植物抗病基因同源序列研究进展

以列表的形式,从引物设计、分离并登录GenBank的RGA数量、在连锁群中的分布、相关联的基因或位点等几方面综述了1995—2005所开展的各项抗病基因同源序列（RGA）研究,并对RGA的结构特征、分布与进化的特点、目前的应用现状、今后的研究前景及应注意的问题进行了评述。     

利用同源序列发掘抗病候选基因的方法

抗病基因的分离和克隆对于实施作物抗病基因育种及开展抗病机制的研究具有重要意义。目前植物抗病基因的克隆方法主要有转座子标签技术和图位克隆技术。该法对于未知基因产物或者没有进行精细定位的性状来讲，其应用受到极大限制。近年来，很多研究探索了利用同源序列发掘抗病候选基因的途径。本研究归纳和总结了三条发掘抗病候选基因的方法，旨在对作物抗病基因及其连锁标记的发掘起到一定的指导作用。     

大豆抗病基因同源序列的克隆与分析

本研究根据已知抗病基因的NBS保守序列区设计4对简并引物和1对特异引物，以大豆农家种兴县灰布支黑豆为材料，应用PCR方法获得了11条来自基因组DNA的RGA序列和2条来自cDNA的RGA序列，序列长度在500—633bp之间，其中8条来自基因组DNA和2条来自cDNA的RGA序列已在GeneBank登录(登录号为：AF305388—305392，AY008380—008382，AY048863-AY048864)。13条序列都不同程度的含有NBS保守区的P-环(GGVGKTT)、kinase-2(VLDD)、kinase-3(GSRII)及跨膜区GLPL等特征序列结构，由此推导出的氨基酸序列同已知抗病基因L6、RPMl、SRPS2、N编码的氨基酸序列表现出从25％——42％的同源性。本研究克隆的RGA序列根据其相似性可分为4组，与已发表的大豆抗病类似基因(RLG)具有较高的相似性。     

甘蔗NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定

根据已知植物(拟南芥、烟草和亚麻)抗病基因(RGAs)保守序列设计简并引物, 从甘蔗高抗黑穗病品种NCo376的基因组DNA和cDNA中扩增出11条抗病基因同源序列, 其中5条来自基因组DNA(EF059973, EF059974, EF059975, EF059976和EF059977), 6条来自cDNA(EF155648、EF155649、EF155650、EF155651、EF155652和EF155653)。序列分析表明, 这些RGAs均含有典型的NBS-LRR类抗病基因所拥有的保守结构域P-loop, Kinase-2a, Kinase-3a 和疏水结构域。聚类分析表明, 11条RGA同RPS2和XA1聚为一类, 而N和L6则单独聚为一类。所有11条抗病基因同源序列中, kinase-2(LLVLDDVW/D)最后一个氨基酸皆为色氨酸。定量PCR分析表明, 编号为EF059974的PIC基因的表达不仅受黑穗病菌胁迫的影响, 而且受水杨酸的诱导和过氧化氢的抑制, 也具有抗病基因组织特异性和组成型表达特性。     

水稻抗病基因同源序列多态性与品种鉴定

利用已知植物抗病基因不同保守序列设计的S1/AS3和XLRR for/XLRR rev两对引物对22个水稻品种DNA进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳.分析结果表明水稻抗病基因同源序列类型丰富,2对引物共扩增出143条带,品种间有差异的谱带92条,根据谱带差异可将供试品种完全鉴别出来.证明抗病基因同源序列分析可以用于水稻品种鉴定.     

小麦抗病基因同源序列(RGAs)的克隆与分析

RGA(抗性基因同源序列)法是克隆植物抗性基因的一种经济有效的方法,成为近年来的研究热点。本实验综合分析了拟南芥,西红柿,水稻,烟草等植物已克隆的抗性基因,并以这些抗性基因的NBS(核酸结合位点),LRR(富含亮氨酸重复),STK(丝氨酸/苏氨酸激酶)保守结构域设计并合成了几十对RGA引物,对小麦抗条锈病材料进行PCR扩增,获得以Xal-NBS为引物的R88RGA片段,经克隆和序列比对分析,发现该片段与逆境条件下植物抗病信号传导相关,与蛋白激酶同源性达到96%。此项研究对抗病机理的研究和基因的发掘有重要的指导意义。     

