‘岩溪晚芦’椪柑果皮与果肉差减cDNA文库的构建及初步分析

 以‘岩溪晚芦’(Citrus reticulata Blanco)成熟果皮和果肉为材料,采用抑制性差减杂交技术,成功构建了果皮（tester）与果肉（driver）的差减cDNA文库。结果显示：cDNA克隆外源插入片段大小介于100～500 bp之间。成功对411个克隆进行了测序,测序结果经与NCBI基因库中序列进行比较,377个EST 找到了同源序列,它们分属于126个基因,涉及到与色素合成、能量代谢、初级代谢、次生代谢、抗逆防御、蛋白代谢、信号转导、香味形成、果皮软化（衰老）、精油合成、抗氧化代谢等代谢途径和生理生化过程。还有一些基因涉及到三价铁螯合物、反转录转座子gag蛋白、查尔酮合成、硼离子转运、儿茶酚氧位甲基转移酶等功能。功能已知且没有重复的EST共有63个,占总数的49.2%。有5个基因共62个克隆虽在Blast搜索时找到了较高的同源性序列,但功能目前尚未明确,有待进一步深入分析。另有34个基因未搜索到同源序列,可能为新发现的基因。     

紫外线照射对梁平柚果皮基因表达的影响

 采用SSH技术以紫外照射的梁平柚[Citrus grandis（L.）Osbeck]果皮作为实验方（tester）,以未被照射的正常果皮作为驱动方（driver）,构建了一个梁平柚果皮紫外诱导基因的正向差减文库。经菌液PCR检测后随机挑取200个阳性克隆测序,获得168条表达序列标签（ESTs）。比对这168条ESTs,发现有分属于57个基因的114条ESTs与已知基因高度同源,54条ESTs同源性较低或没有同源性。功能分析发现,这些ESTs主要参与抗逆防御、生长发育、细胞凋亡、转录与翻译、细胞分化、信号传导、能量代谢、糖类及氨基酸代谢以及次生代谢等。     

辣椒细胞质雄性不育系和保持系SSH-cDNA文库的构建

以辣椒细胞质雄性不育系A1、A5为驱动方(driver),以其相应的保持系B1、B5为测验方(tester),利用抑制差减杂交技术构建了1个辣椒细胞质雄性不育保持系表达基因的正向差减cDNA文库。从差减文库中筛选到189个阳性单克隆,经高密度点阵膜杂交筛选和测序分析,共获得了42条表达序列标签(ESTs)。BLAST比对分析后,得到了35条有比对结果的序列,其中包括26条已知功能基因序列和9条未知功能基因序列,已知基因功能多与基础物质代谢、胁迫应答、信号转导等方面有关;有7条ESTs没有比对结果,可能代表一些新基因。     

月季响应黑斑病的早期差异表达基因分析

为了获得月季抗黑斑病的相关基因,探究月季抗病分子机制,以月季高抗黑斑病品种‘粉和平’叶片为材料,采用单孢子离体接种法对其接种黑斑病菌,以接种24、48和72 h的cDNA等量混合样为检测子,以相应对照的cDNA混合样为驱动子,构建抑制差减杂交文库。挑选200个阳性克隆进行测序、BLASTx比对分析,获得37条非冗余EST序列,其中32条序列在蛋白数据库中具有同源序列。将获得的EST序列导入相应样本的转录组测序数据库,以其在两个样本中的RPKM比值作为基因相对表达量。结果表明,接种病原菌后,上调表达基因涉及信号识别、离子转运、活性氧清除、光呼吸途径及苯丙烷代谢等方面,其中以活性氧清除、光呼吸途径和苯丙烷代谢途径的基因数最多。这一结果说明月季抗病是通过多基因的协同作用实现的,活性氧清除、光呼吸途径和苯丙烷代谢途径在月季抵抗黑斑病菌过程中发挥重要作用。     

