马铃薯StSnRK1基因过表达提高烟草耐盐性研究

为研究马铃薯蔗糖非发酵-1-型相关蛋白激酶-1基因StSnRK1对于调控植物耐盐性的促进作用,以过表达StSnRK1的烟草株系及野生型为试验材料,研究盐胁迫下StSnRK1对植株生长的影响。耐盐性鉴定结果表明,过表达StSnRK1基因显著提高烟草植株的耐盐性。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析显示,StSnRK1基因显著上调脯氨酸生物合成相关基因(吡咯琳-5-羧酸合酶NtP5CS)、胚胎发育后期丰富蛋白基因(NtLEA5)和活性氧清除系统相关基因(超氧化物歧化酶NtSOD和过氧化物酶NtPOD)。同时,转基因烟草植株的SOD活性、POD活性和脯氨酸含量显著高于野生型烟草植株,丙二醛(MDA)含量和过氧化氢(H₂O₂)含量显著低于野生型植株。由此可见,StSnRK1基因在改良植物耐盐性方面具有重要作用,为耐盐马铃薯生物技术育种提供了理论基础。     

玉米转座因子Ac在转基因烟草及其后代中的转座行为

用带嵌合基因３５Ｓ－Ａｃ－ＧＵＳ的农杆菌双元载体转化普通烟草品种Ｎｃ８９,对转基因植株及其回交后代,进行ＧＵＳ组织化学分析,检测到转座因子Ａｃ在部分Ｔ０代和ＢＣＦ１代植株中转座。用Ａｃ作探针,与上述Ｔ０代和ＢＣＦ１代植株的基因组ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,结果表明,Ａｃ从原来所在的Ｔ－ＤＮＡ解离,并整合到烟草基因组的其它位点。     

烟草DREB-like转录因子的克隆与鉴定

在NCBI网站BLAST得到5个烟草表达序列标签(EST),据此设计引物,从烟草(Nicotianabenthamiana)品种本塞母氏中分离出2条DREB(dehydration-responsiveelementbindingprotein)-like转录因子基因,分别命名为NbDREB1和NbDREB2。与相关AP2/EREBP类转录因子比对结果显示,NbDREB1和NbDREB2都具有典型的AP2/EREBP转录因子家族EREBP亚族A类AP2区特征,并且都能在大肠杆菌(Escherichiacoli)中表达。酵母单杂交结果显示,都不具有激活功能。连接pGADT7反式激活载体进行酵母单杂交结果显示:NbDREB1能与DRE顺式作用元件结合,NbDREB2则不能,表明NbDREB1为抑制型DREB类转录因子。比较NbDREB1和NbDREB2的AP2区发现:两者在第2位和第49位氨基酸处不同,NbDREB1为Y和K,NbDREB2为N和R。     

烟草DREB-like转录因子的克隆与鉴定

在NCBI网站BLAST得到5个烟草表达序列标签(EST)，据此设计引物，从烟草(Nicotiana benthamiana)品种本塞母氏中分离出2条DREB(dehydration-responsive element binding protein)-like转录因子基因，分别命名为NbDREB1和NbDREB2。与相关AP2/EREBP类转录因子比对结果显示，NbDREB1和NbDREB2都具有典型的AP2/EREBP转录因子家族EREBP亚族A类AP2区特征，并且都能在大肠杆菌(Escherichia coli )中表达。酵母单杂交结果显示，都不具有激活功能。连接pGADT7反式激活载体进行酵母单杂交结果显示：NbDREB1能与DRE顺式作用元件结合，NbDREB2则不能，表明NbDREB1为抑制型DREB类转录因子。比较NbDREB1和NbDREB2的AP2区发现：两者在第2位和第49位氨基酸处不同，NbDREB1为Y和K，NbDREB2为N和R。     

人溶菌酶基因在烟草中的表达

根据植物偏爱的密码子，改变G＋C总量和密码子第三位碱基的G＋C含量，同时避免在真核表达中影响转录，翻译及mRNA稳定性的序列如AATTAAA和ATTTA，在原氨基酸序列不变的基础上，设计并合成了适合在植物中中高效表达的人溶菌酶(human lysozyme,简单HL）基因。构建了含HL基因的植物表达载体。用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)介导法将其转化烟草（Nicotiana tabacum).PCR和Western检测表明，HL基因在转基因烟草中得到整合和表达，提高了转基因烟草离体叶对野火病（Pseudomonas syringaepv.tabaci)的抗性。     

