Trx及其抑制因子TXNIP基因在发育不同阶段牛体外胚胎中的转录与表达

【目的】研究Trx及其抑制因子TXNIP基因在牛卵母细胞及不同发育阶段体外受精胚胎中的表达变化.【方法】采用实时荧光定量PCR方法,检测牛GV期卵母细胞、MⅡ期卵母细胞、受精卵、2-4细胞胚胎、8-16细胞胚胎、桑椹胚和囊胚中Trx1、Trx2和TXNIP基因mRNA的相对表达量.【结果】Trx1和Trx2基因在GV期卵母细胞和不同发育阶段的胚胎均有不同程度的表达.GV期卵母细胞Trx1mRNA表达量最高,随着卵母细胞的成熟及受精后胚胎的发育逐渐降低,囊胚期胚胎表达量又急速升高.Trx2基因在受精前的卵母细胞中高表达,受精后表达量逐渐下降,囊胚期胚胎Trx2 mRNA的表达量最低.内源性抑制因子TXNIP基因在2-4细胞胚胎阶段之前都是高表达,从8-16细胞胚胎阶段表达下降,在囊胚期胚胎表达量最低.【结论】牛卵母细胞及附植前胚胎自身的抗氧化能力在发育的不同阶段可能有所不同,而Trx1、Trx2及TXNIP基因在卵母细胞和不同发育阶段胚胎中的表达模式可能起到了重要的调控作用.     

牛磺酸在牛胚胎体外发育中的作用研究

研究了牛体外受精后早期胚胎体外发育时,向其基础培养液中加入牛磺酸对胚胎桑椹胚率、囊胚率和孵化囊胚率的影响,以探寻牛磺酸克服牛胚胎"体外发育阻滞"现象的作用。试验结果表明:以TCM-199 10?S为基础培养液(对照组),再加入7,14mM的牛磺酸(试验组),试验组与对照组的桑椹胚率分别为48.1%、47.4%和43.2%;囊胚率分别为26.4%、22.3%和21.0%;孵化囊胚率分别为21.8%、18.7%和0%。IVF后2细胞、4～8细胞及8～16细胞期,在基础培养液中分别添加7mM的牛磺酸时,桑椹胚率分别为48.7%、57.1%和52.0%,囊胚率分别为25.1%、30.7%和27.9%,孵化囊胚率分别为25.9%、28.6%和25.0%;而添加14mM牛磺酸组时,桑椹胚率分别为50.4%、56.4%和55.4%,囊胚率分别为26.5%、31.3%和27.7%,孵化囊胚率分别为27.5%、31.1%和29.9%。体外发育培养液中添加7mM牛磺酸可显著提高桑椹胚率和囊胚率(p<0.05),在4～8细胞期添加14mM牛磺酸最为合适。     

牛体外发育胚胎特定阶段差异表达基因研究

[目的]研究不同发育时期牛体外受精胚胎在基因表达模式上的差异。[方法]利用单个胚胎mRNA差异显示技术,对单个8细胞期胚胎与囊胚进行mRNA差异显示,获得1条特异表达条带,对其进行克隆、测序,并与GenBank进行对比。[结果]该序列与牛核糖体蛋白L31（ribosomal protein L31,RPL31）基因序列具有99%的同源性。采用实时定量PCR技术检测8细胞期和囊胚期胚胎RPL31的mRNA表达量,结果表明,RPL31在8细胞期胚胎的相对表达量为囊胚期胚胎的3.2倍。[结论]为揭示和阐明控制牛早期胚胎发育的相关机理提供依据。     

牛早期胚胎在不同培养液中体外发育比较

以卵丘/颗粒细胞单层作为共培养饲养层，比较了体外受精胚，卵母细胞孤雌激活胚和体细胞核移植胚在几种培养液中体外发育能力，以期筛选较适合体细胞克隆胚胎的体外培养系统。将体外受精卵分别置5种培养液中培养，囊胚发育率分别为20.43％、24.12％、32.10％、20.29％和29.03％，在CM1和CM2中囊胚的孵化率分别为8.64％和20％，结果表明，在添加10％的FBS时培养效果较好。卵母细胞孤雌激活胚在CM2-CM5中囊胚发育率分别是25.09％、29.84％和29.93％。核移植胚胎在CM3和CM5培养液中囊胚发育率为13.04％和9.26％。表明在共培养条件下CM3和CM5可以用于核移植胚胎的体外培养。     

