牛早期胚胎性别鉴定快速PCR方法的研究

根据公牛Y-染色体特异重复序列和公母牛共有的DNA序列,设计并合成PCR引物用于牛或牛胚胎性别鉴定,通过PCR反应对公母牛静脉血及牛胚胎进行性别鉴定,结果表明,母牛只能扩增出250 bp的内标基因片段,而公牛能同时扩增出131 bp的Y-染色体特异性基因片段和250 bp的内标基因片段.静脉血样与实际性别的符合率为100%;4～10个胚胎细胞的扩增也出现和静脉血相同的特异条带.这表明该检测方法准确、简便,具有较高的灵敏性和稳定性.     

水稻(Oryza sativa)新型液泡Na+/H+逆向转运蛋白基因的特征分析和表达

以拟南芥AtNHX1 cDNA 片段作为探针,筛查水稻盐胁迫植株叶片cDNA 文库,获得与AtNHX1同源的水稻新型液泡Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因（OsANT1）。序列分析表明,OsANT1 全长cDNA为2 178 bp,包括一个长度为1 608 bp的完整开放阅读框,编码535个氨基酸残基。在DNA水平上,OsANT1基因含有15个外显子和14个内含子,长度为4 835 bp。OsANT1含有12个跨膜域,系统进化树分析结果表明,与来自拟南芥、水稻、小麦、玉米、大麦、马蔺和芦苇等的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白高度同源。盐胁迫条件下,OsANT1的表达具有盐分诱导特征,且随着胁迫的增大而增加。表明该基因可能在水稻抵御盐分胁迫的过程中具有一定作用。     

水稻26kDa球蛋白基因启动子克隆及序列分析

以水稻品种日本晴基因组总DNA为模板,采用PCR扩增获得约900bp大小的DNA片段,回收该片段并与pUCm-T载体连接,转化感受态大肠杆菌.进行PCR检测和酶切鉴定,选取阳性克隆进行测序分析.测序结果显示,该片段含904个核苷酸对;采用vector NTI软件将本试验中克隆的序列与Genbank（AY427575）公布的日本晴球蛋白基因启动子序列比对,有9个核苷酸差异,同源性为99%,证实本试验中克隆的DNA序列为水稻球蛋白基因启动子;在重要功能区段上,两者核苷酸序列完全一致.本研究认为造成长期不在一个环境中种植的同一水稻品种球蛋白基因启动子序列差异的原因之一,可能是核苷酸中性突变.水稻球蛋白基因启动子的成功克隆,为今后开展水稻等重要农作物转基因研究奠定基础.     

水稻硝酸盐转运蛋白基因OsTNrt2.1的编码蛋白特征和表达

根据Nipponbare的OsNrt2.1 cDNA序列,从氮效率较高的水稻品种TP309中克隆了与OsNrt2.1高度同源的硝酸盐转运蛋白（NRT）基因OsTNrt2.1。其开放阅读框为1 602 bp,编码533个氨基酸残基。OsTNrt2.1具有NRT共有的结构特征,与拟南芥、玉米、小麦、大麦和烟草的NRT基因高度同源。OsTNrt2.1的表达表现器官特异性,在根中高于在叶中。此外,OsTNrt2.1的表达受NH₄⁺的抑制和NO₃^-的诱导,并具典型的昼夜节律特征。在不同NO₃^-浓度下,OsTNrt2.1的表达水平相近,表明OsTNrt2.1可能是具有双亲和特征的NRT基因。在不同氮源及不同介质氮浓度条件下,OsTNrt2.1在根中的表达均高于在叶中,表明OsTNrt2.1对于根系吸收NO₃^-可能具有重要作用。     

猪IgG Ⅱ类Fc受体基因真核表达重组质粒的构建及表达

利用本研究小组克隆的猪IgG Ⅱ类Fc受体cDNA(swFcγRⅡ)基因序列(DQ026064)设计引物,应用RT-PCR技术,从猪外周血白细胞cDNA中扩增了完整的960 bpswFcγRIIORF序列,利用基因重组技术将swFcγRIIORF基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3,经PCR及双酶切鉴定:扩增出901 bp的PCR产物;KpnI/EcoR I双酶切,切出5 376和901bp DNA片段,表明重组质粒pcDNA/swFcγRⅡ构建成功。然后脂质体法转染COS-7细胞,用玫瑰花环试验鉴定了swFcγRII配体亲和特性。     

