白菜雄性不育相关基因BcMF3和BcMF4的A9启动子的基因沉默植物表达载体的构建

以白菜(Brassica campestris ssp.chinensis,syn.B.rapa ssp.chinensis)雄性不育相关基因BcMF3和BcMF4为沉默对象,利用绒毡层组织特异性的A9启动子,构建了反义RNA、RNA干涉和双价反义RNA植物表达载体。结果表明,经过一系列分子操作,获得了A9启动子和目的基因片段,并利用它们构建了5个基因沉默植物表达载体,可用于基因功能验证。     

白菜雄性不育相关基因BcMF4的反义RNA验证

根据普通白菜(Brassica campestris ssp.chinensis var.communis)雄性不育相关基因BcMF4的cDNA序列设计特异引物,从普通白菜花蕾cDNA中扩增出607 bp的片断,然后将该片段连接至双元载体pBI12l中,得到反义RNA植物表达载体并导入农杆菌LBA4404菌株中;通过组织培养途径转化菜心(B.campestris ssp.chinensis var.parachinensis),得到了12株转基因植株,其中5株的43.7%的花粉为缩小空瘪畸形,29.6%的花粉缺乏生活力,而且其花粉离体萌发率降低至24.7%.结果表明,反义RNA技术沉默BcMF4基因导致了菜心转基因植株的部分花粉发育不良,BcMF4基因在普通白菜和菜心等花粉发育中起着重要作用.     

BcA9-Barnase转基因雄性不育甘蓝的获得

将白菜绒毡层特异启动子BcA9驱动下的核糖核酸酶Barnase基因,通过农杆菌介导的下胚轴转化导入甘蓝材料‘TF’,获得具有除草剂Basta抗性的甘蓝转基因植株.经PCR鉴定,BcA9-Barnase融合基因已经整合到甘蓝基因组中.细胞学观察显示,转基因甘蓝植株的花药因绒毡层细胞提前降解,花粉母细胞退化,成熟花药中无正常花粉粒产生.相对非转基因对照,转基因甘蓝植株花器官变小,花瓣褶皱多,柱头弯曲,雄蕊瘦小等现象.另外,转基因植株在温度低于22℃时出现明显的死蕾现象,当温度高于25℃时,死蕾现象得到缓解.田间结实情况调查显示,转基因甘蓝植株自交不能结实,与野生型杂交可结实但种荚变短.     

白菜雄性不育相关基因BcMF3功能的反义RNA验证

为了研究白菜等十字花科植物花粉发育及雄性不育发生的机理,根据编码果胶甲酯酶的白菜雄性不育相关基因BcMF3的cDNA序列设计特异引物,从普通白菜(Brassica campestris ssp.chinensis var.communis,syn.B.rapa ssp.chinensis var.communis)花蕾cDNA中扩增出458 bp的片断,构建BcMF3的反义RNA植物表达栽体,然后转化菜心(B. campestris ssp.chinensis var.parachinensis).研究发现,31.3%菜心转基因植株花粉表现出畸形,而且只有部分花粉具有活力,花粉离体萌发率降低为31.6%,其花药果胶甲酯酶活性降低了12.8%.上述结果表明BcMF3基因与普通白菜和菜心等白菜植物的花粉发育密切相关.     

水稻钙依赖型蛋白激酶OsCPK9基因启动子的克隆及在烟草中的瞬时表达分析

植物钙依赖型蛋白激酶(CDPK)调控钙信号途径下游组分,与植物的生长发育及各种逆境生理过程密切相关。通过对本课题组克隆的水稻OsCPK9基因的cDNA序列与NCBI中的水稻基因组数据库进行比对、定位,结合生物信息学的方法,预测到基因上游的一段启动子序列。进而利用PCR的方法从水稻‘日本晴’(Oryza sativa L. cv. Nipponbare)基因组DNA中克隆到了水稻OsCPK9基因5’端上游约2 kb的DNA序列,命名为POsCPK9。PLANTCARE在线分析表明,POsCPK9序列除包含植物启动子所必备的基本元件如TATA box 和CAAT box外,还含有多个与逆境和信号物质相关的顺式表达元件。将克隆到的POsCPK9取代pBI121中的CaMV 35S 启动子,构建成POsCPK9与GUS的融合表达载体POsCPK9 GUS;通过农杆菌介导的方法在烟草的根、茎、叶中进行瞬时表达。结果显示,该启动子驱动的GUS基因在烟草的根、茎、叶中都有不同程度的表达。说明OsCPK9基因上游2 kb具有启动子活性。     