不同培养条件对牛核移植胚胎体外发育的影响

[目的]进一步优化牛核移植胚胎的体外培养体系。[方法]在培养液中添加谷胱甘肽和胚胎培养的0~3 d采用5%O2浓度,在不同培养条件下对牛核移植重构胚胎进行体外培养,测定卵裂率8、细胞发育率、桑椹胚率以及囊胚发育率。[结果]结果表明,试验组B的8细胞发育率(38.3%)、桑椹胚率(17.0%)和囊胚率(8.5%)与对照组A(17.9%、1.3%、1.3%)差异显著(P<0.05)。试验组B和试验组C的桑椹胚率(17.0%、11.8%)、囊胚率(8.5%、7.8%)与对照组A(1.3%、1.3%)均差异显著(P<0.05)。[结论]在培养液中添加谷胱甘肽和胚胎培养的0~3d采用低O2浓度(5%O2),能够提高牛核移植胚胎的体外发育率。     

牛体外发育胚胎特定阶段差异表达基因的研究

[目的]研究不同发育时期牛体外受精胚胎在基因表达模式上的差异.[方法]利用单个胚胎mRNA差异显示技术,对单个8细胞期胚胎与囊胚进行mRNA差异显示,获得1条特异表达条带,对其进行克隆、测序,并与GenBank进行对比.[结果]该序列与牛核糖体蛋白131基因(ribosomal protein 131,RPL3])具有99%的同源性.采用实时定量PCR技术检测8细胞期和囊胚期胚胎RPL31的mRNA表达量,结果表明,RPL31在8细胞期胚胎的相对表达量为囊胚期胚胎的3.2倍.[结论]为揭示和阐明控制牛早期胚胎发育的相关机理提供依据. Abstract： The cattle different stage embryos obtained from in vitro was studied using the technology of single preimplantation embryo mRNA different display:single 8-cell and blastocyst stage embryos were studied using technology of mRNA different display and one different fragment was found.The result suggested that this fragment displayed high homology (99%) to cattle mRNA for ribosomal protein L31.Then to detect the expression of RPL31 mRNA in 8 cell and blastocyst stage embryos by real-time quantitative PCR,the result showed the relative amount of 8 cells was 3.2 times of blastocyst's.     

父源性印记基因在牛早期胚胎中的表达

【目的】研究父源印记基因在牛早期胚胎中的表达模式。【方法】利用Real-time PCR技术,检测Gnas、Grb10和Xist这3个父源性印记基因在牛体外受精（In vitro Fertilization,IVF）和孤雌激活（Parthenogenetic Activation,PA）胚胎各发育阶段的表达情况。【结果】对于IVF和PA两种来源的牛胚胎,Gnas在胚胎各发育阶段的表达没有明显差异;Grb10在2细胞阶段的PA胚胎中的表达量明显高于在IVF胚胎的,但从4细胞阶段到囊胚阶段,Grb10在两种来源的牛胚胎中表达没有明显差异;从2细胞阶段到8细胞阶段,Xist在两种来源的牛胚胎中表达没有明显差异,但从16细胞期开始,Xist在PA胚胎中的表达明显高于IVF胚胎的表达量。【结论】对于牛IVF胚胎和PA胚胎,Gnas、Grb10和Xist从2细胞期到囊胚期都可以检测到表达,但表达模式不同。这3个父源性印记基因在牛胚胎发育过程中可能发挥着重要的作用。     

体外生产的牛胚胎在不同发育期的性比率

本研究旨在证实牛体外培养的雄性胚胎生长发育是否快于雌性胚胎。胚胎的性别鉴定采用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）技术。在体外受精的第５天，胚胎根据发育期划分为三个组：１６细胞期，多于１６细胞期和桑椹期。在３个组中，雄性胚胎所占百分率分别是３２％，５３％和６３％。在体外受精的第７天，胚胎根据发育期划分为４个组：桑椹期、早期囊胚期、囊胚期和扩张囊胚期。在性别鉴定后，４个组中雄性胚胎所占百分率分别是２８％，３８％，６０％和７０％。结果表明：牛早期胚胎在体外培养条件下，雄性发育快于雌性。     

