捻转血矛线虫重组磷脂酰肌醇转移蛋白对山羊外周血单个核细胞模式识别受体和细胞因子转录水平的影响

本文旨在研究捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)磷脂酰肌醇转移蛋白(phosphatidylinositol transfer protein, HCPITP)对山羊的免疫调节功能。构建了原核表达重组质粒pET-28a-HCPITP并获得重组蛋白;分析HCPITP基因在虫卵、第三期幼虫、雌虫和雄虫中转录水平的变化;将重组蛋白与山羊外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)共孵育,研究重组蛋白对山羊PBMCs增殖、模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)表达和细胞因子分泌的影响。结果显示,HCPITP基因在雌虫、雄虫、第三期幼虫和虫卵中相对转录水平分别为1、10.2、0.47和0.58。Western blot分析发现该重组蛋白具有较好的反应原性。该重组蛋白能够显著抑制ConA对PBMCs的增殖作用,重组HCPITP显著促进山羊PBMCs的IL-2、IL-4、IL-6和IL-17转录水平,主要促进模式识别受体TLR1与TLR10的转录。综上,HCPITP基因转录水...     

日本血吸虫幼虫巨大致死基因片段的克隆、表达及免疫效果分析

为研究日本血吸虫(Schistosoma japonnicum)幼虫巨大致死基因(Lethal giant larvae)的生物学功能,本研究应用荧光定量RT-PCR分析SjLgL基因在S.japonnicum不同发育阶段的表达情况,构建重组表达质粒pET-SjLgL进行诱导表达,对重组蛋白进行western blot鉴定;重组蛋白刺激免疫动物进行免疫保护试验,检测IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ的变化.结果表明,SjLgL基因在S.japonnicum不同发育时期均有表达,成虫期略高于童虫,雄虫高于雌虫.Western blot鉴定结果显示,该重组蛋白具有良好的抗原性.免疫保护试验结果表明,免疫小鼠分别获得了22.34％的减虫率和55.49％的肝脏减卵率.血清学检测结果显示重组蛋白免疫小鼠后产生了特异性IgG抗体.细胞因子检测结果表明,重组蛋白刺激免疫动物主要诱发产生Th1型的免疫应答.本实验结果表明该重组蛋白在小鼠体内可诱导产生部分免疫保护效果.     

鸡毒害艾美耳球虫ApiAP2转录因子的克隆、表达与虫体内定位

顶复门原虫的AP2结构域蛋白(ApiAP2)可能是调控虫体生长发育的转录因子。本研究旨在克隆、表达毒害艾美耳球虫ApiAP2转录因子，检测其天然蛋白及其在虫体内的亚细胞定位。以毒害艾美耳球虫第3代裂殖子的总RNA为模板，RT-PCR扩增毒害艾美耳球虫EnApiAP2基因后，连接至pMD18-T载体，测序后构建pET28a (+)-EnApiAP2表达载体，转化至表达菌BL21(DE3)，重组菌经测序鉴定后诱导表达，并纯化复性重组蛋白。用重组蛋白免疫BALB/c小鼠，制备鼠抗rEnApiAP2多克隆抗体。利用多克隆抗体，分别用Western blot和间接免疫荧光试验检测裂殖子中天然EnApiAP2蛋白及其定位。最后，应用荧光定量PCR分析EnApiAP2基因在第2、3代裂殖子中的转录水平。结果显示，该基因全长1 830 bp，编码610个氨基酸，含有一个AP2结构域，预测分子质量67.69 ku；重组蛋白大小约为74 ku，主要以包涵体形式存在，可以被6×HIS标签单抗、鸡抗毒害艾美耳球虫康复血清和鸡抗柔嫩艾美耳球虫康复血清识别；在第3代裂殖子中检测到天然EnApiAP2蛋白，分子质量约为85 ku；EnApiAP2蛋白定位在第2、3代裂殖子细胞核内；第3代裂殖子EnApiAP2转录水平显著高于第2代裂殖子(P<0.01)。成功克隆、表达了EnApiAP2基因，证实该基因表达的蛋白定位在裂殖子的细胞核内，为进一步研究EnApiAP2蛋白的转录因子功能奠定了基础。     