白菜雄性不育相关新基因BcMF1的分离及特征分析

【目的】筛选与白菜雄性不育性状相关的新基因,为研究植物雄性不育的分子机制提供依据。【方法】利用cDNA-AFLP技术分析白菜核雄性不育两用系‘ZUBajh97-01AB ’的表达差异,在可育株群中扩增出1条特异条带BcMF-A15T17,通过RACE和PCR技术扩增得到该基因的cDNA和DNA全长序列,并用Northern杂交验证了该基因的表达特征。【结果】该基因被命名为BcMF1,它的cDNA全长为1 684 bp,基因全长为1 985 bp,BcMF1基因仅在两用系可育株群的中、大花蕾中特异表达。推测的BcMF1蛋白含有471个氨基酸,与拟南芥未知功能蛋白家族DUF1216成员的相似性较高,预测该蛋白是一个定位在胞外的分泌蛋白。【结论】BcMF1基因是一个与白菜细胞核雄性不育相关的新基因。     

结球白菜反义BcpLH基因转化株幼苗对生长激素的反应

4种浓度的植物生长素处理苗期的结球白菜反义BcpLH基因转化株后发现, IAA处理的转化株叶色变淡,叶片外卷.激素浓度在0 ～ 0.01 mmol·L-1和1.0～10.0 mmol·L-1两个区域时,转化株和非转化株的叶形指数略有增加,而在0.01～1.0 mmol·L-1范围内,两者的叶形指数均呈下降趋势,表明IAA在此浓度范围内,叶肉细胞沿主叶脉方向的纵向生长受到的抑制强于横向生长所受到的抑制.虽然0.1 mmol·L-1以上浓度的IAA对转化株和非转化株的叶柄生长都具有抑制作用,但与非转化株相比,转化株的反应较为迟钝.对非转化株的下胚轴生长有不同作用的IAA拐点浓度是0.01 mmol·L-1,而转化株的拐点浓度是1.0 mmol·L-1.IAA对转化株和非转化株的主根生长都有促进作用,但转化株对IAA的敏感性弱于非转化株.     

白菜谷胱甘肽过氧化物酶基因GPX的鉴定与分析

为研究白菜谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GPX）基因的生物学特征,从白菜全基因组数据库中筛选了10个GPX基因。基于公开的白菜转录组测序数据,分析了GPX基因在胚胎发育和器官中的表达情况,并且通过生物信息学手段对这10个GPX基因进行基因定位、启动子分析、基因结构、系统树构建和基因表达等研究。结果表明,BrGPX5基因的编码区中有6个内含子,其余基因均只有5个内含子,说明BrGPX5基因在进化过程中获得了一个内含子,导致氨基酸分子量增加;另外,每个GPX基因的启动子区都有2个及以上的E\|box元件。     

水稻蜡质合成相关基因 OsCER4 自身启动子驱动的反义RNA转化植株获得

水稻OsCER4基因编码脂肪醛脱羧酶,与拟南芥CER1基因高度同源,是否参与植物表面蜡质合成尚不清楚,为了探讨其功能,扩增了OsCER4基因起始密码子ATG上游约2 kb的序列作为该基因的启动子,以常规技术将启动子和OsCER4基因反义片段克隆到pCAMBIA双元载体1380中,采用农杆菌介导法转化粳稻品种中花11,并进行了转化苗OsCER4蛋白的表达量变化分析.结果表明,成功构建了由OsCER4自身启动子驱动的反义RNA载体,并通过农杆菌介导法成功转入水稻中花11中,多数OsCER4基因反义转化植株为阳性转化植株,后代分离比符合3∶1,反义RNA转化植株在蛋白水平上的表达量下降.     

