肠炎沙门菌SEF14菌毛的抽提、纯化及生物学活性检测

试验从肠炎沙门菌国内标准株50336中抽提和纯化SEF14菌毛,并制备SEF14蛋白鼠源高免血清.结果发现,肠炎沙门菌在CFA培养液中,静止培养50 h左右,SEF14菌毛表达量相对较多,在机械高速匀浆后,经进一步的透析纯化,得到较纯的SEF14菌毛蛋白,蛋白大小和相关报道一致,约14 ku左右.Westem-blotting检测发现纯化的重组蛋白rSEFA(体外表达的SEF14菌毛主要亚单位蛋白SEFA)免疫小鼠得到的高免血清能识别标准株肠炎沙门菌SEF14菌毛蛋白以及纯化的重组蛋白rSEFA,说明体外抽提的SEF14菌毛蛋白和体外表达的rSEFA蛋白同样具有较好的免疫原性和反应原性.     

肠炎沙门氏菌SEF14菌毛研究进展

1 SEF14菌毛的发现 Feutrier等1986年首次在临床分离的一株人源肠炎沙门氏菌中发现一种菌毛(后来被称为SEF14菌毛),具有甘露糖敏感血凝反应(MSHA),形态上与肠杆菌科细菌的Ⅰ型菌毛难以分辨,蛋白质亚单位为14.4 kD,比伤寒沙门氏菌Ⅰ型菌毛亚单位(22.1 kD)小,N-末端18个氨基酸残基与大肠杆菌和伤寒沙门氏菌Ⅰ型菌毛同源[1].Müller等在同一株人源肠炎沙门氏菌分离株上鉴定了甘露糖敏感且形态和生化特性上不同于之前报道的SEF14的典型Ⅰ型菌毛[2].1990年Tahorns等通过单克隆抗体(MAb)介导方法在肠炎沙门氏菌表面鉴定出这一菌毛样结构,蛋白质亚单位为14.3 kD,直径小于5 nm,没有凝集红细胞能力[3].     

肠炎沙门氏菌SEF14菌毛亚单位sefA和sefD基因缺失株的致病性研究

为研究SEF14菌毛在肠炎沙门氏菌中的致病作用,本实验将SEF14菌毛亚单位编码基因缺失的肠炎沙门氏菌突变株50336△sefA和50336△sefD分别接种6周龄BALB/c小鼠和1日龄清远麻鸡,比较它们与其亲本菌株50336的致病性差异。结果显示,亲本菌株50336以及突变株50336△sefA、50336△sefD对小鼠的半数致死量分别为19.95 cfu、7.94 cfu和7.94 cfu,表明两个突变株对小鼠的致病性显著增强;而且对雏鸡的致病性结果也显示,突变株50336△sefA致病力较强,其感染雏鸡组死亡率为15%,而亲本菌株组死亡率为8.6%;另外50336△sefA和50336△sefD感染组7日龄时平均增重分别为15.38 g和18.39 g,亲本菌株组为19.06 g,对照组为26.43 g。研究结果表明SEF14菌毛亚单位基因缺失对肠炎沙门氏菌的致病性具有增强作用。     

肠炎沙门氏菌SEF14菌毛的表达及其对该菌的特异性检测研究

为获得肠炎沙门氏菌SEF14菌毛蛋白并检测其生物学功能,本研究以肠炎沙门氏菌标准株SE50336为模板,PCR扩增其含分泌信号肽的sef14操纵子基因片段,并克隆至表达载体pBR322中,构建重组质粒pBR322-sef14,将该重组质粒转化至经修饰且不含任何菌毛的大肠杆菌SE5000M株中,获得重组菌pBR322-s...     

