能分析

BES1/BZR1蛋白是油菜素内酯信号途径的唯一转录因子,在植物生长发育及逆境应答中发挥重要作用。为了探究玉米ZmBES1/BZR1-7基因的功能,从玉米自交系B73中克隆到ZmBES1/BZR1-7基因,并对其功能进行初步分析。序列分析结果表明,ZmBES1/BZR1-7基因无内含子,开放阅读框(ORF)长975 bp,编码324个氨基酸。ZmBES1/BZR1-7蛋白N端高度保守,包含bHLH结构域,与水稻OsBZR1-1相似性达75.95%。实时荧光定量PCR结果表明,ZmBES1/BZR1-7在玉米叶和根中的表达受渗透与盐胁迫诱导显著;16% PEG-6000和100 mmol·L^-1 NaCl处理12 h,叶片中ZmBES1/BZR1-7表达量分别为对照的17.8倍和19.8倍。酵母激活试验结果表明,ZmBES1/BZR1-7蛋白具有转录激活活性。共相关分析结果表明,玉米中有72个基因与ZmBES1/BZR1-7基因的表达相关性较高,启动子区均含有E-box或BRRE元件,推测可能是ZmBES1/BZR1-7转录因子调控的靶基因,主要参与细胞、细胞组分、细胞代谢过程等。本研究结果为深入解析玉米ZmBES1/BZR1-7的功能及其调控网络奠定了基础。     

番茄钙依赖性蛋白激酶基因LeCPK2在热（光）胁迫中的功能鉴定

钙依赖性蛋白激酶（calcium—dependent protein kinases,CDPKsorCPKs）作为一类钙感知蛋白在植物的生长发育和胁迫应答中起着重要的作用。LeCPK2（Gen Bankaccession No．：GQ205414）是我们从番茄中分离的第3个CDPK基因,前期研究表明LeCPK2可能在植物热胁迫应答中发挥作用。为了进一步研究其在热胁迫中的功能,我们通过电子克隆的方法分离了LeCPK2的启动子序列,并通过LeCPK2过表达烟草分析其在高温胁迫中的潜在的功能。生物信息学分析显示,LeCPK2启动子中包含5个热响应元件,和前期试验结果一致。野生型植株在受到热胁迫后,对光更为敏感,强光照下植株叶片发生萎蔫,而强光本身不会对未受热胁迫的健康植株造成伤害。LeCPK2转基因植株热、光胁迫后不会出现受害表型。以上研究表明,LeCPK2在植物的热胁迫应答中发挥重要作用,能够有效保护植株免受高温胁迫的损害,是一个优秀的耐热（光）基因。本研究将为揭示番茄LeCPK2遗传功能及对其开发利用奠定基础。     

一氧化氮与植物激素的相互作用及其关系

NO在植物的生长发育、生理及信号传递过程中有着重要的调节作用。本文通过从植物根系的生长、种子萌发、程序性细胞死亡、光形态的建成、气孔的关闭及抑制其开放、成熟和衰老等方面对一氧化氮（NO）作为植物激素下游的信号分子发挥的生理功能进行了综述,进而对NO与植物激素生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸以及乙烯的相互作用加以讨论,来阐明NO与植物激素之间的关系,并对未来的研究方向作出展望,为NO与植物激素关系的研究提供理论参考。     

转GhB301基因棉花响应枯萎病菌侵染的转录组分析

乙烯响应因子(ethylene responsive factor, ERF)可以激活或者抑制下游病程相关蛋白基因的表达,在植物抗病信号转导途径中发挥着重要作用。为探究ERF-B3亚组基因GhB301在棉花抗枯萎病中的分子调控机制,本研究利用已获得的转GhB301基因棉花株系,通过孢子悬浮液蘸根的方法对转GhB301基因棉花株系(N)和野生型对照(WT)进行接菌处理,抗病性鉴定结果表明,过表达GhB301的N株系增强了对枯萎病的抗病性,其病情指数为14.77,显著低于WT(病情指数为37.50);枯萎病菌侵染0、6、12、24、48 h后,利用RNA-seq技术对N和WT的根部组织进行测序分析,共得到273 111 170个clean reads,其Q30均大于87.64%,将clean reads与陆地棉参考基因组TM-1比对,获得了14 021个差异表达基因(DEGs)。与WT相比,转基因株系能够在病原菌侵染后更快速地做出响应。GO及KEGG富集分析发现共有135个DEGs参与氧化还原过程,67个DEGs参与防御反应,31个DEGs参与苯丙烷类生物合成,推测这些DEGs可能与转基因棉花的枯萎病抗性增强存在密切关系。本研究结果为阐明GhB301基因响应棉花枯萎病菌侵染规律奠定了基础。     

外施吲哚乙酸对棉铃蔗糖代谢及产量性状的影响

为探究外施吲哚乙酸(IAA)对棉铃蔗糖代谢及棉铃产量性状的调控机制,以陆地棉(Gossypium hirsutum L.)品系A201为材料,用0.1 mg·L^-1 IAA溶液连续处理开花前1 d至开花后2 d的棉铃,以去离子水处理为对照,研究IAA处理对棉铃胚珠外表皮纤维细胞突起、蔗糖代谢及棉铃产量性状的影响。结果表明,IAA处理能够显著提高棉铃单铃重,促进棉铃开花当日纤维细胞启动的密度。与对照相比,IAA处理可增强开花后30 d种胚磷酸蔗糖合成酶(SPS)活性,导致蔗糖浓度升高,为种胚大分子物质合成提供更多的底物;并提高了开花后30~40 d种胚和开花后20~30 d种皮蔗糖合成酶(SS)的活性,增加了种胚和种皮的淀粉浓度,促进了棉花种子库物质合成。另外,IAA处理棉铃可以促进棉铃种胚和种皮蔗糖代谢关键酶的活性,提高其碳水化合物特别是淀粉的浓度,有利于棉铃种子的发育,这可能是导致单铃重提高的重要原因。本研究结果对于利用IAA提高棉花产量具有指导意义。     

植物抗旱耐盐基因的研究进展

近几年许多与植物抗旱耐盐相关基因被克隆和分析,同时通过转基因技术将这些基因转到植物中异源表达,能显著提高转基因植物的抗旱耐盐能力。这些基因主要包括渗透调节基因、蛋白类基因（如信号传导中的蛋白激酶基因）及转录因子等。在逆境条件下,渗透调节基因通过合成脯氨酸、甜菜碱、糖类和多胺类等渗透调节物质维持植物中的渗透平衡;蛋白激酶基因产物是细胞信号传导中的组分,这些基因能促进植物对干旱失水反应和逆境信号的传递,启动抗逆基因的表达;转录因子通过与相关基因的特异性结合来调控其表达,进而产生相关调控蛋白等物质增强植物在逆境中的生存能力。本文主要综述了这三类抗逆基因的研究现状及其生物学机理,讨论并分析这些基因在应用中尚待解决的问题,为发掘更多的抗逆性的基因资源和进一步开展分子育种工作提供参考。