2种猪源链球菌对猪、兔的致病性试验

检测了4株猪链球菌2型(Streptococcus suistype 2,SS2)和2株马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equisubsp.zooepidem icus,SEZ)对猪、兔的致病性。SS2-1、SS2-H及SS2-006444株均分离自发病猪内脏,前2株毒力因子表现型为MRP+EF+SLY+,后者为MRP-EF-SLY-;SS2-D株为国外引进的SS2人源株,作为对照,其毒力因子的表现型为MRP+EF*SLY+;SEZ-CY和SEZ-CN株均分离自发病猪并经鉴定。SS2-1、SS2-H、SEZ-CY和SEZ-CN株对猪(2~3头/组)的最小致死量分别为106、107、104和108cfu;对兔(2~3只/组)的最小致死量分别为100~1 000、1 000、100和105cfu;SS2-D株108cfu对猪不致死,对兔的最小致死量为108cfu,而SS2-006444对猪、兔无致病性。显示SS2毒力因子与其对猪、兔的致病性有关;SS2与SEZ菌株对兔或猪的致病性一致,可用兔取代猪做试验;SS2和SEZ菌株通过腹腔、皮下、肌肉或静脉注射均可感染兔(2~4只/组),并致死,SEZ还可经口、鼻感染;SEZ与SS2静脉感染猪后10 m in即可检出细菌,此后2~4 h为无菌血症阶段,之后重新出现。     

猪链球菌2型人源分离株EF单克隆抗体的制备与鉴定

为了解猪链球菌2型（SS2）菌株毒力相关因子的致病机理,建立高效的免疫学检测方法,将SS2胞外因子（EF）抗原性强的区域通过基因克隆、原核表达,经亲和层析纯化的EF蛋白免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术将免疫细鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,建立了4株分泌抗EF蛋白单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞系2G1、5H7、3H4和1F2。间接ELISA测定杂交瘤细胞培养上清的效价为1∶128～1∶512,诱生腹水的抗体效价为1∶104～1∶105。4株McAb腹水的Western blot鉴定表明McAb能特异性的识别EF。以2G1单抗腹水与和EF多克隆抗血清建立的夹心ELISA可特异地检测EF。     

H9N2亚型禽流感病毒传播途径特性的比较及其表面基因序列分析

选择中国大陆最早分离的H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)A/Chicken/Guangdong/SS/94(H9N2)(缩写为SS株)和1998年大流行时期分离的H9N2亚型AIVA/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)(缩写为F株)为研究对象,对其在SPF鸡体内的复制能力和传播途径特性比较后发现,F株在4周龄SPF鸡气管中的复制能力高于SS株,F株可以经气溶胶传播途径传播,SS株不能经气溶胶传播途径传播;利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法获取F株和SS株的HA和NA基因的cDNA,序列分析得知,F株和SS株的HA和NA基因的同源性分别是96.6%和98.1%;HA基因的裂解位点氨基酸序列都是PARSSR↓GL,但有5个氨基酸的差异,即166位N(F)→D(SS)、198位A(F)→V(SS)、217位V(F)→I(SS)、335位G(F)→R(SS)、504位L(F)→S(SS);2株病毒的NA基因在63~65位都存在氨基酸缺失,但在NA基因红细胞吸附位点的氨基酸序列不同,分别是IKKDSRSG(F)和IKEDLRSG(SS)。F株和SS株的传播特性差异是否与其表面基因序列有关,有待进一步研究。     