多头带绦虫dUTPase基因的原核表达、组织定位及酶学活性分析

探讨多头带绦虫脱氧尿苷三磷酸酶(Tm-dUTPase)的基因特征,并初步分析Tm-dUTPase的酶学活性。通过原核表达,得到重组Tm-dUTPase蛋白,并对其进行Western blot分析、免疫荧光定位及酶学活性分析。序列分析结果显示,Tm-dUTPase基因ORF框为447bp,编码148个氨基酸,预测的蛋白质分子大小为16.39ku,等电点为6.263;与猪囊尾蚴和豆状囊尾蚴dUTPase基因的氨基酸序列相似性分别为97%和91%。原核表达的TmdUTPase为可溶性蛋白,纯化后的蛋白质质量浓度为0.907mg·mL~(-1),Western blot分析显示,该蛋白质能够被山羊脑多头蚴阳性血清所识别,具有较强的反应原性。免疫荧光定位显示Tm-dUTPase主要分布于多头带绦虫成虫的体内实质区,同时广泛分布于多头带绦虫幼虫(脑多头蚴)的头节和包囊囊壁外层。酶学活性试验测得重组Tm-dUTPase的比活力为986.29U·mg~(-1),EDTA能够抑制Tm-dUTPase活性,而金属离子Mg~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)能够增强Tm-dUTPase活性。上述结果为进一步研究Tm-dUTPase基因的生物学功能奠定了基础。     

捻转血矛线虫HSP60原核表达及特性分析

根据Gen Bank公布的捻转血矛线虫热休克蛋白60(HSP60)基因序列,设计一对特异性引物,以捻转血矛线虫总RNA为模板,通过RTPCR技术扩增出一条约为1 700 bp的DNA片段,将该片段克隆到p MD19-T载体上进行序列分析,结果显示该片段长1 710 bp,编码569个氨基酸。将该基因片段亚克隆到p ET32a(+)载体上,转化大肠杆菌BL21,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE显示,该基因成功表达,其融合蛋白分子量为80.7 ku,主要分布于菌体上清中。Western blot结果显示该重组蛋白可被人工感染捻转血矛线虫山羊血清所识别。Real-time PCR分析显示,HSP60基因在第三期幼虫和活化第三期幼虫中的相对表达量分别为1.0和0.88。本文探讨捻转血矛线虫HSP60功能奠定了基础。     

旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂定位及免疫保护效果评估

探讨旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂(Ts-serpin)的抗原性、定位及免疫保护性。将本实验室前期构建的旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的原核表达载体进行大量表达纯化。利用不同感染时间的猪旋毛虫阳性血清,通过Western blot方法对纯化后的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂(rTs-serpin)进行反应原性鉴定,并制备多克隆抗体,用间接免疫荧光法检测Ts-serpin在旋毛虫肌幼虫中的定位。随后将rTs-serpin免疫小鼠进行免疫保护效果评估。结果显示:rTs-serpin可被不同感染时间的猪旋毛虫阳性血清特异性识别,表明rTsserpin是高反应原性抗原;Western blot结果显示旋毛虫排泄分泌物和旋毛虫虫体粗提取物均存在Ts-serpin,间接免疫荧光显示Tsserpin定位在旋毛虫肌幼虫表皮中;免疫保护试验结果显示rTs-serpin免疫后的小鼠旋毛虫肌幼虫减虫率约为32.2%。综上所述,Tsserpin主要定位在旋毛虫肌幼虫表皮,rTs-serpin具有较强的抗原性,且对小鼠具有免疫保护作用。     

禽流感病毒H5N1亚型NS1蛋白的真核表达及其在细胞中的分布

为构建禽流感病毒(AIV) H5N1亚型非结构蛋白NS1的真核表达载体,并鉴定其在哺乳动物细胞中的表达与分布,本研究采用RT-PCR技术,从甲型流感病毒的总RNA中扩增NS1全长基因,并将其克隆于pXJ40中,构建真核表达载体pXJ40-HA-NSl.将该重组质粒转染293T细胞,通过western blot方法鉴定表达的NS1蛋白;并以免疫荧光技术观察NS1在H1299细胞中的分布与定位.Western blot结果显示NS1基因编码蛋白获得表达,免疫荧光检测显示NS1蛋白主要存在于细胞核中.本研究为NS1蛋白功能和H5N1亚型AIV致病机制的研究奠定了基础.     