水稻rbcS启动子的克隆及其在转基因水稻中的特异性表达

为将高效特异的启动子用于转基因水稻研究,利用PCR技术从水稻‘中花11’基因组DNA中克隆了rbcS启动子,序列分析表明,扩增片段(2 746 bp)与已报道的该基因序列相应区域的同源性达99.2%。将rbcS启动子与GUS报告基因融合构建了由rbcS启动子引导GUS基因的植物表达载体,经农杆菌介导法导入到水稻中。对转基因水稻植株中GU S活性的定性与定量测定结果表明,rbcS启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株叶片中的特异性表达,其表达水平高于C aMV 35S组成型启动子,而在转基因水稻植株根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,表现出明显的组织特异性。     

Effect of the Antisense BcMF12 Driven by the BcA9 Promoter on Gene Silencing in Brassica campestris L. ssp. chinensis

The study analyzed the silencing of BcMF12 gene regulated by BcA9 promoter in the transgenic pakchoi and confirmed the effect of antisense BcMF12 gene on the pollen development. A conserved BcMF12 gene fragment was amplified from the cDNA of flower buds in pakchoi (Brassica campestris L. ssp. chinensis, syn. B. rapa L. ssp. chinensis) and was fused to the anther specific BcA9 promoter. The plant antisense expression vector was constructed and then introduced into pakchoi via Agrobacterium-mediated transformation. The transgenic plants were screened by antibiotics and molecular analysis. PCR and Southern blot revealed that the antisense BcMF12-GUS fusion gene regulated by BcA9 promoter was integrated into transgenic plants. Northern blot suggested that the expression of BcMF12 gene was down-regulated significantly. The pollen germination rate of transgenic plants with antisense BcMF12 gene decreased as compared with that of the control plants. The expression of the gene BcMF12 related to the pollen development was inhibited by the antisense BcMF12 driven by BcA9 promoter, which consequently affected the pollen development in pakchoi.     

Effect of the Antisense BcMF12 Driven by the BcA9 Promoter on Gene Silencing in Brassica campestris L. ssp. chinensis

The study analyzed the silencing of BcMF12 gene regulated by BcA9 promoter in the transgenic pakchoi and confirmed the effect of antisense BcMF12 gene on the pollen development. A conserved BcMF12 gene fragment was amplified from the cDNA of flower buds in pakchoi （Brassica campestris L. ssp. chinensis, syn. B. rapa L. ssp. chinensis） and was fused to the anther specific BcA9 promoter. The plant antisense expression vector was constructed and then introduced into pakchoi via Agrobacterium-mediated transformation. The transgenic plants were screened by antibiotics and molecular analysis. PCR and Southern blot revealed that the antisense BcMF12-GUS fusion gene regulated by BcA9 promoter was integrated into transgenic plants. Northern blot suggested that the expression of BcMF12 gene was down-regulated significantly. The pollen germination rate of transgenic plants with antisense BcMF12 gene decreased as compared with that of the control plants. The expression of the gene BcMF12 related to the pollen development was inhibited by the antisense BcMF12 driven by BcA9 promoter, which consequently affected the pollen development in pakchoi.     

不结球白菜BcGAPDH的生物信息学分析

采用生物信息学方法对克隆测序的不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis)Bc GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)蛋白质的理化性质、跨膜区、亲水性、亚细胞定位、所含模体及蛋白质结构进行了预测。理化性质分析表明,该酶含有328个氨基酸,相对分子量为35 161.2,p I值为9.03。TMpred跨膜分析表明,该酶没有跨膜螺旋区,这与Prot Scale预测的该酶为亲水性蛋白质相吻合。用Target P server程序预测该酶定位于线粒体上,结构域分析表明该酶含有多种磷酸化位点,二级结构以α-螺旋和随机卷曲为主。借助SWISS-MODEL软件对该酶进行了三维同源建模。     

