青海省马铃薯卷叶病毒的RT-PCR法检测

根据马铃薯卷叶病毒（PLRV）外壳蛋白基因的保守序列设计了一对寡聚核苷酸引物,从田间自然感染PLRV的马铃薯病株中提取病毒总RNA,用反转录-聚合酶链式反应扩增出符合设计大小240bp的特异性产物,而对照没有任何扩增产物。建立了快速、准确检验PLRV的分子检测方法,为青海省马铃薯生产中卷叶病毒的检测和防治提供了有效手段。     

马铃薯卷叶病毒福建分离物的基因克隆与序列分析

依据马铃薯卷叶病毒外壳蛋白基因序列,设计合成了一对特异性引物,采用反转录-聚合酶链式反应扩增得到了PLRV福建分离物外壳蛋白基因,克隆并测定了其核苷酸序列,进行了同源性分析.依据PLRV外壳蛋白氨基酸序列建立了PLRV不同分离物的系统进化树.     

应用 RT-PCR 法快速检测马铃薯卷叶病毒

根据马铃薯卷叶病毒的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物,从感染ＰＬＲＶ的马铃薯病叶组织中提取出病毒的ＲＮＡ,进行ｃＤＮＡ合成及ＰＣＲ扩增,得到一条长度约６２０ｂｐ的特异ＰＣＲ扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致。建立了快速灵敏简便的ＰＬＲＶ检测的新方法,其灵敏度要比ＰＬＲＶ的血清学检测方法高１０＾４倍,在基因水平上为ＰＬＲＶ的检测提供了更新手段,并在农业部植物检疫实验所马铃薯病毒检     

陕北地区马铃薯卷叶病毒的RT-PCR检测与序列分析

以陕北8个县(区)种植2~3代疑似带毒的马铃薯叶片为材料,用Trizol法提取马铃薯叶片总RNA,以已公布的马铃薯卷叶病毒外壳蛋白(CP)基因序列设计特异引物,通过RT-PCR扩增目的DNA片段,对CP基因进行克隆和测序,采用DNAstar软件分析序列的一致性。结果表明,从陕北8个县(区)马铃薯叶片中均扩增到与预期大小一致、长度为336 bp的目的片段,说明马铃薯均感染了卷叶病毒。陕北8个县(区)马铃薯卷叶病毒CP基因之间的序列一致性达99.6%以上,与国内外其他地区10个样品CP基因的序列一致性为96.2%~99.8%,表明马铃薯卷叶病毒的CP基因序列比较保守。     

马铃薯卷叶病毒的RT-PCR快速检测

根据马铃薯卷叶病毒的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物。从感染马铃薯卷叶病毒(PLRV)的马铃薯叶片中提取出病毒RNA,进行cDNA合成并运用RT-PCR技术进行体外扩增,得到一条长度约627bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致,而对照未得到任何产物。从而建立了快速灵敏的PLRV检测方法,为PLRV的防治及检测提供了有效手段。     

马铃薯卷叶病毒CP基因的突变及其原核表达

通过人工合成DNA的方法,对马铃薯卷叶病毒外壳蛋白(CP)基因第52～177核苷酸(126bp)这段序列进行了突变,将其中12个AGA、AGG、CGA等精氨酸稀有密码子变成了原核高效表达的同义密码子CGT与CGC,将另外两个AGA精氨酸密码子变成了错义密码。构建了突变基因的原核表达载体pBAD-LRCP2,Bsp1407Ⅰ与MssⅠ酶切及DNA测序结果表明,基因突变符合要求,表达载体的构建正确。在37℃,大肠杆菌工程株TOP10(pBAD-LRCP2)用0.2%L-阿拉伯糖诱导培养4h,SDS-PAGE显示蛋白图谱上有一条36ku的诱导表达的融合蛋白条带,结果表明突变基因在PBAD启动子驱动下在大肠杆菌中实现了表达。     

应用 I—KI 染色法检测马铃薯卷叶病毒

本文采用 I-KI 染色法检测了马铃著卷叶病毒(PLRV)。通过与酶联免疫吸附试验(ELISA)检测比校表明:马铃薯不同品种或育种材料的初侵染和再侵染植株的顶部叶片和底部叶片对 I-KI 染色的反应不同,无一定的规律性;感病植株的顶部叶片和底部叶片对 I-KI 染色的反应差异较大;I-KI 染色对不同卷叶症状的植株检测效果不同。     

马铃薯抗卷叶病毒基因工程研究现状

综述了马铃薯抗卷叶病毒基因工程的研究进展。在抗马铃薯卷叶病毒基因工程研究中,主要采用RNA干涉、转抗马铃薯卷叶病毒基因、核酶剪切基因组、基因定点突变等方法获得抗马铃薯卷叶病毒植株,已经取得突破性进展。通过对抗病基因工程策略及取得的成效进行概括总结,旨在为抗马铃薯卷叶病毒育种工作提供借鉴。     