农杆菌介导轮状病毒抗原蛋白VP4基因遗传转化花生的研究

选用鲁花14与花育23花生品种, 通过农杆菌介导开展了轮状病毒抗原蛋白VP4基因遗传转化研究, 从转化植株中随机选取26株表现Kan抗性植株进行npt II基因的PCR检测, 结果有22株能扩增出620 bp左右的npt II基因条带, 阳性率约为84.62%。提取npt II基因显示为阳性的植株叶片DNA作模板, 用VP4基因特异引物进行PCR扩增, 经琼脂糖凝胶电泳分析, 所有npt II基因阳性的植株均扩增出了约2 350 bp的特异性条带, 而野生型没有。对部分转基因植株进一步进行PCR-Southern杂交和Southern杂交分析, 发现转基因植株中出现了阳性杂交信号, 表明VP4基因的确已经整合到花生的基因组中, 并且是1~2个拷贝。用RT-PCR分析了11株转G1VP4基因的植株, 证明插入鲁花14中的VP4基因已经正常转录, 利用Western blot方法检测筛选到的4株转基因花生, 分别提取其蛋白, 在30 kD处出现特异性蛋白条带, 这为获得转基因创新种质材料奠定了基础。     

番茄WRKY转录因子基因片段的克隆及序列分析

【研究目的】本研究以番茄苗为实验材料,克隆出番茄WRKY转录因子的一个基因片段并对其核酸序列进行分析。【方法】根据本课题组已经克隆出的番茄特异的WRKY基因片段和番茄EST序列设计特异引物,利用RT-PCR技术获得番茄WRKY转录因子的一个基因片段并连接到pMD19-T载体中,转化DH5α,,筛选阳性克隆,用双酶切分析法对其进行鉴定并进一步对核酸序列进行测序分析。【结果】结果表明,克隆获得的WRKY转录因子基因片段约为680bp,用GenBank中的Blastn程序分析表明,其与CaWRKY（AY789641.1）、WIZZ（wizz mRNA）（AB028022.1）的相似性分别为86％和84％。【结论】WRKY转录因子在番茄中受JA诱导,这为克隆番茄WRKY基因全长,进而为番茄抗病育种奠定基础。     

水稻(Oryza sativa L.)捕光叶绿素a/b结合蛋白基因全长cDNA的克隆和特性分析

根据捕光叶绿素a/b结合蛋白基因（cab）家族中的保守序列设计PCR引物,扩增出的约310 bp cDNA小片段为分子杂交探针,对构建的水稻cDNA文库进行杂交筛选,并结合PCR分析确定阳性克隆中cDNA片段的大小。通过对插入的cDNA片段最长的阳性克隆进行测序分析验证,克隆了水稻中1个cab基因全长cDNA,命名为cab-n8（GenBank登记号：AY     

辽宁绒山羊SRY基因编码区的分子特征研究

根据GenBank中山羊SRY基因序列设计一对引物,采用PCR在雄性辽宁绒山羊个体中扩增出了包含SRY基因整个编码区的特异片段,将特异PCR产物克隆到pMD18-T 载体中,转化DH5α菌,筛选出SRY基因的阳性克隆,进行了测序,将其序列与GenBank中部分偶蹄目动物的SRY基因序列进行同源性比较,用NJ法构建了系统进化树.结果表明,辽宁绒山羊SRY基因编码区长度为723 bp,共编码240个氨基酸,其中包含长度为231 bp 的HMG-box,位于编码区的第190至420位核苷酸之间,编码77个氨基酸(H64-A140).辽宁绒山羊SRY基因编码区序列与GenBank中山羊、绵羊、牛、牦牛、水牛、梅花鹿、麝香鹿及猪等偶蹄目动物的同源性分别为100%,97.09%,89.21%,89.21%,88.38%,87.55%,86.16%和68.04%;基于SRY基因编码区的核苷酸序列,构建的物种间系统树结果基本上与这些偶蹄目动物的传统系统分类相一致.     