肠炎沙门氏菌SEF14菌毛单克隆抗体的制备及初步应用

肠炎沙门氏菌现已成为全球性食品安全问题的主要病原之一。本试验基于肠炎沙门氏菌特异性SEF14菌毛，应用淋巴细胞杂交瘤技术成功制备了3株单克隆抗体杂交瘤细胞株，Westermhlotting检测结果显示3株单克隆抗体均具有良好的特异性。同时，用制备的单抗建立了双抗体夹心间接ELISA方法，利用方阵滴定确定捕获抗体和SEF14蛋白的最佳工作浓度分别为8μg／ml和2μg／ml。用该方法检测100份鸡血清样本，59份为阳性，与肠炎沙门氏菌特异性基因片段sdfI的PCR符合率达93％。本试验建立的方法特异性强、灵敏性高，可用于临床诊断，在肠炎沙门氏菌特异性检测方面具有潜在的应用前景。     

肠炎沙门菌SEF14菌毛与肠上皮细胞IPEC-J2和Caco-2的体外黏附作用研究

为研究肠炎沙门菌SEF14菌毛对肠上皮细胞的黏附作用,本试验利用肠炎沙门菌50336株、突变株50336△sefA、50336△sefD以及互补株50336△sefA (pBRA)、50336△sefD (pACYCD)与肠上皮细胞系细胞(IPEC-J2和Caco-2)进行了黏附作用.结果显示:上述菌株均能与IPEC-J2、Caco-2细胞进行有效黏附,并且随时间延长黏附数量有所增多,相同时间各菌株与IPEC-J2细胞的黏附数量明显多于Caco-2细胞;但细菌和细胞共感染1和4h后,肠炎沙门菌野生株、相应的突变株和互补株与IPEC-J2和Caco-2细胞黏附的数量差别很小,未到达显著差异水平(P＞0.05).结果表明:SEF14菌毛并不特异性介导肠炎沙门菌与肠上皮细胞系IPEC-J2和Caco-2的黏附作用,或者不是介导黏附作用的主要因子.     

肠炎沙门菌sef14基因缺失株生物学功能

构建了肠炎沙门菌参考株SE50336的SefA主要亚单位编码基因sefA的缺失株SE50336ΔsefA,进一步探究野生株及SEF14菌毛缺失株的生物学功能。以SE50336为模板,利用λ-red同源重组技术构建sefA缺失株,通过绘制生长曲线、生物被膜测定试验、刚果红-考马斯亮蓝无盐培养基菌落表型试验、RT-qPCR(real-time quantitative polymerase chain reaction)、人结肠腺癌上皮细胞(Caco-2)的体外黏附测定来检测和比较2种菌株的生物学特性,并利用野生株和缺失株分别攻毒小鼠,探究SEF14菌毛对肠炎沙门菌致病力的影响。结果显示,野生株及缺失株生长情况无明显差异。与野生株相比,ΔsefA缺失株的生物被膜形成能力有所下降;菌落表型试验中野生株表现出典型的rdar(red, dry and rough)表型,而ΔsefA缺失株表现出saw(smooth and white)表型;RT-qPCR试验中,野生株的生物被膜形成主要关联基因csgA、bcsA、pgaC、fimA的转录量均显著高于ΔsefA缺失株。但缺失株与野生株对于Caco-...     

肠炎沙门氏菌SEFA基因表达和间接ELISA检测方法的初步建立

为了给临床检测肠炎沙门氏菌的感染和血清学调查提供一种切实可行的方法,本研究根据肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子亚单位sefA基因序列设计一对引物,利用PCR技术从国内标准株CMCC(B)50336中扩增sefA基因,并按预定的阅读框插入表达载体pET22b+中,获得重组质粒pET-sefA,限制性内切酶结合琼脂糖凝胶电泳分析和序列测定结果表明,该序列大小为498bp,与已发表的sefA结构编码序列完全一致。重组质粒pETsefA转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)并能获得高效诱导表达,通过对菌体裂解上清液SDS-PAGE和western blot分析鉴定,该重组菌可以表达大小为15.2ku的可溶性重组蛋白rSEFA。纯化的rSEFA免疫小鼠所得高免血清以及标准株CMCC(B)50336感染小鼠后所获阳性血清,均能识别标准株肠炎沙门氏菌SEF14菌毛蛋白以及纯化的重组蛋白rSEFA,结果表明明体外表达的rSEFA蛋白有较好的免疫原性和反应原性。而基于rSEFA介导的间接ELISA有较好的特异性,对肠炎沙门氏菌特异性抗体检测有潜在的应用前景。     