陕西马铃薯卷叶病病原的分子生物学鉴定

【目的】对陕西榆林疑似感染马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)的病株毒源进行分子生物学鉴定,为陕西省马铃薯卷叶病的防治提供参考。【方法】根据GenBank数据库已报道的马铃薯卷叶病毒外壳蛋白(Coat protein,CP)基因序列设计了1对引物,利用RT-PCR技术成功扩增了陕西PLRV.CP基因,然后进行克隆、测序,并与GenBank中已报道的27个PLRV分离物的CP基因进行同源性分析。【结果】获得的陕西PLRV.CP基因大小为627 bp,含有1个ORF,编码208个氨基酸的多肽,其与已报道的27个国内外PLRV.CP高度同源。【结论】陕西榆林的疑似病株确定为感染PLRV的马铃薯病株。     

用酶联免疫吸附试验检测马铃薯卷叶病毒

本文介绍用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法快速检测马铃薯叶片及块茎内的马铃薯卷叶病毒(PLRV),检测叶片的最高稀释倍数为1/128,检测块茎的最高稀释倍数为1/64。马铃薯病株的顶部叶片和底部叶片的病毒含量不同,而又没有一定的规律性。马铃薯感染PLRV后可表现为底叶卷叶、部分全株卷叶或顶叶卷叶,有的品种无症;还有一部分植株虽然表现出各种卷叶症状,但并不是由PLRV所致。我院马铃薯育种圃内常用的杂交亲本的带毒率为31.21％;在黑龙江省的几个主栽品种上均可检测到PLRV。     

马铃薯卷叶病毒缺失突变CP基因酿酒酵母表达载体的构建

以重组质粒pBAD-LRCP-126为模板,经PCR扩增获得了PLRV缺失突变CP基因的特异性条带。目的片段与pYES2.1/V5-His/-TOPO的连接产物转化大肠杆菌TOP10F′获得了氨苄青霉素抗性菌落,酶切与DNA测序结果确认了酵母表达载体的正确性,该表达载体命名为pYES-LRCP-126。在30℃,酿酒酵母工程菌株INVSc1(pYES-LRCP-126)经2%半乳糖诱导培养16h,SDS-PAGE显示蛋白图谱上有一条23kDa的诱导表达的蛋白条带,其大小与预期的重组CP大小相符,表明PLRV缺失突变基因在酵母菌中实现了表达。     

马铃薯卷叶病毒分离株外壳蛋白基因和17k蛋白基因的克隆及序列分析

从典型的马铃薯卷叶病毒病株中直接提出植物总RNA，根据PLRV外壳蛋白基因序列，设计合成了一对寡核苷酸引物，经RT－PCR法扩增出全长的cDNA片段，将其克隆到质粒pGEM-3Zf( )上，并进行了序列分析。结果表明，克隆的cDNA片段由627个核苷酸组成，编码208个氨基酸组成的理论分子量为23k的蛋白，与PLRV外壳蛋白的大小一致；此外克隆片段还含有一个不同于外壳蛋白基因的阅读框架，该框架由465个核苷酸组成，编码155个氨基酸组成的理论分子量为17k的蛋白，与PLRV的17k蛋白大小一致，与国外报道的几个株系相比，PLRV分离和的外壳蛋白基因及17k蛋白基因的核苷酸同源率分别高达97.5%-99.7%和96.5%-99.6%，由此推测的氨基酸同源率高达97.6%－99.5%和96.1%-99.4%，说明所克隆的PLRV外壳蛋白基因和17k蛋白基因具有高度的保守性，本研究克隆了PLRV分离物外壳蛋白和17k蛋白基因的序列，为进一步进行抗PLRV基因工程研究奠定基础。     

RNA干涉转基因马铃薯对卷叶病毒抗性的研究

利用大田统计方法,结合分子生物学手段和生物信息学手段对转化的23个转基因马铃薯突变株进行抗病性鉴定,分析转化群体中外源基因的插入信息,并利用双夹心抗体酶联免疫法技术研究受侵染后马铃薯卷叶病毒基因在这些转化体中的表达情况。结果表明,一些株系出现了性状突变,通过分子生物手段检测发现大部分株系都有一定的马铃薯卷叶病毒抗性,但是抗性水平差异很大。试验验证了RNA干涉技术策略的可行性。     