番茄SlPSY1基因转录调控因子筛选及互作验证

番茄八氢番茄红素合成酶(SlPSY1)作为类胡萝卜素生物合成途径的关键限速酶,直接影响果实中类胡萝卜素的积累。为探究SlPSY1基因的转录调控机制,通过克隆SlPSY1基因启动子序列,构建pSlPSY1pro-AbAi诱饵载体,并将诱饵载体转化至酵母细胞中获得诱饵酵母菌株。利用番茄混合组织酵母杂交cDNA文库进行酵母单杂交筛库试验,筛选得到AP2/ERF家族转录因子SlJERF1和10个未知功能蛋白。后续克隆SlJERF1基因序列,构建pGADT7-SlJERF1重组载体,通过酵母单杂交点对点对SlJERF1进行分子验证,结果显示在金担子素(AbA)浓度为150 ng·mL^-1的条件下,对照组酵母不能正常生长,而试验组酵母能正常生长,表明SlJERF1与SlPSY1基因启动子存在互作。这一结果为进一步拓展类胡萝卜素合成调控网络提供了重要的理论依据。     

冷诱导基因转录因子CBF1的组成型表达对植物的抗寒性及生长发育的影响

通过农杆菌介导法将玉米泛素启动子(Pubi)调控的CBF1基因以及CaMV35启动子调控的GUS基因一起转化烟草,研究了冷诱导基因的转录因子CBF1(CRT/DRE binding factor 1)对植物抗寒性及生长发育的影响。结果表明:CBF1的组成型表达增强了冷敏感植物的抗寒性;在表型上使植株矮壮,叶片着生密集,叶色深绿,叶厚度增加;促进侧枝生长,延长营养生长期,推迟花期;对植株的结实性无明显影响。植株抗寒能力以及表型变化程度与CBF1的表达强度相关。因此,利用CBF1基因进行植物遗传改良时应根据物种的应用特点采用合适的表达调控策略。     

germin基因的克隆及其在烟草中的表达

摘要：克隆了具有草酸氧化酶活性的小麦(Triticum aestivum )Germin蛋白的基因，构建了植物表达载体并用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens )介导法转化烟草。Southern杂交和酶活性检测表明，germin基因在转基因烟草(Nicotiana tabacum )中得到整合、表达，并正确组合成具有草酸氧化酶活性的同源六聚体蛋白。离体实验表明，外源germin基因的表达提高了转基因烟草离体叶片对草酸的耐受性。     

体外改组强耐盐基因NHXFS1在烟草中的表达及耐盐性分析

位于植物液泡膜的 Na+/H+逆向转运蛋白(NHX1)是将 Na+区隔化到液泡中的主要蛋白,对植物耐盐性起着极其重要的作用。NHXFS1 基因是以拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)和菊花(Flos chrysanthemi)的液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白基因 AtNHX1、OsNHX1 和 DmNHX1 为模板,通过 DNA家族改组技术,对其进行体外定向分子进化获得的一个功能显著增强的新基因。本研究利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumerfaciens)介导的叶盘法将 NHXFS1 基因转入烟草 (Nicotiana benthamiana)中,通过潮霉素抗性筛选出再生植株,经PCR 和 Southern blot 鉴定证实 NHXFS1 基因成功地整合到烟草基因组中。耐盐性测试结果显示,高盐胁迫条件下,萌发期和幼苗期的转基因烟草长势明显优于对照组,与对照组相比,转基因烟草叶片中积累了更多的脯氨酸和Na+。 RT-PCR和 Real-time PCR 结果表明,NHXFS1 基因在烟草中正常表达,盐胁迫条件下NHXFS1基因在根、茎、叶中的表达量分别上调了 1.01、0.60 和 1.79倍,跟对照组相比有明显提高(P<0.05)。研究结果提示,体外改组获得的新基因 NHXFS1 在植物耐盐基因工程和分子育种中具有较大的应用价值,同时也证明通过基因改组方法开发新基因用于改良植物耐盐性是可行的。     

