奶牛气管抗菌肽(TAP)基因乳腺特异性表达载体的构建与鉴定

【目的】构建奶牛气管抗菌肽（TAP）基因乳腺特异性表达载体。【方法】根据GenBank中牛TAP基因cDNA序列（GenBank号:NM₁74776）设计引物,从奶牛乳腺组织中RT-PCR扩增TAP基因编码序列,将其克隆到pMD19-T（simple）载体中测序。重组质粒pMD-TAP经EcoRⅠ+KpnⅠ双酶切回收目的基因片段,亚克隆到携带增强型绿色荧光蛋白的通用型乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP中,采用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞（bMEC）、COS-7细胞,并注射泌乳家兔乳腺组织,荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达,半定量RT-PCR检测家兔乳腺组织中TAP mRNA的表达。【结果】成功构建了乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP-TAP,该载体可在bMEC中特异性地表达绿色荧光蛋白;半定量RT-PCR检测发现,转染pBLG-EGFP-TAP可显著提高家兔乳腺组织中TAPmRNA的表达水平。【结论】成功构建了乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP-TAP,为进一步研究奶牛TAP基因的表达特性及利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供了重要材料。     

猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达

【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。     

牛白细胞介素-17真核表达载体的构建及在牛乳腺上皮细胞中的表达

【目的】在体外分离培养牛乳腺上皮原代细胞,并构建牛白细胞介素-17(bIL-17)基因真核表达质粒,观察重组质粒在牛乳腺上皮细胞的表达.【方法】提取牛脾脏细胞总RNA,通过RT-PCR扩增bIL-17,将bIL-17连入pMD19-T进行测序,测序成功后将bIL-17插入含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-N3上,构建真核表达质粒pEGFP-N3-bIL-17.用脂质体法将pEGFP-N3-bIL-17质粒转染于牛乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在细胞中的表达,RT-PCR检测bIL-17基因在细胞内的转录,定量ELISA检测bIL-17蛋白在细胞内的表达情况.【结果和结论】成功构建具有绿色荧光和新霉素抗性的双选择标记的牛白细胞介素-17真核表达载体,并可在牛乳腺上皮细胞成功表达.     

口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体的构建及VP1基因稳定表达细胞系的建立

【目的】构建口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1,并建立稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。【方法】采用RT-PCR技术从口蹄疫病毒材料中扩增出VP1基因,并将其连入慢病毒载体FG9中,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,转染BHK-21细胞,96h后经流式细胞分选筛选GFP阳性细胞,细胞增殖后经WB检测VP1基因的表达。【结果】VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1测序正确,转染BHK-21细胞经流式细胞仪筛选的GFP阳性细胞后可稳定表达VP1基因。【结论】VP1基因重组慢病毒载体构建成功并获得了稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。     

人IL-32-IgG4（Fc）融合蛋白在CHO/DG44细胞中的表达

【目的】构建人白细胞介素32(IL-32)和IgG4 Fc段的融合基因真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOp-tiVEC,建立稳定转染的中华仓鼠卵巢细胞(CHO/DG44)克隆,并检测其重组蛋白的表达。【方法】用PCR方法从脂多糖(LPS)激活的人CD4+T细胞cDNA中扩增出IL-32蛋白基因,并克隆到IgG4(Fc)-pOptiVEC载体上,构建重组质粒IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC,并进行酶切和测序鉴定。采用脂质体法,将重组质粒线性化后转染CHO/DG44细胞,进行RT-PCR检测,筛选阳性克隆,并对筛选的阳性克隆进行氨甲喋呤(MTX)加压筛选。利用ProteinG-Agarose亲和层析纯化转染CHO/DG44细胞培养上清液中的融合蛋白IL-32-IgG4(Fc),通过SDS-PAGE、Western-blot对融合蛋白IL-32-IgG4(Fc)的表达和生物学活性进行检测。【结果】PCR扩增获得了长度为564 bp的人IL-32蛋白基因cDNA,经测序与GenBank报道的序列一致。真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,获得了IL-32蛋白基因片段,其长度为564 bp。筛选出了能稳定表达IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白的CHO/DG44细胞克隆。亲和纯化后的IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,其分子质量约为50.0 ku,与预期结果一致。MTX加压后,IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白的表达量明显升高。【结论】成功构建了人IL-32蛋白融合基因的真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC,获得了能够表达具有生物学活性的IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白的CHO/DG44细胞克隆。     