镉对小白菜光合作用特性影响的研究

研究表明,微量镉(Cd)(0.01、0.1 mg/L)促进小白菜(Brassica campestris ssp.chinensis)生长,对苏州青的促进作用更明显;高浓度Cd显著抑制地上部生长,对根系生长影响相对较小.Cd降低小白菜叶绿素含量,特别是苏州青降低幅度较大.低浓度Cd对小白菜净光合速率Pn影响不大,高浓度Cd可能是由于非气孔限制而引起Pn降低.Cd降低气孔导度,但高浓度Cd增加胞间CO2浓度.叶绿素荧光测定表明,Cd对小白菜叶片光化学效率Fv/Fm影响不大,而高浓度Cd明显降低光合电子传递量子效率ΦPSⅡ、光化学淬灭系数qP和电子传递速率ETR.Cd增加沪青一号非光化学淬灭系数qNP,而苏州青在高Cd浓度下qNP下降.     

不结球白菜BrCBF基因cDNA全序列克隆及结构特征分析

运用RT-PCR和RACE技术从不结球白菜中克隆到1个抗寒相关基因,命名为BrCBF,基因登陆号为DQ402470.其cDNA全长1 003 bp,含有648 bp的完整开放阅读框,编码216个氨基酸,该基因编码的蛋白序列与拟南芥、荠菜、甘蓝型油菜编码的氨基酸序列有极高的同源性,且具有CBF典型的保守结构域AP2.     

不结球白菜BrCOR14基因cDNA全序列克隆及结构特征分析

通过设计保守的基因特异引物,运用RT-PCR、RACE技术从不结球白菜中获得1个抗寒相关基因,命名为BrCOR14,登录号为DQ192529,cDNA全长549 bp,含有387 bp的完整开放阅读框,编码128个氨基酸.该基因编码的氨基酸序列与油菜、拟南芥、荠菜编码的氨基酸序列有极高的同源性.     

不结球白菜晚抽薹BcFLC1基因克隆及表达分析

采用RT-PCR、5'RACE和3'RACE方法,克隆得到了不结球白菜NJ074晚抽薹基因(BcFLC1)的cDNA全长序列。对BcFLC1基因所编码氨基酸序列的理化性质进行分析推测得到:该基因cDNA全长909bp,包含576bp的开放阅读框,编码191个氨基酸。不结球白菜BcFLC1蛋白功能域预测分析结果表明:该基因为MADS盒基因,其编码蛋白的1～60氨基酸属于MADS盒基因蛋白。荧光定量PCR分析表明:BcFLC1基因在不同生长发育阶段叶片中的表达情况不同,抽薹前高于抽薹后叶片中的表达量。BcFLC1基因在不同部位表达也存在差异,表达量从高到低依次为:叶、茎、花蕾、花和根。     

不同春化时间对不结球白菜现蕾开花的影响

为探求不同品种不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)的冬性强弱,找出其适宜的春化时间,以4个不结球白菜品种为试材,在3℃条件下分别对萌动种子春化处理10、15、20、25 d,调查不同春化时间对各品种现蕾开花的影响,综合评价植株现蕾开花早晚及开花期植株形态。结果表明,奶白菜最适春化时间为10 d,青梗白菜最适春化时间为15 d,乌塌菜最适春化时间为20 d,京水菜最适春化时间为25 d。4个不结球白菜品种冬性由弱到强为奶白菜、青梗白菜、乌塌菜、京水菜。     

不结球白菜抗根肿病遗传规律和分子标记

[目的]探讨不结球白菜根肿病抗性的遗传规律。[方法]该研究利用引进的结球白菜与不结球白菜进行杂交,以双亲、F1、F2和BC14个世代联合群体为试材,采用苗期接种鉴定法进行抗性鉴定,并进行 ISSR分子标记筛选。[结果]不结球白菜根肿病抗性受1对显性基因控制。利用ISSR分子标记结合 BSA法获得了与不结球白菜根肿病抗性连锁的分子标记,命名为CR-873。该标记与抗性基因间的连锁遗传距离为9.72 cM。[结论]研究结果可为不结球白菜分子标记辅助育种奠定基础。