表达鸡Ⅱ型干扰素基因的重组鸡痘病毒的构建

以插入鸡Ⅱ型干扰素（IFN－Ⅱ）cDNA序列的重组质粒AIFN为模板，根据鸡痘病毒早晚期启动子PE／L的序列设计上上游引物，鸡IFN－Ⅱ基因的cDNA3'端序列设计了下游引物，采用PCR法扩增包括启动子PE／L和鸡IFN－Ⅱ全长cDNA序列的基因片段。将该扩增片段定向插入鸡痘病毒转移载体1175中，获重组转移载体1175IFN，用以转染已感染鸡痘病毒282E4疫菌株（wt-FPV)的鸡（Gallus gallus)胚成纤维细胞（CEF）。1175IFN与wt-FPV基因组DNA之间的同源重组产生了表达IFN－Ⅱ的重组鸡痘病毒rFPV-IFN-Ⅱ。通过在含X－gal的营养琼脂上连续挑选篮色病毒斑获得并纯化rFPV-IFN-Ⅱ。以细胞病变抑制实验证实，rFPV-IFN-Ⅱ感染的CEF表达了具有抗水泡性口炎病毒（VSV）活性的鸡IFN－Ⅱ。rFPV-IFN-Ⅱ(M.O.I=0.01)感染CEF72h后，培养上清中IFN－Ⅱ的表达量为1280U／mL。动物实验表明，rFPV-IFN-Ⅱ接种雏鸡7d或14d后，其在体内表达的IFN－Ⅱ可显著减轻载体鸡痘病毒对1日龄SPF雏鸡体重增长的抑制作用。     

表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2重组鸡痘病毒的构建

含ＩＢＤＶ保护性抗原ＶＰ２的质粒,以ＳｐｈＩ消化,然后用Ｔ４噬菌体ＤＮＡ聚合酶将末端补平,产物纯化后再以ＳａｌＩ消化一次,经再次纯化后与ＳｍａＩ和ＳａｌＩ分步酶切的鸡痘病毒插入载体ｐＦＧ１１７５－１相连,使唤基因顺向插入到载体Ｐ７５启动子下游,得到含ＩＢＤ ＶＰ２基因的重组插入载体ｐＦＧ ＶＰ２。     

表达鸡Ⅱ型干扰素重组鸡痘病毒的构建及其特性分析

将鸡Ⅱ型干扰素(ChIFNγ)基因插入到鸡痘病毒转移载体pSY681中，获得重组转移载体pSY681-ChIFNγ。将pSY681-ChIFNγ转染已感染亲本鸡痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞，使其在鸡胚成纤维细胞内与鸡痘病毒基因组发生同源重组，产生表达ChIFNγ的重组鸡痘病毒rFPV-ChIFNγ。在含有X-ga1的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选，通过PCR和间接免疫荧光等实验证实获得纯化的、表达ChIFNγ的重组鸡痘病毒。将在鸡胚成纤维细胞中培养72h的rFPV-ChIFNγ上清接种小鼠成纤维细胞(L929)，通过细胞病变抑制实验证明重组ChIFNγ具有抑制水疱性口炎病毒复制的活性，培养上清的抗病毒效价为2048U／mL。     

麻鸭IL-18成熟蛋白基因的克隆、表达及其表达产物的生物学活性检测

应用RT-PCR技术,直接从麻鸭(Tadorna ferruginea)脾淋巴细胞总RNA中扩增出麻鸭IL-18成熟蛋白(mDuIL-18)基因,克隆到pGEM-T Easy载体。测序结果表明获得了mDuIL-18基因,其大小为513bp,并将该基因亚克隆到原核表达载体pQE30。SDS-PAGE可检测到分子质量为19.76kD的重组蛋白,Western blot证实该重组蛋白可与兔抗鸡IL-18血清发生特异性反应。表达产物以包涵体形式存在,经变性和复性处理后明显促进鸭T细胞转化。用mDuIL-18(150或200ng/鸭)和禽流感病毒(AIV)疫苗免疫鸭2周后,血凝抑制(HI)抗体平均滴度达到7.5～7.7log2,而只用AIV疫苗免疫和用mDuIL-18(100ng/鸭)和AIV疫苗免疫的HI抗体平均滴度仅达到6.3～6.6log2,表明mDuIL-18提高AIV灭活油乳苗诱导的免疫应答。     