生长抑素(SS)与硫氧还原蛋白(Thioredoxin)相融合生成的2种基因工程化融合蛋白SS-N/X和SS-N/S的表达特性

对基因工程化生长抑素（somatostatin,SS)-硫氧还原蛋白（Thioredoxin)融合蛋白SS－N／X和SS－N／S的表达产量、水溶性、Triton X-100对SS融合蛋白水溶性的影响、包涵体的溶解和复性特点以及SS的抗原性与免疫原性等特性进行了研究。结果显示，在30℃的低温下用IPTG诱导表达，SS－N／X融合蛋白主要以可溶性形式存在，占75．8％，色涵体仅占24．2％；而SS－N／S融合蛋白则主要以包涵体的形式存在，占81．1％，可溶性蛋白仅占18．9％；32C载体（pEG-32C)蛋白则居二者之间，可溶性蛋白与包涵体大约等比例出现。SS－N／S在低温下诱导可超量表达SS融合蛋白，其表达量约占菌体总蛋白的40．94％。0．5％ Triton X-100对融合蛋白的不溶性有非常显著的影响，几乎可使所有的SS－N／X融合蛋白和大部分SS－N／S融合蛋白及32C硫氧还原蛋白变成水溶性的。32C硫氧还原蛋白包涵体在尿素中的溶解度明显高于SS－N／S包涵体，2mol/L尿素可使近一半的32C硫氧还原蛋白包涵体溶解，而SS－N／S包涵体只有27．5％溶解；但在5mol/L尿素时，两者均可基本全部变为可溶性的。在SS融合蛋白包涵体溶解时加入还原剂二硫苏糖醇，可明显降低SS的抗原性。SS融合蛋白（水溶性融合蛋白和复性后的包涵体）具有良好的SS抗原性和免疫原性。由SS融合蛋白与弗氏不完全佐剂制成试验用疫苗，免疫BALB／c小鼠、仔猪和羔羊等动物，可显著提高免疫动物的增重。     

一株抑菌芽胞杆菌的分离鉴定及产细菌素性能检测

采用常规微生物学方法从新鲜鸡粪中分离得到1株抑菌效果较好的菌株BX-6。结合菌落形态特征、生理生化特性及菌株特异性序列分析等手段,确定其分类归属,并采用管碟法对所产细菌素的抑菌特性进行了检测。结果表明,菌株BX-6为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）。菌株在发酵过程中产生一定量的H2O2类抑菌物质,其所产细菌素具有较好的热稳定性、pH值耐受性,对大部分蛋白酶敏感,对鸡白痢沙门氏菌C79—13、鸡大肠杆菌01和金黄色葡萄球菌C56011有较好的抑菌效果,具有作为畜禽饲料添加剂的潜力。     

河南省安阳市猪链球菌2型分布及其药物敏感性

为了解河南省安阳市猪链球菌2型（SS2）的分布范围、生化特性及其药物敏感性,收集了来自该地区9个县（市、区）的56份疑似感染病料,分离后用PCR鉴定出38株猪链球菌菌株,其中21株（55.3%）为SS2,分离自安阳县、汤阴县、滑县、文峰区、北关区、殷都区、龙安区7个县区采集的病料样品。生化试验发现,分离菌株与SS2菌株的生化特点相符合;药物敏感性分析发现,全部SS2菌株对氨苄西林和头孢曲松敏感,20株对头孢呋辛敏感,19株对阿莫西林和头孢噻肟敏感;全部SS2菌株对卡那霉素、阿米卡星和磺胺异恶唑耐药,20株对庆大霉素和四环素耐药,19株对阿米卡星耐药。结果表明,SS2在河南省安阳市分布范围较广,是该地区猪链球菌的优势流行亚型,且流行菌株存在多重耐药性。本研究为有效防控该地区猪链球菌病提供了参考。     

鸡霍乱口服弱毒菌株的选育及其性能的研究：I R1—23菌株的筛选

试验以本所历年来分离、收集、保存的多株禽源多杀性巴氏杆菌菌种为选种素材，以各菌株的培养特性、菌落形态、菌落虹彩、生化反应及其在历次传代过程中的稳定性为选种依据，初步筛选出四个菌株，代号为：Ｒ１－２３、Ｒ１－２４、４１－３９和Ｒ１－６５。经过皮下注射安全量、口服耐受量、近期免疫效和毒力稳定性比较测试后，筛选出一株既适应鸡口服免疫又具有良好免疫原性的自然弱毒菌株－Ｒ１－２３菌株（５：Ａ）。该菌株的皮下     