海岛棉NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆与定位

植物R基因产物存在非常类似的结构域，如NBS、L,RR、STK、LZ、TM、TIR等。依据保守序列设计引物寻找抗病基因类似物(Resistance Gene Analog，RGA)，从而定位或克隆抗病基因在理论上是可行的，这种方法称为R基因同源克隆法。RGA往往与已知抗病基因具有很高的相似性，均含有LRR、NBS或蛋白激酶中的保守基序，有的与已知抗病基因连锁，或是抗性基因家族中的成员，抑或与已知抗病基因无关，它们最有可能参与植物抗病反应过程中的信号识别、信息传导等途径，并且与植物抗病基因具有密切的关系，但RGA并非等同于植物R基因。将RGA作为分子标记整合到植物分子连锁图谱中，或将其作为探针筛选基因组文库，获得候选抗病基因则不失为一条克隆基因的捷径。利用已知R基因的保守序列设计引物进行PCR扩增，已经在植物中分离到了许多与已知R基因同源的DNA序列，并且有很多RGA作为标记定位在抗病位点附近，有点被证明与抗病性状共分离。小麦抗叶锈基因Lrl0的分离是利用该方法进行抗病基因克隆的首次报道。本研究依据N，L6，RPS2等NBS类抗病基因的NBS保守区设计简并性引物扩增棉花基因组DNA，在517bp左右获得特异性扩增条带。回收PCR产物，连接转化共得到800个克隆。经酶切筛选、嵌套引物鉴定获得252个候选RGA克隆。测序后获得11条RGA序列，这些序列的大小在500—527bp之间，其中3条序列中含有1或2个终止子。所有11个RGA序列都含有NBS保守区的Kinase海岛棉1a(GGVGKTT)、kinase-2(VLDD)、kinase-3a(GSRII)及跨膜区(GLPLA)等保守结构域，与已知抗病基因的保守结构具有较高的吻合程度。本研究所获得的RGA与大豆、棉花、腰豆等作物中已经克隆的NBS类RGA的核苷酸序列有很高的相似性。其中8条可通读的RGA序列推导出的氨基酸序列同已知抗病基因L6、RPMl、SRPS2、N表现出从25％——58％的相似性。本研究以海陆杂交F2群体作为定位群体，应用RFLP方法将获得的7条RGA序列定位在棉花基因组中。Gbrga2和Gbrga8定位于第11同源群的三个位点：连锁群1302的端点及连锁群A03距端点59．2cM处。在连锁群1302中与pAR286E4C标记定位在同一位点，与Unig22d03bE6D标记相距5．6cM在连锁群A03中与pARlllE3C标记共同定位在端点，同时定位在Unig26804E5D(22D)标记下游1．7cM处和Gate4DB08bE3D(14D)标记上游8．6cM处。Gbrga508和Gbrga535定位于第4同源群的两个位点，D染色体组的第20号染色体上距端点175．3eM处，与Unig27A04E5C标记和M16—118E1C标记分别相距2．7cM和3．8cM；Gbrga508和Gbrga535同时还定位于A染色体组第5号染色体上距端点142．9cM处，与G1025aE5C标记和Gate2CFllE3C标记相距2．6cM和1．2cM。Gbrga522，Gbrga568和Gbrga39定位于第4连锁群D染色体组的第20号染色体上距端点5．5cM处。与Unig24H03E6C标记和P13—6E3D标记分别相距1．0cM和2．0cM。海岛棉RGA的获得、在基因组的定位，对于棉花NBS类R基因的起源和进化，利用分子标记辅助育种以及棉花抗病基因的克隆，提供了重要的背景。     

喀西茄抗病基因同源序列的分离与分析

本研究根据已知植物抗病基因的NBS-LRR保守结构域设计了1对简并引物,对野生茄子喀西茄(Solanum khasianum)中抗病基因的同源序列(resistance gene analogs,RGAs)进行克隆和分析.结果表明,所获得的11个抗病基因同源序列都是Non-TIR-NBS-LRR类抗病基因,聚类分析将其分为5个亚类.由其核酸序列推导的氨基酸序列与已知抗病基因(N、L6、M、Prf、Gpa2和RPM1)相应区域的相似性为21.7%～52.4%.BlastX分析发现,SkRGA4和SkRGA10与辣椒抗根结线虫基因有着很高的同源性,SkRGA3和SkRGA6与野生马铃薯的抗晚疫病基因有着很高的同源性.     