捻转血矛线虫ES24抗原基因的克隆与表达特性分析

根据捻转血矛线虫ES24抗原基因序列(U64793.1)设计1对特异性引物,用RT-PCR方法扩增出大小约为670 bp的DNA片段。将该DNA片段克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和分析,结果发现该基因与GenBank中已知的捻转血矛线虫24 ku ES抗原基因的相似性达96%～98%。将该基因的开放阅读框插入pET28a(+)载体中,获得原核表达质粒pET28/ES24,并转化大肠杆菌BL21。重组细菌用IPTG诱导,经SDS-PAGE分析,结果表明该基因获得了表达,重组蛋白分子量大小约为25 ku。用实时荧光定量PCR技术对该基因在捻转血矛线虫的虫卵、第3期幼虫、雌虫和雄虫等不同发育阶段、不同性别虫体内的表达情况进行了定量分析,结果显示ES24基因在雄性成虫中表达量最高,雌虫和虫卵其次,在第3期幼虫中表达最低。     

口蹄疫病毒3C蛋白多克隆抗体的制备与鉴定

扩增口蹄疫病毒(FMDV) 3C蛋白编码基因,将其克隆到原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达; 3C重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,通过ELISA和Western blot检测多克隆抗体的效价和特异性,并将该抗体通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot应用于3C的检测。ELISA结果显示,制备的3C蛋白多克隆抗体效价达1∶256 000; IFA结果显示,该抗体能够检测到3C蛋白在细胞中的定位; Western blot结果显示,该多克隆抗体能够检测到在细胞中过表达的3C蛋白。本研究制备的FMDV 3C蛋白多克隆抗体为FMDV及其3C蛋白的相关研究提供了重要的物质基础。     

猪源T细胞免疫球蛋白黏蛋白域蛋白-1(TIM-1)多克隆抗体制备与鉴定

为了探究猪源T细胞免疫球蛋白黏蛋白域蛋白-1(sTIM-1)的生物学功能,制备sTIM-1多克隆抗体,通过软件分析sTIM-1蛋白抗原表位及亲水性,并设计引物,以sTIM-1基因为模板扩增sTIM-1黏蛋白功能域编码基因(sTIM-1-M),成功构建了重组表达质粒pET28a-sTIM-1-M,并在大肠杆菌Rosetta 2中诱导表达。以纯化的重组蛋白sTIM-1-M与佐剂混合免疫新西兰大白兔制备多抗血清。SDS-PAGE及Western blot证实了该重组蛋白在大肠杆菌中以可溶性形式表达,分子量约为36 kDa。经Western blot与免疫荧光试验(IFA)验证sTIM-1多抗血清可特异性识别293T细胞表达的sTIM-1。免疫沉淀(IP)结果显示制备的多抗血清可与sTIM-1蛋白互作。以上数据表明本研究制备的sTIM-1多克隆抗体具有良好的反应性和特异性。sTIM-1多克隆抗体的制备为进一步研究sTIM-1参与病毒入侵细胞的机制奠定了基础。     

捻转血矛线虫脂肪酶基因表达与生物学特性分析

选取捻转血矛线虫脂肪酶(Lipase)进行基因克隆、表达并对其生物学特性进行探究。PCR克隆捻转血矛线虫lipase基因,构建表达载体,获得融合蛋白质,采用Western blot检测该蛋白质的抗原特性;酯类酶解反应检测该融合蛋白质脂肪酶活性;实时定量PCR检测该基因在捻转血矛线虫不同发育阶段的转录情况;间接免疫荧光试验检验该抗原蛋白质在虫体组织的定位情况。结果表明,去除lipase基因信号肽序列后,基因片段长864bp,融合蛋白质大小50ku;该融合蛋白质在37℃左右、pH为7的条件下酶活力最高;雄性成虫lipase转录量相对虫体其他阶段最高;该抗原蛋白质主要表达于虫体表皮和肠腔。Lipase具有较好的抗原性,可能与捻转血矛线虫发育和宿主免疫调节有关,深入研究捻转血矛线虫Lipase的特性对寻找新的免疫保护性抗原和药物靶标具有意义。     

家蚕类胰凝乳蛋白酶基因的发掘与表达特征分析

类胰凝乳蛋白酶(CTLP)是鳞翅目昆虫幼虫中肠中的主要蛋白酶。基于构建的家蚕中肠等组织差异表达基因的SSH文库,发掘和克隆了一条新的家蚕类胰凝乳蛋白酶基因Ctlp(GenBank登录号:JQ081296)。该基因定位于18号染色体nscaf2901,靠近端粒,有5个外显子和4个内含子,全长cDNA序列976 bp,ORF为840 bp,编码279个氨基酸残基,信号肽序列1～18 aa(分值0.985),1～20 aa和50～100 aa区域为2个由内到外的跨膜螺旋,推测蛋白质相对分子质量为29 780.10,pI为8.75,蛋白质功能域(保守区)和分子进化分析显示其为丝氨酸蛋白酶家族的类胰凝乳蛋白酶。家蚕Ctlp基因具有在5龄幼虫中肠特异性高表达和伴随进食量增加而上调表达的特征,同时也具有性别差异性和熟蚕期特异性上调表达的现象,暗示CTLP可能具有促进消化以外的功能。构建pET32a-ctlp重组表达载体,SDS-PAGE分析和Western blot鉴定结果显示,重组蛋白在原核表达系统中的表达量较低。     