减蛋综合征病毒AA-2株适应体外培养的研究

在分离并系统鉴定了减蛋综合症病毒AA-2株的基础上，进行了该毒株的体外培养试验，以寻求适应于细胞培养物中继代的细胞适应毒。结果表明，AA-2毒株可在鸭胚成纤维细胞（DEF）、鸭胚肾细胞（DEK）、鸭胚肝细胞（DEL）、鸡胚成纤维细胞（CEF）、鸡胚肾细胞（CEK）和鸡胚肝细胞（CEL）上增殖和继代，并随着继代次数的增加，CPE潜伏期缩短，持续期延长，半数细胞感染量（TCID50）呈逐代增加趋势，血凝效价（HA）逐代稳步增强，至第15代之后，之些变化趋于稳定。证明用鸭胚细胞培养的AA-2株病毒在PK-15，BHK-21，SP2/0等细胞中增殖的迹象。还较为系统的测定了第19代DEF毒的其它特性。发现在接毒后120小时，HA及TCID50值最高，细胞适应毒对鸭胚致死率为10%，比原毒降低23%，理化特性与原毒一致，且仍保持原毒的抗原性。     

仔猪腹泻大肠杆菌菌种保存的研究

本文研究了4株仔猪腹泻大肠杆菌菌株不同代次培养的菌液,制成甘油菌后,保存在-20℃6个月,分析细菌的菌落形态、菌落特征、生化特性、血清血特性、毒力、免疫原性均符合《中华人民共和国兽药典》规定标准;4批冻干保存的菌种,经过36个月的保存后,分析细菌的菌落形态、菌落特征、生化特性、血清血特性、毒力、免疫原性均符合《中华人民共和国兽药典》规定标准。本文为大肠杆菌病的致病机理及疾病的潜伏期提供了理论依据。     

猪链球菌2型JX分离株的生物学特性

从临床表现为脑膜炎、关节炎及败血症的发病猪分离到2株细菌，分别命名为JX02和JX03，经鉴定其形态、染色及培养特性均符合链球菌的特点，具α或β溶血，生化试验结果不稳定。用猪链球菌2型、1型和9型抗血清进行凝集试验，结果2株菌均能与猪链球2型抗血清凝集，其中1株菌对小鼠和家兔均有致病性，另1株菌只能致死家兔。PCR均能扩增2株菌的主要毒力因子基因。表明发病猪的病原不同于以往的C群链球菌，不是马链球菌兽疫亚种，而是属于R群的猪链球菌。     

猪链球菌2型感染昆明小鼠模型的建立及评价

为建立稳定的猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)人工发病模型,本试验以天津某发病猪场分离的SS2 Y15293株为研究对象,经腹腔注射感染昆明小鼠,测定其LD₅₀,确定造模感染剂量,通过观察感染后小鼠的临床症状和病理变化,测定试验期间各组小鼠体重和采食量的变化及细菌回归等试验对模型进行评估。结果显示,SS2 Y15293株致昆明小鼠的LD₅₀为6.7×10~7 CFU/mL。以1个LD₅₀的剂量攻毒,与对照组相比,试验小鼠主要发病表现为攻菌后24 h出现精神沉郁、被毛逆立、眼睛有分泌物,72～96 h出现头颈歪斜、翻滚、震颤等神经症状,死亡高峰在48～72 h。3次重复试验中,试验组小鼠的发病率均为100%,死亡率为50%～70%,神经症状小鼠出现比率20%～30%。与对照组相比,试验组小鼠采食量和体重显著下降(P<0.05),临床症状分值显著升高(P<0.05)。组织病理检查发现,试验组小鼠心脏、肺脏组织均有不同程度出血、炎性细胞浸润;脑膜炎,脑室出血,充满炎性细胞。细菌回归试验结果表明,试验组死亡小鼠脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏均有细菌定植,且形态、染色和分子生物学特性与攻毒菌一致。以上结果证实,SS2 Y15293株能感染昆明小鼠并致其发病,感染动物发病规律性强,重复性好,临床症状典型,说明SS2 Y15293株感染昆明小鼠可作为SS2的候选人工感染模型。     

