西门塔尔牛肌内和皮下脂肪miRNA表达谱及miR-27b靶基因分析

【目的】通过分析西门塔尔牛肌内脂肪和皮下脂肪差异表达miRNA,及对重要的候选miRNA-27b进行靶基因预测及相关生物信息学分析,探索miRNA在动物肌内脂肪生长、发育过程中的作用及其调控机制。【方法】利用miRNA微阵列芯片技术对肌内脂肪和皮下脂肪miRNA表达谱进行检测和分析以筛选差异表达miRNA;qRT-PCR方法验证4个在肌内脂肪显著高表达的候选miRNAs;采用Targetscan生物信息学计算方法预测目标miR-27b（对肌内脂肪沉积可能起重要调节作用）的靶基因,并对靶基因进行GO注释描述、富集分析及KEGG富集。【结果】miRNA芯片分析发现肌内脂肪和皮下脂肪共有88个差异表达极显著miRNA（P＜0.01）。候选的4个在肌内脂肪高表达miRNAs（miR-140、miR-145、miR-143、miR-27b）的qRT-PCR检测结果与芯片分析结果具有很好的一致性。KEGG富集显示,目标miR-27b的预测靶基因在MAPK、Wnt、Hedgehog、TGF-beta、GnRH等信号通路中显著富集,其中在MAPK信号通路中富集度最高。【结论】牛肌内脂肪和皮下脂肪组织中确实存在一些差异表达的miRNAs,某些重要的在差异高表达miRNA（如miR-27b）可能以独特的通路（如MAPK信号）来调节牛肌内脂肪的形成过程。     

猪miR-192/-215的组织表达谱及其关键靶基因分析

【目的】在前期通过Illumina Solexa高通量测序技术并结合荧光定量验证筛选出断奶仔猪E.coli F18菌株感染下表达量极显著上调的microRNAs-miR-192和miR-215的基础上,为了解miR-192和miR-215的组织表达情况,进一步筛选确定miR-192和miR-215靶向调控E.coli F18菌株感染的关键靶基因,为探讨miR-192和miR-215调控断奶仔猪E.coli F18感染的分子调控机制奠定基础。【方法】试验采用Real-time PCR方法检测miR-192和miR-215在35日龄梅山仔猪各个组织中的分布情况,同时利用MEGA 5.0分析了其保守性,TargetScan预测miR-192和miR-215的靶基因,并对靶基因分别进行Gene Ontology和Pathway通路的富集分析,进一步利用DAVID对靶基因蛋白进行功能分类,最后将预测的靶基因与课题组前期筛选出的断奶仔猪E.coli F18感染抗性相关的调控基因取交集。【结果】miR-192和miR-215在35日龄梅山仔猪十二指肠和空肠中均高度表达,二者成熟序列在脊椎动物中高度保守。miR-192和miR-215对应的靶基因相同,具有156个靶基因,只在轴突导向通路（axon guidance pathway）显著富集（P-value < 0.05）以及25个GO功能中显著富集（P-value < 0.05）。靶基因蛋白按功能分为12类,其中信号转导功能的磷蛋白（phosphoprotein）和DNA结合蛋白（dna-binding）占主要部分。靶基因与前期筛选的E.coli F18感染抗性相关的调控基因（GEO登录号：GSE26854）取交集,发现DLG5、ALCAM、FRMD4B、MIPOL1和ZFHX3 等5个基因为miR-192和miR-215的重要靶基因,其中DLG5为维持小肠上皮细胞结构完整性的重要因子。【结论】miR-192与miR-215是参与维持断奶仔猪肠道正常功能与抗F18大肠杆菌感染的重要因子,DLG5可能是miR-192和miR-215靶向调控E.coli F18菌株感染中关键的靶基因,今后需要进一步验证其能否作为梅山猪抗F18大肠杆菌的有效遗传标记。     

山羊miR-27a靶基因预测及生物信息学分析

繁殖力是决定羊养殖产业效益最重要的因素,卵泡的生长发育决定了排卵数,进而直接影响母羊的繁殖力。miRNA是由内源性基因编码的单链非编码RNA,参与靶基因的转录后调控。本研究通过对山羊miR-27a的靶基因进行预测及功能分析,为进一步研究其在山羊繁殖功能中的作用提供新途径。利用靶基因预测软件分析miR-27a的靶基因,将靶基因进行GO富集分析及KEGG信号通路分析。结果表明,预测靶基因集合分别富集在细胞增殖、转录调控、调控RNA代谢、正调控信号传导等分子功能上以及Erb B、MAPK、m TOR等信号通路中。     