鸭肠炎病毒UL18基因的转录、表达特征及原核表达蛋白的初步应用

为了探讨鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)UL18基因的特性和功能,本研究运用生物信息学软件对DEV UL18基因及其编码蛋白进行了分析。构建原核表达质粒pET32a-UL18,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后获得了大小约为55 000的pET32a/DEV-UL18重组蛋白。将该重组蛋白纯化后免疫家兔,获得了兔抗pET32a/DEV-UL18重组蛋白高免血清。采用荧光定量RT-PCR和Western blot对DEV感染鸭胚成纤维细胞(DEF)后UL18基因的转录和表达情况进行检测,采用间接免疫荧光对DEV感染鸭的肠道和食道进行检测。生物信息学分析结果表明,DEV UL18基因大小969bp,编码1条由322个氨基酸残基组成的多肽,含15个潜在的磷酸化位点和2个N-糖基化位点,含15个潜在的B细胞表位;系统进化树分析表明,DEV UL18属于ɑ-疱疹病毒的1个成员,与MeHV-1亲缘关系最近;密码子偏爱性分析结果表明,若对DEV UL18基因进行外源表达,真核表达系统可能更容易,若选择原核表达系统,则需对宿主表达菌进行选择和条件优化。荧光定量RT-PCR和Western blot结果表明,DEV感染DEF后2h,UL18基因开始转录,感染后12h开始表达,感染24h后转录和表达产物急剧上升,到36和48h后转录和表达产物分别达最大值,之后逐渐下降。间接免疫荧光结果表明,被DEV感染鸭肠道、食道等组织能检测到明显的阳性信号,表明制备的DEV UL18原核表达蛋白及其兔抗多克隆抗体可用于DEV的诊断试剂材料。     

日本血吸虫WD40信号蛋白的原核表达

本研究克隆了编码日本血吸虫WD40信号蛋白的cDNA,并分析了WD40在日本血吸虫不同发育时期的转录情况.同时还利用原核表达系统对该蛋白的部分序列进行了表达,并进行了重组蛋白的纯化和多克隆抗体的制备,Western blot分析表明本研究中获得多克隆抗体可与重组表达的蛋白和血吸虫全虫蛋白裂解物具有特异性反应.本试验结果为进一步研究WD40信号分子的功能奠定了初步基础.     

毒害艾美耳球虫氧化还原酶EnOXIO1的原核表达与定位分析

旨在探析毒害艾美耳球虫氧化还原酶EnOXIO1的功能。提取毒害艾美耳球虫扬州株配子体总RNA,应用RT-PCR获取EnOXIO1编码基因,构建原核表达载体pET-28a(+)-EnOXIO1,转化至大肠杆菌BL21(DE3),体外诱导表达,对重组蛋白进行抗原性分析,应用制备的多抗进行激光共聚焦免疫荧光定位。结果显示,获得的EnOXIO1基因全长为2 535 bp,体外重组表达的蛋白大小约100 ku,主要以包涵体的形式存在,表达量约为0.5 mg·mL^-1。Western blot分析结果显示,该重组蛋白能被6×HIS标签单克隆抗体识别,同时能被制备的鼠多抗以及毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫病鸡康复血清所识别,表明该重组蛋白具有较好的反应原性和交叉反应原性。激光共聚焦免疫荧光定位结果显示,EnOXIO1基因表达产物主要存在于配子体内的成壁体上,参与了卵囊壁的形成。本研究成功克隆和表达了毒害艾美耳球虫EnOXIO1蛋白,并将其定位于配子体和卵囊壁上,为进一步解析EnOXIO1蛋白参与卵囊壁形成的分子机制奠定基础,为研制新型免疫阻断型球虫亚单位疫苗提供重要靶抗原。     

致羔羊脑炎粪肠球菌 XJ05 LuxS 基因的克隆与原核表达

采用 PCR 技术从致羔羊脑炎粪肠球菌 XJ05基因组中扩增得到 LuxS 基因的全序列,对其进行分析,同时与其他细菌相应基因序列及编码的氨基酸进行同源性分析;构建该基因的原核表达载体,对表达蛋白进行鉴定。结果显示,该粪肠球菌 XJ05的 LuxS 基因全长459 bp,编码152个氨基酸,具有功能序列HXXEH,核苷酸同源性与 GenBank 上的枯草芽胞杆菌和粪肠球菌 V583同源性最高,分别为61．2％和100％;构建的重组质粒经诱导后表达分子质量为20 ku 的蛋白质,Western blot 检测显示特异性条带。说明 XJ05的 luxS 基因与肠球菌 V583和枯草芽胞杆菌亲缘关系较近,表达的重组蛋白具有良好的反应原性。     