猪链球菌2型HA0609的分离及致病性研究

从江苏省某屠宰场猪的扁桃体中分离到1株细菌,通过培养特性、菌体形态、菌落形态、染色特性、生化试验以及荚膜多糖(cps)基因的PCR检测,确定为猪链球菌2型,命名为HA0609。本试验针对猪链球菌7种主要毒力因子——谷氨酸脱氢酶(gdh)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因子(epf)、溶血素(sly)、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白(fpbs)、次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(impdh)及毒力相关序列orf2,进行PCR检测。与已知强毒株比较,该菌株2种主要毒力因子sly和epf均为阴性。动物试验显示HA0609对猪、兔和Balb/c鼠均无致病性。     

某奶牛场临床型乳房炎的病原分离及鉴定

从某奶牛场患乳房炎的奶牛乳汁中共分离到 13株细菌 ,经培养特性、菌落形态和生化特性等鉴定表明 ,13个分离菌株中 ,无乳链球菌最为多见 ,占 10株 ;金黄色葡萄球菌 2株及大肠杆菌 1株。将 3种细菌经人工感染小白鼠 ,都具有一定的致病力。药敏试验结果表明 ,氨苄青霉素及丁胺卡那对上述细菌具有较好的抑制作用     

猪链球菌2型的分离鉴定及免疫预防

从某猪场分离到一株细菌，通过培养特性、菌体形态、菌落形态、染色特性、生化试验及血清学试验等一系列的系统鉴定，确定为猪链球菌2型。动物致病性试验表明该菌对小白鼠和仔猪有较强的致病性，引起其死亡。药敏试验证明该菌对青霉素、氯霉素等高度敏感，对头抱拉定、卡那霉素等中度敏感，对痢特灵、氟派酸等不敏感。分离菌制成油佐剂灭活苗能有效的预防该猪场猪群的发病。     

猪源多杀性巴氏杆菌C44—48（A型）的鉴定

对猪巴氏杆菌二价灭活疫苗生产菌株之一的Ｃ４４－４８菌株进行了鉴定，结果菌体形态，生化特性，菌落特征，血清学特性均符合多杀性巴氏杆菌的特性。菌种毒力为皮下３ＣＦＵ活菌可致死家兔，皮下３３０ＣＦＵ可致死仔猪。以５批Ｃ４４－４８疫苗用家兔和仔猪效检，结果均合格，表明免疫原性良好。保存期试验结果表明浆干菌种在０－８℃保存至少可达６年。用家兔进行交互免疫试验，结果表明，相同血清群菌株保护７５－１００％；不同     

鼠伤寒沙门菌T3SS相关基因缺失株的生物学特性分析

为探究沙门菌Ⅲ型分泌系统(STM T3SS)相关基因缺失株的部分生物学特性及致病力，本试验利用λ-Red同源重组技术构建T3SS相关基因缺失株LT2 ΔprgI::scar、LT2 ΔprgJ::scar、LT2 ΔprgH::scar、LT2 ΔprgK::scar、LT2 ΔinvG::scar、LT2 ΔinvC::scar和LT2 ΔspaP::scar,以鼠伤寒沙门菌野生型(STM LT2)作为对照，通过生长曲线测定、遗传稳定性试验、生物被膜形成能力检测、细菌定植试验、细菌泳动性测定和动物致病性试验分析两者间的区别，结果显示：T3SS相关基因缺失株生长性变化不大，能够稳定遗传，但其定植能力、运动能力有不同程度的减弱；对于缺失株LT2 ΔinvC::scar、LT2 ΔprgH::scar、LT2 ΔprgJ::scar和LT2 ΔprgK::scar的成膜能力虽有小幅降低，但仍有较强的成膜能力，其余菌株在缺失后，成膜能力显著降低；LD50测定结果显示，相对于STM LT2,缺失株半数致死量LD₅₀数值均出现上升趋势，分别上升了2.57、4.07、406....     