山羊α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的构建 及核供体细胞的转染

为了构建α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体及提供山羊乳腺生物反应器α-乳清蛋白核移植供体细胞,提取乳腺组织中的总RNA,采用RT-PCR技术获得α-乳清蛋白基因cDNA,测序酶切后连接乳腺特异性表达载体pBCⅠ-Neo,并对重组载体进行酶切测序鉴定;取重组正确的载体酶切线性化后利用脂质体介导转染至山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选培养转染了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞。结果显示:经过RT-PCR特异性扩增克隆出α-乳清蛋白基因;克隆的基因碱基组成序列经测序与预期完全一致,α-乳清蛋白基因片段正向插入乳腺特异性表达载体;重组载体在山羊胎儿成纤维细胞中稳定转染,转入α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞生长迅速,仍保持原有的细胞生长形态。成功构建了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体,获得稳定转染的山羊胎儿成纤维细胞可用于核移植。     

SOCS1基因过表达对猪乳腺上皮细胞增殖和凋亡的影响

【目的】明确细胞因子信号转导抑制因子1基因（SOCS1）过表达对乳腺发育关键信号通路（JAK/STAT）相关基因表达的影响,为揭示SOCS1基因调节猪乳腺上皮细胞增殖和凋亡的作用机制提供参考依据。【方法】构建SOCS1基因过表达载体pcDNA3.1-SOCS1和阴性对照载体pcDNA3.1-NC,分别转染猪乳腺上皮细胞,然后通过CCK-8检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡情况,实时荧光定量PCR检测转染后JAK/STAT信号通路相关基因的表达变化。【结果】以过表达载体pcDNA3.1-SOCS1和阴性对照载体pcDNA3.1-NC分别转染猪乳腺上皮细胞,过表达载体pcDNA3.1-SOCS1转染组的SOCS1基因相对表达量极显著高于阴性对照载体pcDNA3.1-NC转染组（P<0.01,下同）;转染48和72 h后,过表达载体pcDNA3.1-SOCS1转染组猪乳腺上皮细胞的OD值极显著低于阴性对照载体pcDNA3.1-NC转染组,说明过表达载体pcDNA3.1-SOCS1能有效抑制猪乳腺上皮细胞的增殖能力;过表达载体pcDNA3.1-SOCS1转染组的细胞凋亡率...     

重组人gdnf在人乳腺肿瘤上皮细胞中表达的研究

为了在人乳腺肿瘤上皮细胞系中表达重组人胶质细胞源性神经营养因子(GDNF),本研究构建了牛β-casein基因启动子驱动的重组人GDNF乳腺上皮细胞特异表达载体,用脂质体介导法将其导入人乳腺肿瘤上皮细胞系Bcap-37细胞中,经G418抗性筛选8~10 d后,分离稳定表达红色荧光蛋白的转染细胞,PCR鉴定转基因细胞,用催乳素、胰岛素及氢化可的松诱导培养转基因细胞,RT-PCR和Western Blot检测重组人GDNF的表达分泌。结果表明:重组人GDNF乳腺上皮细胞特异表达载体被成功构建,转染Bcap-37细胞后,稳定整合到细胞染色体中,转基因细胞经激素诱导后能够表达分泌糖基化的GDNF,为高效制备与天然人GDNF蛋白结构完全一致的重组人GDNF蛋白用于帕金森病临床治疗研究奠定了基础。     