旋毛虫脱氧核糖核酸酶Ⅱ蛋白的制备及其定位研究

为获得旋毛虫（T1）脱氧核糖核酸酶Ⅱ（DNase Ⅱ）蛋白,观察其在肌幼虫虫体中的分布,以旋毛虫（T1）肌幼虫cDNA为模板,利用RT-PCR技术扩增旋毛虫脱氧核糖核酸酶Ⅱ（TsDNase Ⅱ）蛋白的编码基因tsdnase Ⅱ,将其克隆到原核表达载体pCold-TF中,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,以IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE电泳分析;利用酶联免疫吸附试验（ELISA）及Western blot分析重组Ts DNaseⅡ（rTsDNase Ⅱ）蛋白的反应原性;将rTsDNase Ⅱ蛋白免疫6-8周BALB/c小鼠,制备其多克隆抗体;制作旋毛虫肌幼虫冰冻切片,利用免疫荧光试验观察TsDNase Ⅱ蛋白在虫体中的分布。结果,成功地扩增出了长度为942 bp的旋毛虫tsdnase Ⅱ基因片段,构建了其原核表达质粒pCold-TF-tsdnase Ⅱ;转化了重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)成功可溶表达了rTsDNase Ⅱ,大小为86 kDa;ELISA与Western blot分析结果显示,rTsDNase Ⅱ蛋白能与感染旋毛虫的小鼠血清发生特异性...     

日本血吸虫还原性辅酶I(SjNADH)基因的克隆表达及其免疫保护效果分析

为了评估日本血吸虫还原性辅酶I(SjNADH)在小鼠体内诱导的免疫保护效果,应用PCR获得SjNADH基因片段,其开放阅读框为474 bp,编码157个氨基酸,并在大肠杆菌中成功表达,纯化得到该重组蛋白。Western blot结果显示,SjNADH在日本血吸虫童虫和成虫中的表达量稳定,SjNADH融合蛋白也能被免疫血清识别,具有较好的免疫原性。应用重组蛋白免疫小鼠能诱导产生较高的特异性抗体水平,并诱导了20.13%的减虫率和23.06%的肝脏减卵率。结果表明,获得的SjNADH重组蛋白在小鼠体内诱导产生了部分免疫保护,有作为血吸虫疫苗候选抗原分子的潜力。     

斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj-CPR基因的克隆及原核表达

为了筛选斯氏副柔线虫抗原基因用于血清学诊断和免疫防治研究,对斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj-CPR基因序列进行了生物信息学分析,RT-PCR扩增获得了Pj-CPR基因,构建重组表达质粒pETCPR后,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中并诱导表达获得重组蛋白rCPR。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,重组蛋白rCPR大小为17.6ku,主要以包涵体的形式表达,能与感染斯氏副柔线虫的骆驼血清中IgG特异性结合,具有良好的抗原活性,可用于斯氏副柔线虫病血清学诊断方法和免疫防控研究。     

捻转血矛线虫Hc-TTR-51蛋白的定位及功能

捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是最重要的家畜寄生虫之一。已报道秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)转甲状腺素蛋白(transthyretin,TTR)参与虫体细胞间的相互作用。目前捻转血矛线虫转甲状腺素蛋白(Hc-TTR-51)的定位及功能尚未见报道。研究首先克隆捻转血矛线虫Hc-ttr-51基因,然后分析其蛋白在捻转血矛线虫、HEK 293T细胞内的定位情况,最后RNA干扰Hc-ttr-51基因分析对秀丽隐杆线虫生长发育的影响,从而对其功能进行预测分析。结果表明,捻转血矛线虫Hc-ttr-51基因在虫体各发育阶段均有表达,与其他发育期虫体相比,L1、L3、雄成虫该基因的转录水平显著上升。在L3期虫体体内该蛋白广泛表达,L4期和成虫体内该蛋白特异性表达于性腺。在HEK 293T细胞中,该蛋白在细胞质中呈明显的点状分布。RNA干扰秀丽隐杆线虫Hc-ttr-51基因表达后,虫体产卵量极显著下降,体长体宽显著缩短,咽泵率显著下降。以上研究为捻转血矛线虫生长发育特性、疫苗研究等提供依据。