鸭源大肠埃希氏菌K99菌毛基因克隆表达及生物信息学分析

为研究不同动物源性K99菌毛基因的差异,以含K99菌毛基因的鸭源大肠埃希氏菌为研究对象,通过PCR方法扩增出不含信号肽K99菌毛基因片段,分别克隆至pMD19-T和pET-32a载体,进行基因序列测定及免疫印迹分析。结果表明,所获得2个不同的K99基因序列,长度均为498 bp,除去酶切位点编码氨基酸159个,理论等电点为8.96,均带正电荷,脂肪系数均为58.43。编码蛋白均为稳定的亲水性蛋白,具有相同B细胞抗原位点。2个K99菌毛基因序列之间的同源性为99.6%,与GenBank的序列比对,鸭源K99菌毛基因与牛源、猪源的K99菌毛基因的同源性较高,说明不同动物源K99菌毛基因之间变异小,相对保守。所表达的重组蛋白能与兔抗K99单因子血清发生特异性反应。研究结果为检测不同动物来源的产肠毒素大肠埃希氏菌及相关生物制品开发应用奠定基础。     

鸡源致病性大肠埃希菌菌毛基因研究进展

菌毛是鸡大肠埃希菌的重要致病因子之一。文章对鸡源致病性大肠埃希菌菌毛的特点及分类,各型菌毛亚单位基因结构及其功能与控制,鸡源致病性与其他动物源大肠埃希菌菌毛之间的同源性进行了综述。这对了解菌毛亚单位基因结构与致病力的关系,探讨鸡源大肠埃希菌的致病力与分布有重要意义。     

副猪嗜血杆菌毒力因子的研究进展

本文主要对副猪嗜血杆菌的外膜蛋白、荚膜多糖、脂多糖、菌毛、转铁结合蛋白和酶类等主要毒力因子的相关研究进展进行了综述。     

猪源产肠毒素性大肠杆菌主要毒力因子研究进展

产肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是引起婴幼儿和幼畜腹泻的主要细菌性病原,初生幼畜感染后常因剧烈腹泻脱水而死亡。菌毛黏附素和肠毒素是ETEC目前研究最多的2类毒力因子,随着技术手段的不断进步和研究的深入,一些新型毒力因子不断被发现,如鞭毛、非菌毛黏附素、肠聚集性耐热毒素(the enteroaggregative heat-stable toxin1,EAST1)、自转运黏附蛋白、细胞溶血素等。本综述主要针对猪源ETEC的主要毒力因子以及新型毒力的结构功能及致病性进行阐述,为进一步深入探索ETEC的致病机理提供理论基础。     

禽致病性大肠杆菌菌毛研究进展

禽致病性大肠杆菌的血清型以O1、O2、O8、O78等为主。研究表明，这类大肠杆菌均具有菌毛。菌毛叉称纤毛、柔毛，是大肠杆菌的一种蛋白质突起，禽大肠杆菌菌毛主要有I型菌毛和P型菌毛两种，目前认为菌毛是大肠杆菌的重要致病因子，与大肠杆菌的致病性密切相关，菌体借助菌毛与气管黏膜上的特异性受体结合，从而致病。菌毛在体外的表达具有温度及营养的依赖性。近年来，对大肠杆菌菌毛的研究越来越多，特别是随着分子生物学的发展，对禽大肠杆菌菌毛的研究也不断深入，取得了不少的研究成果。本文试就禽致病性大肠杆菌菌毛的体外表达与提取、粘附特性与致病性、免疫学特性及其分子生物学的有关研究作一综述，以供参考。     

禽源致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛亚单位蛋白的功能与基因控制

禽源致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛是禽大肠杆菌病的一种重要的致病因子,为一种蛋白质突起,具有良好的免疫原性。与人畜致病性大肠杆菌粘附素菌毛相比,禽源性大肠杆菌的菌毛研究起步稍晚,尤其对其亚单位（ＦｉｍＢ、ＦｉｍＥ、ＦｉｍＡ、ＦｉｍＩ、ＦｉｍＣ、ＦｉｍＤ、ＦｉｍＦ、ＦｉｍＧ、ＦｉｍＨ等）的功能及基因控制报道尚少,直到近年来,人们对此才有较多的了解。近年研究表明,ＦｉｍＡ是Ⅰ型菌毛的主要结构蛋白,ＦｉｍＡ的表     