鸡胚致死孤儿病毒Ⅲa蛋白基因的克隆、表达及其抗原性鉴定

通过随机引物PCR鉴定了鸡(Gallus domesticus)胚孤儿致死病毒(CELOV)污染鸭肝炎病毒鸡胚尿囊液种毒。根据GenBank上已公布的核苷酸序列，自行设计一对引物。PCR扩增到1728bp的特异性条带，将其在大肠杆菌(Escherichia coli)中高效表达，产物蛋白经Western blot鉴定为阳性后，又长程免疫小白鼠获得抗Ⅲa蛋白的抗血清。间接免疫荧光实验(ⅢA)鉴定蛋白产物具有抗原性。     

一种新的精子膜蛋白sp18基因的克隆及其在E.coli 中的表达

摘要：利用sp18 mAb筛选小鼠睾丸λgt11-cDNA表达文库,命名为sp18（GenBank登录号：AF129872）的阳性克隆由 1 468 bp组成,开放阅读框（open reading frame, ORF）长约429 bp,编码142个氨基酸。起始密码ATG位于第694 bp,终止密码位于第1 122 bp,polyA位于1 245~1 250 bp。核苷酸同源性分析表明,sp18 cDNA的10~651 bp与人视神经Hr44的532~ 1 173 bp、sp18 cDNA的10~816 bp、864~1 444 bp与牛视神经Hr44的1 408~2 208 bp、2 250~2 309 bp的cDNA序列有很高的同源性, 高达98%。推测sp18基因可能是生殖系统存在的一种新基因。sp18编码蛋白的理论分子量约为15.7 kD,有8个N-糖基化位点和12个O-糖基化位点,亲水性分析表明sp18多肽是一种精子跨膜蛋白,跨膜区位于第17~33氨基酸处。将sp18 cDNA亚克隆到原核表达载体pET-30a(+),在E. coli BL21（DE3）中得到诱导表达,其表观分子量约为16.5 kD,表达量约占菌体总蛋白的32%。Western blot分析表明sp18 mAb能识别重组的sp18膜蛋白,表明重组蛋白具有免疫原性,为进一步研究sp18基因的功能打下了基础。     

乳腺高效表达拟蛛丝蛋白基因载体的构建及其克隆策略

6条长约80bp的寡聚核苷酸链，通过其互补末端延伸补平成3条双链DNA；3条双链DNA按3：1：3混合，PCR扩增得到大量拟蛛丝蛋白基因单体；将单体多聚化，加上设计好的信号肽和终止密码子，再将多聚体基因构建到乳腺高效表达载体pBC1上，使之成为乳腺高效表达的拟蛛丝蛋白基因载体。着重讨论了基因构建过程中DNA克隆技巧和策略。     

BmNPV几丁质酶基因的表达及其产物对Bt杀虫剂的增效作用

用PCR方法分别扩增出BmNPV几丁质酶基因编码区全片段和去信号肽片段。将全片段克隆入原核表达载体pET28a，在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)进行融合表达。将去信号肽片段克隆入pFastBacb转移载体，重组到杆状病毒Bac-to-Bac表达系统，在粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞系(Tn-5B1-4)中进行融合表达。SDS-PAGE分析和薄层扫描显示，2片段均得到高效表达，表达产物分别占细胞总蛋白的22％和12％。将以上2种表达产物加入Bt菌液中喂食2龄家蚕(Bombyx mori)，观察并记录不同处理下家蚕的死亡时间及体重。结果表明，2种表达产物对Bt杀虫剂均有明显的增效作用。取食添加以上2种表达产物的家蚕与对照处理相比，LT50分别提前24．5和24．6h，体重增量约是对照组的1／4。     

猪链球菌2型纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白 全基因的克隆及融合表达

采用发表的引物对,以猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2）江苏分离株HA9801的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白基因fbps（GenBank登录号为AY565303）克隆于pMD-T18载体构建成载体pMD-T-fbps.经内切酶酶切和测序鉴定后,将由pMD-T-fbps内切酶切下的片段定向克隆于表达载体pET-32a（＋）,得到重组质粒pfbps.将重组质粒pfbps转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21株,经IPTG诱导,可高水平地表达相对分子量为83 kD的融合蛋白.配体印迹结合试验表明,表达的融合蛋白可与人纤连蛋白结合.     