牛与小鼠胚胎在分化抑制培养系统中的行为比较

在自制培养基中，以原代小鼠胎儿成纤维细胞为饲层，观察比较了牛与小鼠胚胎在体外分化抑制培养体系中的生长行为，结果表明，牛囊胚一般培养36－60h后孵化脱带，96－120h后贴壁，120－144h为ICM传代的最佳时刻，小鼠囊胚 般培养12－24h孵化脱带，24－48h贴壁，72－96h为传的最佳时刻牛胚胎贴附于饲养层上生长，极易从饲养层上剥离，小鼠胚胎镶嵌在饲养层中，滋养层细胞与饲养层细胞间连接紧密，牛ICM色深发黑，集落隆起程度较低，小鼠ICM呈暗黄色，有呈柱状增殖的趋势，牛滋养层呈网状，小鼠滋养层为较致密的单层薄膜。     

甘蓝型油菜种子不同发育期基因差异表达cDNA文库构建

以授粉后27 d的种子mRNA为目标群体,授粉后7 d的种子mRNA为对照,构建甘蓝型油菜种子发育期基因差异表达文库.文库包括560个克隆,经菌落PCR检测,456个菌落含有插入片段,占全部克隆的91.2 %,片段大小200～600 bp.对PCR阳性克隆进行斑点杂交,得到201个上调的阳性斑点杂交阳性克隆,对其进行测序,得到有效ESTs序列198个.BLASTN结果显示,134个ESTs序列没有同源序列,可能是新基因,另外64个ESTs序列在油菜或拟南芥核酸数据库中存在同源序列.这64个ESTs序列和已知功能(主要是能量代谢、物质代谢、基因调控、衰老及抗性等)的蛋白有高度相似性.     

桃不同发育时期主要糖类含量和蔗糖合成酶基因表达水平的动态变化

为了揭示桃不同发育时期的果实、叶片、韧皮部中主要糖类含量的动态变化及其机理,以水蜜桃品种湖景蜜露为材料,采用高效液相色谱仪测定花后45 d、65 d、85 d、105 d时果实、叶片、韧皮部中蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨醇含量,并利用荧光定量PCR测定6个蔗糖合成酶基因的表达水平。结果显示,湖景蜜露果实以积累蔗糖为主,叶片和韧皮部以积累山梨醇为主,是典型的葡萄糖/果糖≈1的品种。花后105 d时果实中,蔗糖含量最高,其次是果糖和葡萄糖,山梨醇含量最低;相反,花后45~105 d,韧皮部和叶片的山梨醇含量均最高,蔗糖含量最低。花后45 d果实中蔗糖含量最低,盛花后85 d达到最高值,随后下降直到采收;花后45~105 d果实中葡萄糖、果糖、山梨醇含量的变化趋势与蔗糖相反。花后45~105 d,果实中果糖和葡萄糖含量显著高于叶片和韧皮部,而叶片和韧皮部之间无显著差异。花后65 d至果实采收期间叶片中山梨醇含量与果实中蔗糖含量变化趋势非常相似。果实和韧皮部发育过程中Pp Sus3远远高于其他基因的表达水平,Pp Sus1在叶片的整个发育过程中表达水平最高。表明Pp Sus3在果实和韧皮部、Pp Sus1在叶片中对糖类代谢可能具有更重要作用。     

果蝇硫化氢合成相关基因在不同虫态的转录水平

构建了23个物种的甲硫氨酸腺苷转移酶、甘氨酸N甲基转移酶、胱硫醚β合成酶和胱硫醚γ裂解酶的氨基酸序列的系统进化树,进化分析表明这4类蛋白均具有基本一致的系统进化关系,并且均被归为昆虫和哺乳动物两大类群。通过实时荧光定量PCR方法分析了黑腹果蝇不同发育阶段编码甲硫氨酸腺苷转移酶、甘氨酸N甲基转移酶、胱硫醚β合成酶和胱硫醚γ裂解酶的M(2)21AB、CG6188、CG1753和Eip55E基因的mRNA水平。结果显示:M(2)21AB基因mRNA水平在各发育阶段间无显著差异;CG6188基因mRNA的表达量在卵期较低,到了幼虫期显著升高,尤其在2龄幼虫期达到最高,而在蛹期和成虫期明显下降;CG1753基因mRNA的表达量在幼虫期明显上升,至蛹期达到最高水平,而在成虫期又显著降低;Eip55E基因mRNA水平在幼虫期、蛹期及成虫期均比卵期显著提高。以上结果表明,内源性H2S在黑腹果蝇中具有重要的生理学功能。     