人凝血因子Ⅸ乳腺特异表达载体的构建及细胞转染

【目的】人凝血因子Ⅸ（human coagulation factor Ⅸ,hFIX）是凝血过程中的关键因子,对临床治疗血友病有着极其重要的意义。研究旨在构建人凝血因子Ⅸ乳腺表达载体,在猪乳腺上皮细胞中验证其乳腺特异表达能力,获得hFIX转基因雌性乳腺上皮细胞和猪胎儿成纤维细胞,为克隆乳腺特异表达人凝血因子Ⅸ的转基因猪做准备。【方法】按照TaKaRa公司RNAiso Reagent和Prime Script RT-PCR试剂盒的说明书,从人胎儿肝脏中提取RNA并扩增出人凝血因子Ⅸ（human coagulation factor Ⅸ,hFIX）cDNA序列,利用PCR方法扩增牛生长激素(BGH) polyA序列,将hFIX的cDNA序列与BGH polyA序列分别连接到表达载体pbCSN2-RC的牛酪蛋白（CSN2）启动子之后,构建带有新霉素抗性和红色荧光蛋白双筛选标记的乳腺特异性表达载体pbCSN2-hFIX-pA-RC。取本地屠宰的泌乳期猪乳房组织,利用组织块种植法培养猪乳腺细胞,并通过控时消化分离纯化猪乳腺上皮细胞,进行染色体分析后,挑选含有正常染色体数目的细胞,通过脂质体法将表达载体导入,经过G418筛选获得稳定表达红色荧光蛋白的转基因细胞,反转录、实时定量PCR验证乳腺表达载体构建的合理性和有效性。为了只对雌性胎儿成纤维细胞进行转基因操作,首先对培养的猪胎儿成纤维细胞进行SRY基因PCR扩增,确定其性别。之后,利用脂质体将证明有效的表达载体导入细胞,并进行G418和红色荧光蛋白表达筛选,对经过鉴定的阳性细胞进行扩大培养和冷冻保存,为下一步的体细胞克隆做准备。【结果】经PCR和酶切鉴定,人凝血因子ⅨcDNA和BGH PolyA成功克隆到载体pbCSN2-RC中,获得具有双筛选标记的pbCSN2-hFIX-pA-RC。转染后G418和红色荧光蛋白表达阳性的猪乳腺上皮细胞,经实时定量PCR鉴定,hFIX有高效表达,证明所构建载体具有指导人FIX在乳腺特异表达的能力,可以用于生产乳腺特异表达的动物。将构建的载体转入雌性猪胎儿成纤维细胞,经G418和红色荧光蛋白的表达筛选,成功获得hFIX转基因阳性细胞。【结论】pbCSN2-RC所含的牛β-酪蛋白启动子可以成功特异性诱导hFIX在猪乳腺细胞的特异表达,获得的hFIX转基因阳性猪胎儿成纤维细胞,为下一步通过体细胞克隆培育hFIX乳腺生物反应器奠定了基础。     

奶牛SREBP1蛋白在乳腺上皮细胞的表达定位及对SCD1基因启动子的转录调控

【目的】固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)作为核转录因子,对于细胞脂肪合成酶基因的表达发挥着重要的调控作用。论文旨在奶牛乳腺上皮细胞中研究SREBP1对于SCD1基因启动子的转录调控作用,为进一步明确SREBP1对于靶基因的转录调控机制提供理论基础。【方法】以荷斯坦奶牛乳腺组织的c DNA为模板,采用分段克隆的方法获得SREBP1基因的编码序列,通过重组酶与pc DNA3.1载体进行重组环化构建pc DNA3.1-SREBP1表达载体,将构建的载体测序验证后提取质粒,转染奶牛乳腺上皮细胞。以EIF3K基因为内参基因,采用荧光定量PCR检测SREBP1基因m RNA的表达差异;采用免疫荧光的方法对SREBP1进行标记,以DAPI复染细胞核,激光共聚焦观察SREBP1蛋白的亚细胞定位;转染含有不同调控元件的SCD基因启动子,同时转染1.0μg pc DNA3.1-SREBP1作为处理,荧光素酶报告基因系统分析启动子活性;分别转染0.25、0.5和1μg的pc DNA3.1-SREBP1载体,分析p GL3-SCD 2和p GL3-SCD3启动子活性与SREBP1之间的量效关系。【结果】分段克隆得到的PCR产物分别为1 170、1 116、363和900 bp的片段,经过与pc DNA3.1载体重组后获得pc DNA3.1-SREBP1表达载体,经酶切和测序验证,发现除1个无义突变外,与标准序列完全相同,整个序列长度达到3 510bp;将pc DNA3.1-SREBP1载体转染乳腺上皮细胞后,Real-time PCR检测发现与转染空载体的对照组相比,SREBP1基因的m RNA表达倍数增强130.4倍(P0.001);激光共聚焦观察发现,DAPI染色的细胞核呈蓝色,免疫荧光标记的SREBP1呈绿色,二者融合后呈现青色,共定位在乳腺上皮细胞核中;启动子活性检测发现,与p GL3-SCD1、p GL3SCD 2相比,SREBP1处理能够极显著增加p GL3-SCD3、p GL3-CD4启动子的活性(P0.001),分别比对照组提高了1.0倍和0.7倍,进一步分析发现,在用0.25—1μg的pc DNA3.1-SREBP1处理后,与p GL3-SCD2的启动子活性持续下降相比,p GL3-SCD3的启动子活性从59.81上升到108.43(P0.001),二者存在剂量效应关系,结合SCD2和SCD 3启动子上主要的结构差异SRE元件(5′-AGCAGATTGCG-3′),推测此序列可能是SREBP1调控SCD基因启动子转录的结合序列。【结论】克隆构建奶牛SREBP1基因表达载体,亚细胞定位SREBP1蛋白主要在乳腺上皮细胞核中,SREBP1可以与SRE调控元件结合促进SCD1基因启动子的转录。