藏绵羊不同毛色皮肤组织miRNA表达谱及靶基因分析

【目的】藏绵羊又称藏系绵羊,是中国三大粗毛羊品种之一,主要分布在西藏及其毗邻的高寒牧区,如青海、甘肃、四川、云南等地。藏绵羊由于其被毛纤维粗长,毛质细腻且保暖性好,是制造藏式地毯的上好原料。而毛色作为一种重要的经济性状,同时制约羊毛的经济价值。然而,目前对于绵羊毛色的分子调控机制尚不明确,以藏绵羊为研究对象,对其不同颜色皮肤组织（黑色和白色）进行转录组测序,旨在探讨miRNA在藏绵羊不同毛色皮肤组织转录后水平中发挥的作用及其可能参与的调控通路。【方法】选取2只具有黑白花毛色的健康藏绵羊,减去体侧被毛使皮肤完全裸露并用75%酒精消毒处理,屠宰后快速切取皮肤组织并保存在组织样品保存液中防止RNA降解,提取RNA后通过miRNA测序和生物信息学分析,获得藏绵羊不同毛色（黑色和白色）皮肤组织miRNA表达谱,筛选组织差异表达miRNA并预测相关靶基因。通过靶基因分析,获得与调控藏绵羊毛色性状可能相关的信号通路。【结果】黑色和白色皮肤组织共获得85.76兆条原始读长,经过滤后得到85.08兆条clean reads;共鉴定出334个已知的miRNA和59个新的miRNA;从中获得23个差异表达miRNA,其中14个差异表达miRNA在白色皮肤组织中表达显著上调,9个表达下调。miR-2284b和miR-744仅在藏绵羊白色皮肤中表达,而miR-23b、miR-411a-5p、miR-30c、miR-423-3p和miR-324-5p则仅在藏绵羊黑色皮肤中表达,但表达量相对较低。表达量最高的miRNA为miR-10a,而倍数差异最大的为miR-23b。其中,miR-10a可参与调节多种信号通路,其作用涉及增殖、分化、凋亡、细胞粘附等各个方面,目前并无调控绵羊毛色方面的相关报道,但其功能及作用机制的研究仍在不断扩展。miR-23b则与Wnt、Notch等信号通路有关,这些信号通路中的部分基因也和黑色素的生成有密切关系。结合倍数差异和miRNA表达量分析,miR-411a-5p、miR103和miR-200b可能也和毛色调控密切相关。本研究共预测出981个靶基因可能参与毛色调控,多数基因和WNT信号通路、MAPK通路、EDNRB信号通路及黑素原生成通路（melanogenesis pathway）相关,其中黑素原生成通路显示和WNT信号通路、KIT信号通路及EDNRB信号通路相互关联。黑素原生成通路显示藏绵羊不同毛色可能最终通过MITF基因调控下游的TYR基因（酪氨酸酶基因）影响黑色素的合成。同时,筛选7个差异表达miRNA进行定量验证,结果表明,5个miRNA在黑色皮肤组织中上调表达,2个miRNA在白色组织中上调表达,定量结果与测序结果一致。【结论】获得了藏绵羊皮肤组织miRNA表达谱,并通过生物信息学分析得到可能和调控毛色性状相关的miRNA和信号通路。这些结果表明,藏绵羊毛色性状可能受到多种miRNA的调控并涉及多个信号通路,这有助于更进一步了解毛色转录后水平的调控过程,并对进一步的功能验证奠定基础。     

绵羊甲状腺miR-370-3p靶向COL4A3基因调控繁殖力性状的初步研究

为探讨小尾寒羊甲状腺组织中与繁殖功能相关的miR-370-3p与COL4A3的靶向关系,本研究利用miRDB与Targetscan网站预测了miR-370-3p的靶基因,并取其交集进行功能富集分析,通过RNAhybrid与Targetscan网站预测绵羊miR-370-3p与候选靶基因的结合位点;随后检测了miR-370-3p与COL4A3基因在小尾寒羊甲状腺组织中的相对表达量。构建psiCHECK2-COL4A3-3′UTR-野生型/突变型双荧光素酶载体,并将其与miR-370-3p mimics/mimics NC共转染至HEK293T细胞并检测荧光活性。结果显示：1)miR-370-3p的靶基因可富集到孕酮介导的卵母细胞成熟、卵母细胞减数分裂、HIF-1信号通路、MAPK信号通路、mTOR信号通路、Ras信号通路和FoxO信号通路等与动物繁殖有关的信号通路中。2)miR-370-3p可与COL4A3基因3′UTR区域结合,且两者在小尾寒羊甲状腺组织中表达呈相反趋势。3)共转染psiCHECK2-COL4A3-3′UTR-野生型和miR-370-3p mimics组的荧光素酶活性显...     