玉米花青素调节基因Lc对转基因烟草和矮牵牛花色的影响

利用PCR方法从油菜(Brassica napus)基因组中扩增得到花瓣特异性启动子XY355,构建该启动子与玉米(Zea mays)花青素调节基因Lc的植物表达载体pXY60。通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导,将pXY60分别转化烟草(Nicotiana tabacum)和矮牵牛(Petunia hybrida)。对再生植株进行PCR检测,结果表明,外源基因已经整合到转基因烟草和矮牵牛的基因组中。观察发现,转基因植株的表型发生了明显变化:转基因烟草的花色由浅红变成了红色,转基因矮牵牛的花色由白色变成了浅紫色。     

小麦胁迫响应转录因子基因TaSNAC1的克隆与表达分析

胁迫响应NAC转录因子参与植物非生物胁迫过程,过表达水稻(Oryza sativa)SNAC1可显著提高植株耐旱、耐冷和抗盐性。本研究同源克隆了小麦(Tricum aestivum)TaSNAC1基因(GenBank登录号No.JN621240),分析了其表达产物的亚细胞定位,并利用实时定量RT-PCR分析了其在不同组织、PEG和NaCl胁迫下的表达。该基因包含一个内含子,编码329个氨基酸残基的蛋白产物。TaSNAC1与其他禾本科植物SNAC1蛋白高度相似,其与大麦(Hordeum vulgare)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、水稻、玉米(Zea mays)和高粱(Sorghum bicolor)SNAC1序列相似性依次为97.3%、86.3%、81.1%、79.1%和79.2%。TaSNAC1可能以二聚体形式存在,包含核定位信号和典型的NAM结构域,100~107位的"WKATGXDK100-107"核心基序处于一段β折叠中,其弯曲产生的凹面可能直接参与DNA结合。瞬时转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶肉细胞原生质体的实验表明,TaSNAC1特异定位于细胞核中。盐胁迫条件下,叶和根中TaSNAC1的表达量均升高,且表达模式相似,但根中响应更显著;PEG胁迫下,根中TaSNAC1对胁迫的响应较快且幅度较大,而叶中响应较慢且幅度较小。研究结果提示,TaSNAC1参与小麦的非生物胁迫响应过程,在耐旱、抗盐遗传改良中具有潜在应用价值。     

转录因子DREB1A基因的克隆及植物表达载体的构建

研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用。根据GenBank中登录的DREB1A基因的序列设计引物,用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因,利用基因重组技术成功构建了植物表达载体pCAMB1A1300-DREB1A。该结果为进一步利用DREB1A基因做遗传转化研究奠定了基础。     

陕南典型烟区代表性烟田土壤系统分类研究

土壤条件对烟叶的香型风格的彰显程度有着重要影响。土系是系统分类中最低级的基层分类单元。本研究以我国烤烟中间香型产地之一陕南安康的旬阳和汉中的南郑为研究区域,在综合考虑地形地貌、成土母质、土壤条件、烟叶长势和质量的基础上,在每个地区确定5个典型优质烟田尝试建立相应的土系。结果表明:1调查的陕南烟区10块代表性烟田分属人为土、淋溶土和雏形土3个土纲,归属于4个亚纲、11个土类、13个亚类,可分划为18个土族和19个土系。2鄂西烟田总体上起垄层质地多为壤质,养分含量中等且协调,较适宜优质烟叶种植,但需要增施有机肥和实行等高种植。     

禾谷镰刀菌Fgap1转录因子调控Tri基因表达及DON毒素合成

DNA序列同源比对分析预测出镰刀菌氧胁迫调控因子Fgap1在DON合成基因簇的Tri5和Tri10基因上有结合位点。为阐明Fgap1转录因子在禾谷镰刀菌的Tri基因表达和DON产生中的作用,本研究以野生型PH-1和突变株⊿Fgap1为试验材料,通过菌落形态观察、菌丝生长速率、菌丝结构观察分析氧压敏感性,通过实时荧光定量PCR技术分析Tri基因在不用氧化压力下的表达量,并采用HPLC法测定DON毒素含量。结果表明,过氧化氢、甲耐醌、过氧化叔丁醇、重铬酸钾4种氧化剂均可抑制镰刀菌生长;通过同源重组构建的Fgap1基因缺失突变株对氧化压力更加敏感,明显抑制了镰刀菌的菌丝生长。在氧化胁迫下野生型PH-1菌株中DON毒素含量大量增加,Fgap1基因缺失突变株的DON毒素含量没有明显增加;在氧化胁迫下野生型PH-1菌株的Fgap1基因和Tri基因的表达量大幅上调,而基因缺失突变株⊿Fgap1中未检测到Fgap1基因表达,Tri基因的表达没有明显上调。本研究明确禾谷镰刀菌中Fgap1转录因子能够感受并传递氧化压力信号,为调控Tri基因的表达和DON毒素的合成提供了一定的理论依据。     