2型猪链球菌SsU05-0474的表达纯化及单克隆抗体制备

为了鉴定2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,Ss2)菌毛骨架蛋白Ss U05-0474(本文中简称SsMps)在菌体中的位置和存在形式,本研究以2型猪链球菌05ZYH33菌株基因组作为模板,PCR扩增菌毛骨架蛋白基因Ss U05-0474,将其克隆至表达载体pET22b,构建重组质粒pET22b/SsMps,转化至E.coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达SsMps蛋白,并通过亲和层析纯化。纯化的SsMps蛋白免疫BALB/c雌鼠,利用细胞融合筛选制备该重组蛋白的单克隆抗体。结果显示,SsMps蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,分子质量大小为45 k Da。每升大肠杆菌培养物可获得SsMps重组蛋白约30 mg,纯度大于95%。获得了1株该重组蛋白的单克隆抗体1D9,抗体亚型为IgG1/κ。通过单抗1D9与05ZYH33菌体蛋白组分Western blot,发现该抗体能够特异识别SsMps,并定位出SsMps大部分存在于细胞壁蛋白成分中,呈不同聚体存在。本研究制备的SsMps纯化蛋白及其单克隆抗体为研究SsMps蛋白的功能提供了工具。     

大肠杆菌毒力因子研究概况

致病性大肠杆菌的毒力因子主要有黏附素、毒素、外膜蛋白 ( OMP)及铁转运系统等。在大肠杆菌侵袭宿主组织并引起其发病的过程中 ,这些毒力因子相互协调、发挥作用。文章对毒力因子的致病作用、致病机理、免疫原性及其在疾病防制中的应用几个方面的研究概况作了综述 ,为防制大肠杆菌病、研制新型高效的大肠杆菌疫苗提供了理论依据。另外 ,文章还介绍了近年来已相继研制成功的全菌体疫苗、纯化菌毛疫苗、单价或多价基因工程菌毛疫苗以及重组肠毒素双价基因工程苗、OMP亚单位疫苗等。展现了新型疫苗的研制 ,给防制大肠杆菌病带来了新的前景以及大肠杆菌作为工程菌的应用对畜禽其他疾病防制的推动作用     

冰浴磁力搅拌法分离细菌菌毛的研究

菌毛(pili)是细菌表面的一种蛋白性突起。研究表明,某些细菌的菌毛与细菌对宿主上皮细胞的粘着起到至关重要的作用。如大肠杆菌 k_(88)、k_(99)菌毛对仔猪、犊牛的肠粘膜上皮的粘着,有利于大肠杆菌对肠的定居;禽致病性大肠杆菌通过菌毛粘着于鸡的呼吸道上皮细胞,以利于细菌获得侵袭的通道。实际上,菌毛已成为细菌的一种重要的致病因子。对菌毛的研究正日趋增多。研究菌毛的特性,分离提纯菌毛是     

细菌黏附素研究进展

黏附素是细菌表面某种特定的蛋白质结构或糖脂成分,可存在于细菌的细胞壁、外膜蛋白、鞭毛、菌毛及微毛等结构中。近年来关于细菌黏附素的研究取得了一些进展,笔者主要从细菌黏附素的发现、黏附现象及其机理、主要的一些细菌黏附素与黏附素受体、细菌黏附素研究的应用等方面作一综述。     

沙门氏菌PEG菌毛研究进展

正菌毛是细菌表面一种特殊的细丝状结构,其顶端的粘附素蛋白可以结合宿主的特定组织细胞,是细菌黏附、定植致病的关键蛋白。同时,菌毛具有良好的免疫原性~([1]),在疫苗的研制和诊断试剂的研发等领域具有重要的意义。此外,某些菌毛存在对细胞的侵袭和促进生物被膜形成能力~([2]),因此菌毛研究领域一直是研究的热点。     

沙门氏菌菌毛研究进展

基因组生物信息分析表明沙门氏菌同时含有多种菌毛操纵子基因序列,在不同血清型沙门氏菌中具有多样性分布特征,很可能是不同血清型沙门氏菌在不同环境下的进化结果。本文就沙门氏菌菌毛操纵子编码基因的分类,菌毛分子结构特征及不同菌毛在遗传进化、致病性、传染性中发挥的作用做简要综述。