热应激奶牛血清miRNA表达谱及miR-181a靶基因分析

通过分析热应激奶牛和正常奶牛血清差异表达miRNA,及对重要的候选miRNA进行靶基因预测及相关生物信息学分析,探索miRNA在荷斯坦奶牛发生热应激过程中的作用及其调控机制。利用miRNA高通量测序技术对奶牛血清中miRNA表达谱进行检测和分析以筛选差异表达miRNA;用RT-qPCR方法验证4个在热应激奶牛血清与正常奶牛血清中显著差异表达的候选miRNAs;采用Targetscan生物信息学计算方法预测目标miR-181a(对应激以及免疫反应可能起重要调节作用)的靶基因,并对靶基因进行GO注释描述、富集分析及KEGG富集。结果表明:miRNA高通量测序分析发现共有52个差异表达极显著miRNA(P0.01)。候选的4个miRNAs(miR-19a、miR-19b、miR-181a、miR-1246)的RT-qPCR检测结果与测序分析结果具有很好的一致性。GO和KEGG分析结果显示,miR-181a的靶基因与应激反应以及免疫功能密切相关,并且靶基因在B细胞和T细胞受体信号通路中显著富集。结论:在热应激奶牛与正常奶牛血清中存在差异表达的miRNAs,某些重要的miRNA(如miR-181a)可能以独特的通路(如B细胞和T细胞受体信号通路)来调节奶牛热应激的发生过程。     

ssc-miR-17-3p调控脂肪沉积的靶基因生物信息学分析

[目的]找到与猪脂肪沉积相关的候选靶基因,为ssc-miR-17-3p参与脂肪沉积调控机制研究提供相关理论依据. [方法]利用miRDB,miRWalk和TargetScan数据库获得了miRNA-17-3p候选靶基因;利用DAVID和KOBAS数据库对候选靶基因进行了KEGG/GO功能富集分析,并通过Cytoscape可视化工具构建了其可能参与的调控网络.[结果]结果表明,ssc-miR-17-3p候选靶基因TSTD2、CSDE1、SCGB1 D1、TEAD1、GPD2、NFATC3、MBNL1、PPP1R12B、CAMK2D、HBEGF、LRRC28、UBE2D4、MAP4与脂肪沉积有关.GPD2、CAMK2D、HBEGF等可能在催产素信号通路、MAPK信号通路、GnRH信号通路,以及脂质代谢、甘油磷脂代谢、糖醇代谢、大分子代谢,细胞代谢等过程发挥了作用.[结论]ssc-miR-17-3p可能通过调控多个靶基因,信号通路和生物过程影响脂肪的沉积与代谢,其功能有待进一步实验室试验验证.     

巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中miR-486靶基因的研究

【目的】为了深入挖掘巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中miR-486的靶基因,为最终阐明巴什拜羊优良肉质性状形成的分子调控机制奠定基础,同时为巴什拜羊的持续选育提供理论依据。【方法】分别采集了巴什拜羊胎儿期40,50,60,80,100和120 d,以及出生当天,出生后30,60和90 d共计10个不同发育阶段的骨骼肌组织,分别利用胎儿期6个阶段的混合mRNA和出生后4个阶段的混合mRNA构建了胎儿期和出生后骨骼肌中miR-486调控靶基因的cDNA文库,并利用高通量测序技术对cDNA文库中的靶基因信息进行了深入挖掘。在对所得候选靶基因功能分析的基础上,选择10个候选靶基因,使用qRT-PCR检测其在巴什拜羊上述10个不同发育阶段骨骼肌中表达量的变化,结合课题组前期获得的miR-486在巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中的表达规律,对其靶向调控关系及生物学功能进行初步验证和分析。进而选择其中的4个候选靶基因使用荧光素酶报告载体试验和巴什拜羊骨骼肌卫星细胞中的靶向调控试验最终确认其靶向调控关系。【结果】通过对两个cDNA文库高通量测序数据的分析,胎儿期和出生后分别获得了123个和118个miR-48...     

热应激对羊成肌细胞部分miRNA的影响及其生物信息学分析与靶基因预测

[目的]本文旨在探究热应激对羊成肌细胞部分miRNA的影响,并对miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p进行生物信息学分析与靶基因预测,揭示热应激下miRNA影响骨骼肌发育的调控机制。[方法]通过RT-qPCR技术研究热应激对羊成肌细胞miRNA表达量的影响;利用miRBase数据库获取不同物种中miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p的前体序列和成熟序列,并利用MEGA X软件构建系统进化树进行相似性分析;通过TargetScan、miRDB、RNA22、miRWalk对上述miRNA进行靶基因预测,使用DAVID对预测出的共同靶基因进行GO功能与KEGG通路富集分析,最后进行miRNA、共同靶基因与KEGG通路的关联分析。[结果]热应激显著下调羊成肌细胞在增殖阶段与分化阶段miRNA的表达。miR-23a、miR-24、miR-27a和miR-30a在不同物种间的保守性较高,除了牛的miR-24以外,成熟序列基本相同,种子序列完全一致。预测出的共同靶基因主要富集在细胞增殖、分化、周期、凋亡、迁移等GO条目,以及mTOR...