毛白杨抗病相关转录因子基因PtWRKY1的表达特性分析

WRKY转录因子作为植物特有的一类重要转录调控因子,广泛参与植物对生物和非生物胁迫的应答反应及形态发育和组织衰老等,已引起人们的关注。本文以前期克隆得到的毛白杨WRKY转录因子基因（命名为PtWRKY1）为研究对象,开展其基因枪介导洋葱表皮细胞瞬时表达、外源信号分子（水杨酸SA,茉莉酸MeJA,脱落酸ABA）诱导表达、转PtWRKY1基因烟草植株的烟草花叶病毒（TMV）接种实验以及抗病相关基因表达的实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）分析等研究。结果表明,PtWRKY1基因编码蛋白定位于细胞核,SA、ABA及MeJA处理均可诱导PtWRKY1基因表达,但不同诱导因子对PtWRKY1表达量的影响存在一定差异;同时,TMV侵染实验发现外源PtWRKY1表达能增强转基因烟草抗TMV能力,qRT-PCR分析表明PtWRKY1基因及膜保护性酶（POD,SOD,CAT）基因均受TMV诱导而增强表达。本文研究结果可为后续开展毛白杨转录因子PtWRKY1的功能鉴定及应用奠定基础。     

皖南烟叶香气成分因子及关联度分析

为探讨各类香气物质对皖南地区烟叶特殊香型形成的作用,本试验对皖南地区四种典型土壤所产烟叶香气进行了因子分析,及香气综合评定值与土壤养分的关联度分析。结果表明:利用因子模型在阐明以因子形式表现的香气物质变量间的关联时,可信度高。因子分析证明类胡萝卜素类物质降解产生的香气物对烤烟香气影响最显著,可推断烤烟的香气特色主要是由烟叶中类胡萝卜素类降解产物的量及协调程度决定的,这其中又以巨豆三烯酮最为重要。在皖南地区烟株生长及香气品质形成过程中,土壤pH值起重要作用,土壤速效钾、全磷影响作用逐渐增加,碱解氮、有机质影响作用逐渐降低。     

人胰高血糖素样肽1在转基因番茄中的表达

人胰高血糖素样肽1（GLP1）是一种短肽激素,对Ⅱ型糖尿病具有很好的疗效。本研究在设计合成GLP1基因并构建植物表达载体的基础上,通过农杆菌介导将GLP1基因导入番茄基因组中,经过PCR扩增和Southern Blot分析,证实GLP1基因已整合进入9个株系的番茄基因组中。Western Blot检测表明,其中4个株系转基因番茄的叶片能够检测到hGLP1融合蛋白的表达。通过Ni—NTA亲和层析分离纯化转基因番茄表达的hGLP1融合蛋白,动物实验表明该融合蛋白具有显著的降血糖生物活性。本研究结果将为转基因番茄作为生物反应器表达药用蛋白提供重要的理论和技术支持,并将为培育具有糖尿病治疗功能的番茄新品种奠定基础。     

Starch degradation by alpha-amylase in tobacco leaves during the curing process

Tobacco (Nicotiana tabacum L.) leaf starch is degraded to sugars through curing (42°C/82.3% relative humidity/72 h). Total carbohydrate content remained almost constant, starch content decreased markedly, and soluble sugar content (mostly glucose) increased. α-Amylase and starch phosphorylase activities increased sixfold and threefold, respectively, whereas β-amylase activity was unaltered and isoamylase activity decreased. Increased α-amylase activity was accompanied by increased α-amylase protein levels. Although tobacco has four α-amylase gene members, only NtAMY1 mRNA levels increased. For other starch degradation genes, such as NtBAM1 and NtBMY2 (β-amylase), NtISO1 and NtISO2 (isoamylase) and NtGWD1 and NtGWD3 (glucan water dikinase), the mRNA levels remained unaltered during the first 48 h of curing. NtAMY1 expression was induced by osmotic stress but was unaffected by high temperature and/or injury stresses. Similarly, soluble sugar contents were largely increased by osmotic stress. This suggests that starch is degraded by α-amylase during curing and that α-amylase is coded by NtAMY1, induced by osmotic stress.