不同发育时期亚麻茎秆中木质素积累相关miRNA及其靶基因的挖掘分析

[目的]深入挖掘分析亚麻茎秆不同发育时期木质素积累相关的miRNA及其靶基因,为解析亚麻纤维层木质素动态积累提供理论依据.[方法]以双亚4号(低木质素)和NEW(高木质素)花后20、30和40 d的茎秆为试验材料,基于miRNA测序和降解组测序结果分析miRNA转录水平动态变化及其靶基因注释功能,并采用实时荧光定量PCR检测2个亚麻品种间表达差异最显著的miRNA及其靶基因的表达模式.[结果]构建双亚4号和NEW花后20、30和40 d茎秆的miRNA文库,从中鉴定出305个miRNA,包括143个保守的miRNA和162个新鉴定的miRNA,且这些miRNA的靶基因不同转录本并非均受miRNA调控.将鉴定的305个miRNA与亚麻基因组序列信息进行靶基因预测,结果鉴定出286个miRNA的4807个靶基因,另外19个miRNA未预测到靶基因.通过对降解组测序数据进行整合分析,共获得21个miRNA的97个靶基因,共检测到97个降解位点,仅占鉴定出亚麻茎秆中miRNA靶基因总数(4807个)的2%,仍有大量的靶基因未被鉴定.对降解组中被降解的97个靶基因进行功能注释,发现有22个与植物生长发育有关,16个为转录因子,7个与植物次生代谢物积累有关.结合miRNA和降解组的测序结果,发现ama-miR156(Lus10003126)、bdi-miR397b-5p(Lus10017175)、lja-miR397(Lus10027782)、csi-miR160(Lus10021467)、aly-miR319c-p(Lus10008685)和gma-miR369h(Lus10011558)在双亚4号和NEW茎秆不同发育时期中最显著差异表达.实时荧光定量PCR检测结果显示,除gma-miR369h与其靶基因Lus10011558随亚麻茎秆的生长发育表达模式无明显规律外,其余5个miRNA与其靶基因表达模式恰好相反.[结论]亚麻茎秆木质素的积累过程与转录因子MYB、漆酶、生长素响应因子等编码基因密切相关,且这些基因可被其相应的miRNA负调控,并参与亚麻茎秆中木质素的积累.     

红掌“一叶一花”竞争生长特性及蔗糖促花处理研究

为探究红掌发育过程中叶与花的营养分配关系,以Alabama为试材,测定各时期植株的形态特征指标、叶片不同发育时期的净光合速率和海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)活性,并以蔗糖溶液处理叶片统计花芽发育状况。结果表明,对于在同一生长点上的叶片与对应的苞片,T1-T3时期主要发育叶片;T3-T5时期,叶片逐步停止面积扩大及叶柄伸长,自身消耗减少,并向苞片提供养分,使其迅速发育;苞片的TPS活性在T1、T4及T5时期高于叶片,T2及T3时期与叶片差异不大;质量分数为15‰、20‰及25‰的蔗糖溶液均使花芽出现百分率提高。综上,红掌“一叶一花”的特性使其不同时期花叶存在不同的营养竞争关系,蔗糖在红掌花发育过程中发挥重要作用。     

茶树花不同发育时期的转录组分析

为了揭示茶树花不同发育时期生长发育和生化成分代谢的分子机制,以‘黄棪’茶树品种为研究对象,通过高通量测序技术对茶树花两个发育时期(花苞期、开放期)的转录组进行比较分析.结果显示:转录组测序共获得135 039 271个过滤序列,GC含量为44.30%～45.35%;茶树花两个发育时期共获得18 352个差异表达基因,其中,上调的基因有8 019个,下调的基因有10 333个.对差异表达基因进行基因本体论(GO)及京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析,发现其主要富集在与茶树花生长发育、生化成分形成有关的植物激素信号转导、光合作用—天线蛋白、植物的昼夜节律、糖胺聚糖降解等代谢途径上.本研究结果表明,茶树花的发育受到植物激素的调控和光周期的诱导,与氨基酸、可溶性总糖有关的代谢途径随着花的发育发生了变化,该结果为进一步研究茶树花发育过程中的动态变化提供了参考.     