木质素合成关键酶基因CCR的克隆及其反义表达载体的构建

木质素是植物体中总量仅次于纤维素的第二大有机物质，占次生物质总量的95％以上，在植物体具有一定的生理功能。但由于木质素含量过高使造纸工业中污染增加、饲草消化吸收率降低，因此木质素含量基因调控已成为植物基因工程研究的一个重要方向。羟基肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-CoAreductase，CCR)可还原3种羟基肉桂酸的     

粉纹夜蛾颗粒体病毒重组增效蛋白的生物学特性

在大肠杆菌(Escherichiacoli)中表达的粉纹夜蛾颗粒体病毒(Trichoplusianigranulovirus)重组增效蛋白P96能显著提高多种微生物杀虫剂对多种害虫的毒力,具广谱增效活性。基于SDS-PAGE和一系列生物测定进一步研究P96的生物学特性,结果表明:P96在大肠杆菌中表达时形成包涵体较为稳定,但4!存放3个月后有部分解离;P96包涵体可由Na2CO3打开或由棉铃虫(Helicoverpaarmigera)5龄幼虫离体中肠液有效溶解;取食1.9×105￣1.9×106OBs(occlusion-bodies)/mLP96后,棉铃虫幼虫围食膜上的肠粘蛋白基本降解完全;随P96浓度增加,其增效活性愈强,至6.76×105OBs/mL时趋于饱和;金属螯合剂乙二胺四乙酸对P96的增效活性有强烈抑制作用。对P96上述生物学特性的了解,为P96具生物活性提供了生物测定之外的证据支持,并为其合理生产应用提供了依据。     

人肥胖基因在大肠杆菌中的表达及生物学活性检测

肥胖基因(ob)编码的瘦蛋白可以反映机体脂肪含量信息,在发育、繁殖、造血及体重调节等方面具有重要功能。利用PCR方法扩增去除信号肽的人肥胖基因cDNA序列,并将位于基因5!端的CCC转变为大肠杆菌(Escherichiacoli)常用密码子CCG,扩增片段经测序证实后,克隆到原核表达载体pET5a,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.1mmol/LIPTG诱导,获得分子量约为16kD的特异蛋白表达带,表达量最高占菌体蛋白总含量的55%。重组蛋白纯化后,注射昆明白小白鼠,小白鼠体重明显下降,说明纯化的重组蛋白具有生物学活性。     

烟夜蛾泛素延伸蛋白基因的克隆与表达

应用RT-PCR技术，从烟夜蛾(Helicoverpa assulta)幼虫脂肪体组织总RNA中反转录扩增泛素延伸蛋白基因的cDNA片段，扩增得到的片段全长390bp，编码一个长为129个氨基酸残基的蛋白质，预测分子量14.8kDa。同源性分析表明，此cDNA序列为ubiquitin-53aa extension protein(ubi-53，UBE)基因，在泛素蛋白后融合了一个核糖体L40蛋白(ribosomal L40 protein)。使用Clustal W软件，对cDNA编码的氨基酸序列进行了同源性分析，分析表明：烟夜蛾的泛素延伸蛋白氨基酸序列与其他真核生物泛素延伸蛋白氨基酸序列高度同源（90%－98%），与棉铃虫核多角体病毒(HaSNPV)泛素的同源性为69%。将烟夜蛾的UBE基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG进行诱导表达，电泳检测到一条约40kDa大小的外源蛋白，用鼠抗GST抗体进行Western blot检测表明原核表达蛋白是目的蛋白。     

猫白介素-18基因的克隆、序列分析及其表达

用猫白介素18(interleukin,IL-18)基因特异性引物对刀豆蛋白(ConA)刺激后猫外周血单核细胞(PBMCf)总RNA进行了RT-PCR扩增,并将扩增产物纯化后克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定。结果该基因全长579bp,编码192个氨基酸(GenBank登录号:DQ100372)。在推导的猫IL-18氨基酸序列中,无信号肽序列和潜在的N-联糖基化位点,但存在4个Cys残基。与不同物种IL-18相比,猫IL-18与犬、羊、牛和猪IL-18核苷酸序列有较高的同源性,分别为89.8%、88.6%、88.4%和88.1%,但与小鼠和鸡IL-18有明显的种属差异。将目的基因片段进一步亚克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-18,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG诱导。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到分子量为27.5kD的重组目的蛋白。经凝胶薄层扫描,目的蛋白表达量可占菌体蛋白的13.6%。     