用基因组原位杂交方法分析甘蔗-斑茅杂种及回交后代的染色体组成

斑茅(Erianthus arundinaceus Retz)是甘蔗的近缘属植物,具有多种优良特性,是甘蔗育种的重要种质资源之一。本实验使用基因组原位杂交(GISH)技术分析了甘蔗-斑茅杂种及回交后代F1、BC1和BC2的染色体构成与传递行为。结果表明:在F1代,来自斑茅HN92-77的染色体数目介于28～30条,来自热带种Badila的染色体数目介于38～40条,体细胞染色体数为2n=68～70,基本符合n+n的染色体传递方式;在BC1和BC2代,来自斑茅的染色体数分别为22～28条和13～15条,来自甘蔗的染色体数分别是87～94条和98～101条,其体细胞染色体数2n分别为110～121条和112～115条,基本上分别符合2n+n和n+n的染色体传递方式。在所观察的渐渗系中,均存在有染色体丢失的现象,但未观察到染色体发生交换与重组。     

“金手指”香蕉抗枯萎病基因同源序列的克隆与分析(英文)

本研究以抗镰刀菌枯萎病香蕉种质"金手指"(AAAB)为材料,根据已克降的抗枯萎病基因的NBS保守结构域设计简并引物,通过同源序列克隆获得了20条来自基因组DNA的RGA片段,大小为530 bp左右.根据其推断的氨基酸序列,经保守结构域分析,其结构域均为NB-ARC,属于non-TIR-NBS类候选抗病基因类序列.它们均具有P-loop(GMGGVGKTT),Kinase-2(LLVLDDIW),RNBS-B(CKVLFTTRS)及疏水氨基酸结构域GLPL(GLPLALKVL)等4个保守氨基酸基元.20个RGA之间核苷酸序列的相似性在41.1%～99.3%之间,氨基酸序列的相似性在33.2%～96.3%之间.同时,对分离得到的20条RGAs进行系统发育树分析,发现它们分布在5个不同的区域.并且所编码的氨基酸序列与已知抗枯萎病基因Fom-2、I2C-1、I2C-2和I2等编码的氨基酸序列表现出28%～54%的同源性,证明了抗病基因在进化上具有一定的保守性.因此,这些抗病基因同源片段(RGA)的分离将为进一步从香蕉中分离抗枯萎病基因打下基础,也可作为分子标记筛选香焦抗枯萎病的候选基因.     

云南抗白叶枯病稻种的RGA初析

根据水稻抗白叶枯病Xa21基因的富含亮氨酸重复区域（LRR）和番茄抗细菌性斑点病(Pseudomonas syringae pv. tomato)的Pto基因编码蛋白质激酶的DNA序列，设计2对引物用于扩增抗水稻白叶枯病品种中的抗病基因同源序列。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和聚类分析，结果表明供试抗病品种间具有丰富的RGA多态性，用同一引物测定的属于同一簇     

利用中间偃麦草抗病基因同源序列分离黄矮病抗性候选基因克隆

根据已克隆植物抗病（R）基因编码蛋白质的保守结构设计简并引物,利用同源序列法PCR扩增、克隆到9个具有开放阅读框的中间偃麦草R基因同源片段（Resistance Gene Analogs,RGAs）。利用抗黄矮病材料(含Bdv2)、感黄矮病材料（无Bdv2）进行RFLP分析,筛选到1个NBS类RGA序列TirgaZ1与Bdv2连锁。根据TirgaZ1的序列重新设计1对引     

植物抗病基因研究进展

分子生物学技术的飞速发展及其在植物病理学中的广泛应用，为植物抗病基因的克隆奠定了坚实的基础。近40个植物抗病基因结构与功能的明确，有利于深入研究病原菌与寄主之间的相互作用关系，制定更为有效的植物病害防治措施。本文对植物抗病基因的克隆策略、结构与功能、抗病分子机制，以及植物抗病基因在转基因分子育种中的应用前景进行了综述。     

西瓜抗枯萎病基因同源序列的克隆与分析

本研究根据已克隆的抗枯萎病基因的NBS保守结构域设计了22条上游简并引物和17条下游简并引物,以西瓜抗枯萎病种质PI296341-FR和感枯萎病品种97103为材料,获得了7条来自基因组DNA的RGA序列（GenBank登录号：DQ156558-DQ156564）,均含有NBS保守区的P-环、kinase-2或kinase-3等抗病基因的特征序列结构,所编码的氨基酸序列与已知抗枯萎病基因Fom-2、I2C-1、I2C-2和I2等编码的氨基酸序列表现出11%～72%的同源性,其中来自PI296341-FR的RGA序列175R1与甜瓜抗枯萎病基因Fom-2的同源性最高,为72%。来自PI296341-FR与97103的RGA序列之间同源性较高（73%～97%）,证明了抗病基因在进化上的保守性。