甘薯卷叶病毒江苏分离物基因组全长序列测定及其外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

为了制备甘薯卷叶病毒(SPLCV)的特异性抗体,克隆了甘薯卷叶病毒江苏分离物SPLCV(JS∶XZ∶3-2)的全长基因,并对其基因结构及分子变异情况进行分析,同时对外壳蛋白(CP)基因进行了克隆和表达。利用PCR方法扩增并克隆了SPLCV(JS∶XZ∶3-2)的全基因组,测序分析表明,SPLCV(JS∶XZ∶3-2)基因组全长为2 834bp,含有6个开放阅读框架,与已发表的SPLCV其他分离物相比,全基因组核苷酸序列相似性为82.7%～94.4%。其中,CP基因由765个核苷酸组成,共编码254个氨基酸残基。SPLCV CP基因核苷酸序列与其他分离物的相似性在89.2%～90.6%,其中与SPLCV美国分离物(HQ333135)的相似性最高,为90.6%;与日本分离物(AB433788)的相似性最低,为89.2%;与中国大陆分离物(FJ515896)CP基因的核苷酸序列相似性为90.2%。将SPLCV CP基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-3上,获得重组质粒,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE分析得到了大小约为54.3kD的融合蛋白条带,说明CP基因在大肠杆菌中得到了高效表达。     

马铃薯卷叶病毒衣壳蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

本研究克隆马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)衣壳蛋白(Coat Protein,CP)基因,改造其密码子,使其偏好原核表达,构建pCzn1-PLRV CP重组表达载体,通过大肠杆菌表达纯化,经Western Blot方法鉴定为PLRV CP蛋白,纯化后的蛋白免疫日本大耳兔,成功制备PLRV CP蛋白多克隆抗体,识别重组蛋白效价为128000倍,识别PLRV叶片的效价为32000倍,经Western Blot方法分析,其特异性良好.本研究为PLRV检测方法的建立及脱毒种薯的检测提供了必需的生物材料.     

禽流感病毒基因组及其编码蛋白的结构与功能

禽流感病毒为单股负链RNA,分为8个独立的节段,分别编码聚合酶蛋白(PB1、PB2和PA)、血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M1和M2)和非结构蛋白(NS1和NS2)等10种蛋白质,为了深入认识该病毒,对其基因组及各种编码蛋白的结构和功能进行了综述。     

惠州市冬种马铃薯卷叶病毒病的发生、鉴定及气象影响因子研究

以惠州冬种马铃薯为研究对象,探索不同气象条件对冬种马铃薯卷叶病毒的影响。以田间调查的形式统计了不同时期冬种马铃薯卷叶病毒的发病情况,并对马铃薯卷叶病毒进行分子鉴定,分析了惠州市冬季气温、相对湿度及降水等气象条件对冬种马铃薯卷叶病毒病的影响。结果表明:3次调查马铃薯卷叶病毒病的平均发病率依次为2.48%、12.6%、70.18%,呈上升趋势;分子鉴定结果显示确为马铃薯卷叶病毒的感染;气象条件对冬种马铃薯卷叶病毒的发生有着重要的影响,其中高温、少雨,相对湿度在70%~80%的气象条件易造成马铃薯卷叶病毒病的发生和传播。     

葡萄卷叶伴随病毒Ⅲ基因的克隆及序列分析

根据葡萄卷叶伴随病毒Ⅲ美国分离物的ＧＬＲａＶ－３ＣＰ基因序列,设计并合成了１对该病毒的ＰＣＲ引物,利用ＩＣ－ＲＴ－ＰＣＲ成功地检查到合适大小的ＰＣＲ产物;同时将ＰＣＲ产物克隆到中间载体ＰＧＥＭ－３Ｚｆ,转化大肠杆菌ＤＨ５α菌株,筛选阳性克隆。通过双酶切以及序列分析表明,扩增样品与美国分离物的同源性为９４．１％。     

甘肃葡萄扇叶病毒和卷叶病毒的检测

采用 DAS-ELISA 检测方法对甘肃地区的葡萄主要品种进行扇叶病毒和卷叶病毒的调查和测定。结果表明,这两种病毒病在甘肃地区的主要葡萄产区均有发生。兰州地区和一些老的葡萄产区葡萄带病毒病较严重。通过对比植株下部枝条的幼叶、幼茎、老叶和老茎病原的检测结果,说明植株下部幼嫩组织是卷叶病毒最适的检测部位。     

葡萄卷叶病毒RT-PCR检测技术研究

以葡萄叶片和皮层为材料,对植物总RNA和dsRNA提取方法进行了研究,从中筛选出了提取葡萄总RNA和dsRNA的适合方法。建立了GLRaV RT-PCR的有效体系,在有效体系基础上,通过研究RT-PCR主要成分对RT-PCR的影响,确立了GLRaVRT-PCR的优化体系。