黑曲霉木聚糖酶基因xynB在大肠杆菌中的表达及重组木聚糖酶的特性

从黑曲霉(Aspergillus niger) mafic-005中克隆得到木聚糖酶基因xynB。序列分析表明，该基因全长745 bp，含有一个67 bp内含子，编码225个氨基酸，理论分子量为24 kD(GenBank登录号:DQ174549)，与已知黑曲霉xynB基因的同源性均较高。将该基因定向插入大肠杆菌(Escherichia coli )表达载体pET-28a (+)上，并转化E. coli BL21 获得重组菌株。经过IPTG诱导，xynB基因获得特异性表达。经SDS-PAGE分析，重组蛋白分子量约为30 kD。该重组蛋白经镍NTA琼脂糖凝胶FF纯化后达到电泳纯。酶学性质分析表明，重组木聚糖酶最适温度为40 ℃，最适pH值为5.0，在酸性和常温条件下具有良好的稳定性。     

热纤梭菌内切β-1，4-葡聚糖酶基因celD在大肠杆菌中的表达及酶学特性分析

热纤梭菌是一种嗜热的厌氧细菌,能产生一种叫纤维素小体的多酶复合物(Bhat et al.,1997),是实现纤维素工业转化的一个较有希望的菌种(于洪日等,1989)。同时热纤梭菌能够产生耐热的纤维素酶,通常在酸性和碱性的pH以及90℃以上的高温下仍能稳定存在,并且可以在广泛的底物上发酵而     

犬白细胞介素2在毕赤酵母中的诱导表达及生物活性的测定

以ConA刺激的犬外周血淋巴细胞总RNA为模板，通过RT-PCR方法扩增出犬IL-2成熟蛋白基因，将目的片段连接到pMD18-T载体，测序结果显示，扩增片段与GenBank上发表的序列一致。然后将目的片段连接到酵母表达载体pPICZa-A上，得到重组酵母犬IL-2表达载体pPICZaA-CaIL-2，经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。PCR方法筛选重组酵母菌，甲醇诱导表达，SDS-PAGE结果显示表达上清中有大小约20kDa的目的条带，比实际分子量略大，推测蛋白可能发生糖基化。MTT法测定生物学活性结果表明，重组犬IL-2能够极显著促进犬外周血淋巴细胞增殖。证明酵母表达的犬重组IL-2具有良好的生物学活性。     

玫瑰黄链霉菌几丁质酶基因的克隆及拼接表达

应用PCR扩增克隆到玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)的几丁质酶基因chiC的整个催化域部分,将其与包含信号肽区、纤维素结合区、几丁质结合区三个结构功能域的链霉菌(S.lividans)chiC基因片段相连接,插入pET23b( )质粒上,构建表达载体pLCH,用来转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109(DE3),转化子进行破壁之后在胶体几丁质酶培养基上表现活性。     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因的克隆与表达

蜘蛛丝具有极高的强度和韧度,工业和医学应用价值很高,但由于蜘蛛的不可驯养性使其应用受到限制。因此,本文尝试利用基因工程的方法获得蛛丝蛋白的表达。我们利用巢式PCR技术从大腹圆蛛Araneus ventricosus基因组中克隆了长度为837bp的拖牵丝蛋白基因（ASP）,并分别将其构建至原核表达载体pGEX-6p-1和真核表达载体pGFP-N2上,分别命名为pASG和pASN。pASG在大肠杆菌中16℃下24h诱导表达后,经蛋白质印迹证明成功地表达了GST-ASP融合蛋白;pASN转染昆虫sf9细胞48h后观察到了绿色荧光蛋白GFP的表达,表明ASP基因在大肠杆菌和真核细胞中分别得到了正确表达。本研究为利用基因工程的方法开发蛛丝蛋白的生产途径提供了有益的尝试。     

胸腺素家族多肽在大肠杆菌中的表达

为提高胸腺素(又名胸腺肽,thymosin)的体外表达效率,本研究采用设计融合标签的方法对胸腺素α1和β4(Tα1,Tβ4)进行体外重组表达,通过超高效液相色谱-飞行时间质谱联用(LC/MS)法,对融合蛋白的完整分子量进行验证,利用反相超高效液相色谱法对不同表达载体的单位表达量进行测定.结果 表明,A 18-KEKE、...