柑橘衰退病晚期抑制差减cDNA文库的构建及初步分析

为了研究柑橘衰退病晚期应答的分子机理,利用经典的抑制差减杂交技术,以感染柑橘衰退病3年后的‘不知火’杂柑实生苗叶片组织的c DNA为测试方,以脱毒的‘不知火’实生苗叶片组织的c DNA为驱动方进行差减杂交,构建了柑橘衰退病诱导的正向抑制差减c DNA文库。随机挑取此文库中210个阳性克隆进行测序,获得了192条有效序列。将这些EST序列聚类拼接后,共获得77条非重复序列。对这些EST进行GO和KEGG分析,发现这些EST的功能主要与胁迫及防御、代谢、转录、转运、蛋白命运等途径相关。用实时定量RT-PCR验证了其中4个基因:几丁质酶基因、茉莉酸响应基因的转录抑制因子1基因(JAZ1)、钙调素结合蛋白基因、咖啡酸—氧甲基转移酶基因,结果表明在衰退病的诱导下,‘不知火’杂柑叶片中这4个基因的表达量均有明显提高,说明这些基因可能参与了‘不知火’杂柑叶片晚期衰退病应答。JAZ1基因的上调表达表明可能宿主衰退病晚期应答过程中的诱导系统抗性受到了抑制。     

草原龙胆盐胁迫差减文库的构建及分析

为了研究草原龙胆抗盐性机理,初步获得其抗盐性相关基因,分别以400 mmol·L-1的NaCl及清水处理的草原龙胆叶片mRNA为tester和driver方,利用抑制差减杂交技术构建了cDNA文库.经过测序和与Gene Ontology数据库序列比对,获得了658条单一序列,其中61条序列分子功能未知,535条序列无同源性,62条序列有显著同源性.此62条序列     

利用抑制差减杂交技术分离茄子单性结实相关ESTs

以茄子（Solanum melongena）单性结实品系D-10和非单性结实品系03-2的子房cDNA分别为试验组（Tester）和驱动组（Driver）,利用抑制差减杂交（SSH）技术构建了正反两个SSH-cDNA文库,分别包含472和124个克隆。通过测序、序列拼接后,共获得384个Unique ESTs。将其与非冗余蛋白数据库进行BLASTx比对,在E值小于等于1e-10条件下,有257个ESTs能找到相匹配的蛋白质,其中121个ESTs与非冗余蛋白质数据库中已知功能的蛋白质具有高度的相似性。功能注释结果表明,具生物过程、分子功能和细胞组分的EST分别为107、102和119条。推测与单性结实相关的EST有5条：2条ESTs属于MADS-box转录因子家族,1条与生长素增长蛋白同源,1条属于P450还原酶系,1条属于MAPKK家族;另外136个ESTs代表了未知功能基因。     

辣椒N 基因介导抗根结线虫作用早期表达基因的抑制性消减杂交SSH分析

 以含N 基因的辣椒(Capsicum annuum L. ) 为试验材料, 接种南方根结线虫(Meloidogyne incognita) 12、24、36 h的根尖材料作为测验方( tester) , 相应的未接种根尖材料作为驱动方( driver) , 构建一个南方根结线虫诱导N 基因表达早期的正向抑制消减杂交cDNA文库, 并结合文库高密度点阵膜杂交差异筛选, 获得了237条表达序列标签( EST) 。在GenBank上进行BLASTn与BLASTx分析, 得到148条功能已知的EST序列, 获得已知的上调抗性相关EST 68个。分离出了具有NBS2LRR结构的抗线虫蛋白和类LRR抗性蛋白的基因, 防御作用相关的类萌芽素(GLP) 、HSR203J 蛋白、蜜腺蛋白、蛇毒素肽等基因,抗性相关的WRKY、ERFBP等转录因子基因, 以及G蛋白、142323蛋白等多种信号蛋白基因。通过GeneOntology分析, N 基因介导的早期表达抗病基因涉及病原物的识别、抗性信号传导、过敏性坏死、系统获得性抗性以及植物细胞保护机制等多个方面, 并有许多功能未知的基因有待于进一步的研究。     