大豆凝集素和脂肪氧化酶双价RNAi表达载体的构建及其遗传转化

【目的】应用RNA干扰技术,同时抑制大豆凝集素(Soybean agglutinin,SBA)和脂肪氧化酶(Lipoxygenase,Lox)基因在种子中的表达,改良大豆营养品质,为培育优质大豆材料奠定基础。【方法】根据RNAi原理,酶切获得Lox目的片段,构建以除草剂Bar基因为筛选标记、种子特异性启动子P7αP启动SBA和Lox双干扰的pCAMBIA3301-SBA-Lox(pSBA-Lox)干扰表达载体,并通过农杆菌介导法转化大豆(品种为吉农28),采用PCR、Southern杂交和实时荧光定量PCR对转基因植株进行检测。【结果】质粒PCR和酶切鉴定结果表明,双价RNAi植物表达载体pSBA-Lox构建成功。将其转入到大豆中,对转化植株进行PCR、Southern杂交检测,结果显示,外源基因以单拷贝形式整合到植物基因组中,并能遗传给后代。T1代转基因植株的实时荧光定量PCR分析显示,转基因植株中SBA基因和Lox基因在籽粒中的表达量比未转化受体植株均明显降低,SBA基因表达量降低了35.9%~47.2%,Lox基因表达量降低了32.8%~56.1%,而在幼嫩叶片中的表达量相比对照植株变化不大。【结论】获得了大豆凝集素和脂肪氧化酶表达量均明显降低的T1代转基因大豆。     

9种杀螨剂对朱砂叶螨不同发育阶段的室内毒力测定

室内采用FAO推荐的玻片浸渍法和叶碟法分别测定了9种杀螨剂对朱砂叶螨雌成螨和卵的毒力。结果表明,杀螨活性最高的是阿维菌素,其次是溴虫腈,卡死克、噻螨酮、哒螨灵、三唑锡也具有较好的杀螨效果,炔螨特的杀螨效果较差,甲氰菊酯和氧化乐果的杀螨效果最差;阿维菌素对朱砂叶螨卵的毒力最高,毒力次之的是噻螨酮、哒螨灵、溴虫腈、三唑锡和卡死克,甲氰菊酯、炔螨特和氧化乐果对卵的毒力最差。另外,对朱砂叶螨雌成螨和卵毒力相差最大的是噻螨酮和哒螨灵,毒力分别相差150.27和134.28倍;其次为三唑锡,相差69.80倍;溴虫腈、卡死克、阿维菌素、氧化乐果、甲氰菊酯、炔螨特对卵和雌成螨的毒力差别相对较小。     

不同月龄早胜牛肉品质比较

【目的】分析不同月龄早胜牛的肉品质和加工性能,为充分挖掘早胜牛的肉用潜质提供参考。【方法】利用国标方法检测6,12,18和24月龄早胜牛背最长肌,测定其常规养分（粗蛋白、粗脂肪、灰分、水分含量）、氨基酸组分、肉色（亮度L^*、红度a^*、黄度b^*）、pH值、剪切力（鲜肉剪切力及排酸24 h后剪切力）及蒸煮损失、滴水损失率和系水率等指标,对不同月龄早胜牛肉品质和加工性能进行评价。【结果】随着月龄增加,早胜牛肉的剪切力、系水率显著增加,滴水损失显著减小（P<0.05）,其中6月龄牛肉剪切力和系水率均最小,滴水损失率最大;24月龄牛肉剪切力和系水率最大,而滴水损失率最小。随月龄的增加,肉色亮度显著下降,而红度显著上升（P<0.05）。18和24月龄早胜牛肉的pH值显著低于6和12月龄（P<0.05）;18和24月龄牛肉蒸煮损失显著低于6和12月龄,且以24月龄最小;随月龄的增加,早胜牛鲜肉剪切力显著增加（P<0.05）。24月龄牛肉粗脂肪含量显著高于其他各组（P<0.05）,而6月龄显著低于其他各组（P<0.05）,12与18月龄间无显著差异（P>0.05）;水分含量与粗脂肪含量的变化趋势正好相反;12与24月龄牛肉中的灰分含量无显著差异（P>0.05）,但均显著高于6和18月龄（P<0.05）。各月龄牛肉中的氨基酸、必需氨基酸、非必需氨基酸总含量均无显著差异（P>0.05）;鲜味氨基酸含量以18月龄最高,显著高于6月龄（P<0.05）,而与12和24月龄之间无显著差异（P>0.05）。6月龄牛肉的必需氨基酸占总氨基酸的比例、必需氨基酸与非必需氨基酸比例最高,分别为38.33%和62.00%,均显著高于18和24月龄（P<0.05）,但与12月龄之间无显著差异（P>0.05）。【结论】6月龄早胜牛肉最嫩,12月龄早胜牛肉营养价值最高,而24月龄早胜牛肉能获得较高得率的加工熟肉产品。