小麦族物种线粒体基因rrn18–trnfM区域的序列多样性分析

为了研究线粒体基因组在小麦族物种中的遗传变异与进化关系,选用小麦族的14个二倍体及7个多倍体物种,对其线粒体rrn18-trnfM 基因区域进行PCR扩增并对扩增所得的片段进行克隆测序。获得大小不同的2种片段类型,大片段为513或515 bp,小片段为447或449 bp。其主要差异在trnfM区,即大片段存在trnfM基因,小片段缺失trnfM基因,再次证明以前报道的大麦属和小麦属间的分歧。而中间偃麦草同时存在两扩增片段类型,表明多倍体物种mtDNA具有双亲遗传现象。中间偃麦草的RT-PCR分析发现小片段没有转录,大片段能转录,因而考虑高频重组和选择性表达作为中间偃麦草的线粒体基因组独特的进化系统,这与核基因组进化系统不同。     

猪源2型链球菌福建株CPS2J基因PCR检测及序列分析

设计并合成一对扩增2型猪链球菌CPS基因的特异性引物,以猪2型链球菌福建株DNA为模板,筛选最佳反应条件,建立检测CPS2J基因的PCR方法,并对PCR扩增产物进行序列测定和同源性比较分析。结果如下：应用该方法对猪2型链球菌福建株和标准阳性株进行扩增,均获得与预期大小一致的675bp特异性目的片段,而对8株非2型猪链球菌的扩增结果均呈阴性;敏感性测定最低可检出100cfu细菌量或50pg 细菌DNA;SS2PFJ06CPS2J 基因部分核苷酸及其推导的氨基酸序列与猪链球菌2型不同菌株的同源性分别达98.7%-100%和97.8%~100%。上述结果表明建立并优化的猪2型链球菌CPS2J基因的PCR检测方法敏感性好、特异性高,能用于2型猪链球菌的分子流行病学调查和快速检测; 序列分析表明猪2型链球菌福建株与国内外8株标准株之间同源性高、亲缘关系密切。     

一种快速高效检测转基因玉米方法的建立

建立高效的目的基因检测方法是保障生物育种研发和产业化进程的重要技术支撑。应用常规PCR法、TaqMan探针实时荧光PCR法及叶片直接PCR法对转基因玉米叶片进行CaMV35S启动子和NOS终止子2个转基因元件的检测。结果表明,叶片直接PCR法分别较常规PCR方法和TaqMan探针实时荧光PCR法节约62%、48%的时间和25%、43%的成本,而且扩增出的目的条带清晰可见,符合目的片段大小,结果真实可靠,适用于大量转基因玉米植株叶片的快速筛选和鉴定。     

植物化的猪α-乳清蛋白基因人工合成

根据猪α-乳清蛋白基因cDNA序列设计了多对特异性引物,采用循环PCR方法人工合成了植物化的猪α-乳清蛋白基因编码区(398 bp)并对该PCR产物进行测序.DNA序列测定结果表明,采用循环PCR法扩增的产物是预期的猪α-乳清蛋白基因编码区,该植物化的猪α-乳清蛋白基因编码区可以用于植物转化,为猪α-乳清蛋白基因转基因植物研究和在转基因植物中进行动物基因表达研究奠定了基础.     

桑黄化型萎缩病植原体核糖体蛋白基因操纵子片段序列的扩增与分析

采用PCR技术对桑树黄化型萎缩病植原体核糖体蛋白基因操纵子的部分基因进行扩增,并对扩增片段进行测序及序列分析。结果表明,利用rpF/rpR引物对扩增得到桑黄化型萎缩病植原体核糖体蛋白基因操纵子片段大小为1240bp（GenBank登录号为GQ373255）,该片段包含rps19 基因部分序列,rpl22 和 rps3 基因的全部序列。相似性分析表明,该片段的核苷酸序列与16SrⅠ-rp亚组中各代表植原体的rp基因核苷酸序列的相似性为96.6-99.9%。构建的进化树表明,桑黄化型萎缩病植原体与报道的桑萎缩病植原体（MD）聚类为一个rp亚组,即rpI-B亚组。     

基于atpF-atpH序列鉴定稻属植物

为从分子水平上鉴定稻属,对稻属9种32份植物材料DNA条形码基因atpF-atpH进行PCR扩增并对PCR扩增产物测序,以近缘种植物为外类群建立系统进化树及序列差异分析,设计了鉴定稻属的特异性引物。结果表明,应用该特异性引物对稻属材料进行扩增,均获得与预期大小一致的113bp特异性目的片段,而对非稻属材料的扩增结果均呈阴性。系统进化树也显示出atpF-atpH基因可以很好将稻属区分开。这说明在条码基因差异位点分析的基础上,设计特异分子标记可用于稻属的鉴定,为珍贵物种的口岸鉴定提供了检测方法。     