茄子单性结实差异表达序列鉴定及分析

利用实时荧光定量PCR技术,研究茄子单性结实SSH-c DNA文库中的96条EST序列在单性结实自交系和非单性结实自交系果实发育过程中的表达模式。分析表明,在低温条件下,相对表达量有显著差异的EST序列有31条,总体上调表达的EST序列有17条,总体下调表达的EST序列有14条。通过NCBI对EST序列进行Blastx比对,得到与其同源性高的序列信息。其中5条EST与抵御低温相关,6条EST与植物激素代谢相关,多条EST与植物代谢过程中的蛋白质和碳水化合物合成相关,1条EST无比对结果,可能为新基因。差异表达序列可作为研究茄子单性结实和耐低温的候选基因。     

草原龙胆盐胁迫差减文库的构建及分析1

为了研究草原龙胆抗盐性机理,初步获得其抗盐性相关基因,分别以400 mmol·L-1的NaCl及清水处理的草原龙胆叶片mRNA为tester和driver方,利用抑制差减杂交技术构建了cDNA文库。经过测序和与GO数据库序列比对,获得了658条单一序列,其中61条序列分子功能未知,535条序列无同源性,62条序列有显著同源性。此62条序列注释按照功能分为21类。获得了活性氧清除系统基因DHAR、GST、TRX、CAT,转录因子SMT3,调控基因丝氨酸/苏氨酸激酶基因等。结果说明草原龙胆的盐抗性相关基因与数据库中的模式植物基因既有一定的共性,同时绝大部分的序列又无法用已知的基因进行解释。     

抑制性消减杂交分离苹果缺铁诱导的相关基因

以铁高效基因型植物———苹果属小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et J iang) 为材料, 利用抑制性消减杂交( SSH) 方法, 成功构建了小金海棠缺铁条件下的消减cDNA文库。该文库包含1 152个克隆, 通过PCR检测插入片段大小在300～1 000 bp之间。对构建的消减cDNA文库进行差异筛选, 得到差异表达片段( ESTs) 105个。GenBank上BLAST结果如下: 50个ESTs与其它物种同源性较高, 视为已知基因, 并根据其功能分为9个组; 32个ESTs在GenBank中无法查到对应的同源序列, 可能代表了新基因;另外23个是与已知ESTs重复的基因片段。     

霜霉病菌侵染的黄瓜叶片cDNA文库的构建及抗病相关基因筛选

以接种黄瓜霜霉病菌的抗病黄瓜品种‘649’的叶片为材料,使用改良SDS法提取总RNA,构建黄瓜叶片全长cDNA文库,得到的原始文库滴度为5.5 × 106 pfu • mL-1,扩增后的文库滴度达6.5 × 109 pfu • mL-1,重组率约为99%,插入片段在0.5 ~ 2.0 kb之间,大多在1.0 kb左右。随机选取3 360个克隆进行测序,共拼接出2 507个unigenes,其中包括211个重叠群（Contigs）和2 296个单拷贝EST（Singlets）。生物信息学分析显示：这些unigenes中存在427条与植物防御/抗病相关的基因,其中包括两类抗病基因和细胞程序性死亡相关基因,这些基因的发现为下一步研究黄瓜抗病机理,克隆抗霜霉病相关基因提供了重要的参考。     

‘津田’芜菁消减cDNA文库的构建及分析

 以‘津田’芜菁红色块根和白色块根为材料, 利用SSH技术成功构建了消减cDNA文库并富集相关基因片段。从消减文库中筛选到960个阳性克隆, PCR鉴定插入片段长度主要分布于300～800 bp之间。克隆测序后与GenBank中的同源序列进行比较, 特异基因片段为302个, 其中99个与数据库中的序列具有相似区域且功能已知, 与数据库中序列没有显著同源性及功能未知的序列为203条。