菌落突变株与细菌适应性生存关系研究进展

小菌落突变株（small colony variants,SCVs）是细菌正常生长周期中的一种细菌亚群,它在各种不利条件下可被选择出现。其生化特征表现为生长缓慢、菌落形态不规则、生化特性异常,这使得SCVs的分离鉴定较困难。临床上,SCVs可引起慢性持续性感染,而不引起宿主强烈的免疫反应,且对抗菌药物产生严重的耐药性。文章对SCVs在临床上的表型分类、与宿主免疫反应的关系及抗菌药物对其影响进行综述,以期为SCVs的深入研究提供理论支持。     

一株藏猪源奇异变形杆菌的分离鉴定及药敏试验

本研究从某藏猪场发病仔猪病料中分离细菌，对分离菌进行形态学、染色特性、生化特性鉴定，并分析16S rDNA基因同源性，同时进行了药敏试验。分离鉴定结果得出：分离菌呈多形性，多为革兰氏阴性短杆菌，少数为长杆状，在SS培养基上形成中心黑色、边缘白色的单菌落；生化反应对鸟氨酸脱羧酶、尿素酶、葡萄糖、柠檬酸盐、山梨醇、硫化氢等呈阳性反应；分离株16S rDNA基因的PCR扩增目的条带约为1 410 bp，在GenBank上进行同源性比对，与奇异变形杆菌的相似度为99%。从形态学、生化特性和16S rDNA序列分析结果鉴定出所分离的菌株为奇异变形杆菌。药敏试验结果显示：菌株的耐药性很强，只对头孢他啶、氧氟沙星、庆大霉素、阿米卡星、氟苯尼考、左氧氟沙星、麦迪霉素等敏感。     

猪链球菌2型人源株MRP的表达及其单克隆抗体的制备与应用

将猪链球菌2型(SS2)人源株Habb mrp基因进行截短修饰后,克隆于pGEX4T-2载体中,转化大肠杆菌诱导表达约61 000的融合蛋白MRP-GST,该蛋白经凝血酶作用去除重组蛋白中的GST标签,得到约35 000纯化的MRP.Western blotting证实MRP可被SS2阳性血清特异性识别.以纯化的MRP抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,间接ELISA进行筛选获得了6株能稳定分泌抗MRP特异性单抗的细胞株.特异性试验表明该6株单抗与SS2的另外2种蛋白、大肠杆菌均不发生交叉反应.以2138单抗腹水和SS2多克隆抗血清建立夹心ELISA对71株标准菌株和122株猪链球菌野毒株进行MRP的表征鉴定,标准株检测结果与背景符合率为为97.2%(69/71),其中34株标准血清型菌株检测的符合率为100%.表明该方法可用于猪链球菌的快速诊断和流行病学调查.     

猪腹泻病料进行病原微生物的分离培养

对广东某一家猪场采集的病料进行病原微生物的分离培养,获得4株菌株。通过菌落和细菌形态学观察、生化试验进行细菌的分离鉴定。根据细菌的形态特征及生长特性,同时应用肠杆菌科GYZ-15e编码鉴定管和葡萄球菌属细菌生化编码鉴定管TH-16S对所分离的细菌进行分类鉴定,以鉴定其属和种。试验结果确定4株菌种中有大肠埃希氏菌3株,葡萄球菌1株。