猪圆环病毒的分子生物学检测

根据GenBank中发表的猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV-2)基因组序列,利用Primier5设计了一对特异性引物,分别采用CTAB法和DNA试剂盒提取猪脾脏总DNA,用PCR方法扩增猪PCV-2基因保守区序列,并对PCR扩增程序进行优化,对PCR检测方法的敏感性、重复性做了研究。结果显示扩增的目的片段约为573 bp,94°C 30 sec,60°C 30 sec,72°C 30 sec,30个循环扩增效果最好;模板DNA最低稀释倍数为100倍,即能检测到最低模板DNA的质量为25.8 ng;同一组织不同部位PCR检测的重复性较好;该检测方法为PCV-2的快速检测提供了方法和依据。     

贵州省2个猪种APOA5基因比较分析

摘 要：根据GenBank中报道的猪载脂蛋白A5 (apoA5)基因序列设计3对引物,通过PCR方法分别对可乐猪和贵州白香猪的apoA5基因进行扩增、测序,将两个猪种apoA5基因序列进行比对,并找出基因变异位点。结果表明：可乐猪apoA5基因DNA长为2474bp,白香猪apoA5基因DNA长为2473bp,分别包含三个外显子,两个内含子。两猪种apoA5基因编码区长皆为1092bp,编码363个氨基酸。白香猪apoA5基因序列与可乐猪相比,存在12个突变位点,其中6个位点为颠换,5个为转换,1个为缺失,两者核苷酸同源性为99.6%。这为进一步研究猪apoA5基因的多态性、生物学活性以及与猪生产性状相关性研究奠定了一定基础     

番茄黄化卷叶病毒病抗病基因Ty-1的CAPS标记建立

本研究旨在筛选获得与番茄黄化卷叶病毒抗病基因Ty-1紧密连锁的分子标记,为番茄抗病育种提供技术支撑。根据与抗病基因Ty-1紧密连锁的RFLP标记序列设计特异引物,以抗病杂合体（Ty-1/ty-1）、抗病纯合体（Ty-1/Ty-1）和感病纯合体（ty-1/ty-1）材料提取的DNA为模板,进行PCR扩增,而后经不同的核酸内切酶酶切处理,筛选获得与Ty-1基因紧密连锁的CAPS标记。结果显示从4个标记中筛选获得了2个稳定可靠的CAPS标记,即TG97和Mi23。TG97标记在抗病杂合体产生398 bp、303 bp和95 bp 3个特异片段,抗病纯合体产生303 bp和95 bp 2个特异片段,感病纯合体产生398 bp一个特异片段。Mi23标记在抗病杂合体产生402 bp和354 bp 2个特异片段,抗病纯合体产生402 bp一个特异片段,感病纯合体产生354 bp一个特异片段。研究结果表明TG97和Mi23这2个CAPS标记均为共显性标记,可用于番茄抗病育种的辅助选择中。     

Gateway技术快速构建百合双价抗病毒RNAi表达载体

为获得适合转化百合的双价RNAi表达载体,以感病百合叶片的总RNA为模板,分别扩增400 bp左右的LSV和LMoV CP基因。通过重叠延伸PCR技术获得长约800 bp的LSV-LMoV融合基因。利用Gateway技术,通过BP反应及LR反应将LSV-LMoV融合基因克隆到双元载体pH7GWIWG2(Ⅱ),成功构建了含两种病毒基因的RNAi表达载体pH7GWIWG2(Ⅱ)-LSV-LMoV。将构建好的双价表达载体导入农杆菌EHA105,PCR和测序表明所构建的载体及获得的工程菌与预期的完全一致。     

牡丹类psDHN-YSK2基因全长cDNA的克隆与表达分析

为了获得牡丹类脱水素基因的全长cDNA序列,推测其在休眠解除进程中的生物学功能,以不同低温处理时间的牡丹花芽为供试材料,末端快速扩增方法克隆全长cDNA序列,实时定量PCR分析其表达模式。结果表明牡丹类脱水素基因全长cDNA序列为1187 bp,包括831 bp的开放阅读框,114 bp的5’非编码区和242 bp的3’非编码区。其编码的蛋白具有两个植物脱水素蛋白特征性K片段,根据Close的分类方法,属于YSK2类脱水素蛋白。系统发生分析表明psDHN-YSK2基因与葡萄亲缘关系最近。在花芽内休眠解除前期随着低温处理时间的延长psDHN-YSK2表达呈上调趋势。本研究克隆了牡丹psDHN-YSK2的全长cDNA序列,分析了其在花芽内休眠解除过程的表达趋势,暗示了其参与了牡丹花芽的内休眠过程。