大口黑鲈鲁氏耶尔森氏菌的分离鉴定、主要毒力基因及致病性研究

为探明2021年3月福建某水库养殖大口黑鲈疾病暴发的原因,实验从患病大口黑鲈肝脏、肾脏、脾脏中分离优势菌,通过人工感染实验确定病原菌,并综合16S rDNA基因序列分析、生理生化和质谱特征等技术对该病原菌进行种属鉴定,同时,进行毒力基因检测、药物敏感性实验以及组织病理学观察。结果显示,从病鱼脾脏中分离获得1株优势菌并鉴定为鲁氏耶尔森氏菌;该菌株对大口黑鲈的半致死剂量为3.8×10⁵ CFU/尾;该菌株携带yrP1、yhl A、yhl B等毒力基因,对恩诺沙星、盐酸多西环素、氟甲喹、硫酸新霉素、氟苯尼考等5种药物相对敏感。组织病理学观察发现,鲁氏耶尔森氏菌的感染造成大口黑鲈肝脏、肾脏、脾脏不同程度的损伤,表现为明显的变性、坏死及炎症细胞的浸润等。本研究首次报道了鲁氏耶尔森氏菌对养殖大口黑鲈的致病性,可为养殖大口黑鲈鲁氏耶尔森氏菌病的诊断和药物防治提供参考依据。     

黑棘鲷内脏结节病病原的分离、鉴定及致病性研究

2017年4月,浙江台州某海水养殖公司跑道式养殖池黑棘鲷大量发病,病鱼活力下降、食欲减退、体表溃疡,剖检可见肝脏、脾脏、肾脏肿大且有不同程度的白色结节,同时伴随大量腹水。用胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)从典型结节病濒死黑棘鲷器官分离到革兰阴性短杆菌。分离病原菌AS15对健康黑棘鲷的致病力结果显示,AS15腹腔注射可使健康黑棘鲷发病死亡,死亡黑棘鲷可出现自然发病症状,在(24±1)°C的条件下,(25±2) g黑棘鲷的半数致死浓度(LD_(50))为6.5×10~4 CFU/尾。经API 20E鉴定,分离菌株AS15生理生化特性与类杀鱼爱德华氏菌LADL05-105和迟缓爱德华氏菌典型菌ATCC15947相似度为86.2%,与杀鱼爱德华氏菌ET~T883的相似度为82.8%;AS15的16S rDNA与杀鱼爱德华氏菌ET~T883同源性达99%,gyrB与类杀鱼爱德华氏菌LADL05-105和杀鱼爱德华氏菌ETT883同源性分别为100%和98%;16S rDNA进化树显示,AS15与ETT883、LADL05-105聚为一簇,gyrB进化树与LADL05-105、NCIM2056聚为一簇;采用4种爱德华氏菌属种特异性引物对AS15进行PCR分析,结果显示,AS15可扩增出类杀鱼爱德华氏菌的种特异性片段,不能扩增出迟缓爱德华氏菌、鲇鱼爱德华氏菌、杀鱼爱德华氏菌的种特异性片段,表明AS15属类杀鱼爱德华氏菌成员。分析了AS15的菌毛基因、sodB等毒力基因,发现AS15具有fimA、fimB、fimC、fimD等4种菌毛基因和sodB、citC、esrB、mukF、katB等毒力基因。本实验首次从黑棘鲷上检出致病性类杀鱼爱德华氏菌,该菌对黑棘鲷的发病机制和毒力机理还需进一步研究。     

一例大口黑鲈混合感染锚头蚤和诺卡氏菌病的诊治

2022年7月天津地区出现一鲈鱼养殖场大口黑鲈(Micropterus salmoides)死亡的情况，死亡率在10%左右。为查明大口黑鲈的死亡原因，对濒死大口黑鲈进行临床解剖、寄生虫检测、细菌分离鉴定和虹彩病毒检测，最后诊断为锚头蚤和鰤鱼诺卡氏菌混合感染。对鱼体使用聚维酮碘进行消毒，氟苯尼考拌喂10 d后大口黑鲈基本恢复正常。     

养殖大菱鲆爱德华氏菌病的研究

2004年5月至2005年9月间,先后对潍坊、烟台、威海和青岛等沿海区域养殖的大菱鲆自然发生的6宗爱德华氏菌感染病例进行了流行病学、病原分离鉴定和组织病理学等方面的调查研究。根据分离菌株的形态、生理生化特性,并结合16S rDNA序列分析,将其鉴定为迟钝爱德华氏菌 (Edwardsiella tarda)。人工感染实验证实该菌为大菱鲆爱德华氏菌病的致病菌。大菱鲆迟钝爱德华氏菌病具有急性和慢性两种感染形式。迟钝爱德华氏菌感染可引起大菱鲆肾脏、脾脏、肝脏、肠、鳃、皮肤等器官组织发生不同程度的病理变化,其显著特点是单核巨噬细胞增生,使得各器官组织出现巨噬细胞浸润现象。病鱼的组织病理变化以肾脏最为明显,包括巨噬细胞大量增生,多发性局灶坏死伴有渗出性炎症反应以及肉芽肿的产生;肾脏外观则显示异常膨大,正常组织转变为白色脓疡或豆腐渣状。本文属国内首次报道爱德华氏菌感染大菱鲆致病,为该鱼类的健康养殖和疾病防治提供参考和依据。 关键词：大菱鲆;迟钝爱德华氏菌;细菌鉴定;组织病理学;16S rDNA     

大口黑鲈致死性结节病病原的分离、鉴定及组织病理学观察

2018年4月四川邛崃地区某养殖场大口黑鲈感染致死性结节病,死亡率高达80%。为明确病因,通过常规微生物分离、鉴定,从患病鱼皮肤溃疡灶、鱼鳔腔积液和肝脏组织中分离到同一株优势菌,命名为HSY-NS02。经菌体形态观察、革兰氏染色和抗酸染色镜检、生理生化实验、16S rDNA序列扩增及系统发育分析和特异性PCR扩增,确定该菌为诺卡氏菌。进一步对健康大口黑鲈进行分离菌的人工感染实验以确定其致病性,结果显示,人工感染鱼出现与自然发病相似症状,且从人工感染鱼体中再次分离到相同菌。组织病理学观察显示,皮肤溃疡灶、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和鳃发生不同程度的慢性炎性肉芽肿病变,其中脾脏病变最为严重。对菌株HSY-NS02进行药物敏感性实验,结果显示,该菌对庆大霉素、新霉素和制霉菌素3种药物敏感,对其他18种药物耐受,呈多重耐药性。     

大口黑鲈源维氏气单胞菌的分离鉴定

为查明2020年春季广东省佛山市某养殖场人工养殖大口黑鲈(Micropterus salmoides)鱼苗出现暴发性死亡的病因,该研究对患病大口黑鲈鱼苗肝脏组织中分离的一株细菌GZXR2020进行了分子鉴定,PCR扩增获得该菌株的16S rRNA基因和gyrB基因全长序列,BLAST显示其与维氏气单胞菌(Aeromon...     

患刺激隐核虫病的真鲷感染迟钝爱德华氏菌的分离与鉴定

2012年8月,福清市东瀚海区网箱养殖真鲷发生大量死亡事件.病鱼除刺激隐核虫病症状外,还出现脾、肾肿大,肝脏充血等.采用生理生化指标鉴定及16S rDNA系列同源性分析和系统发育树构建等方法,对从病鱼肝脏分离获得的优势菌株进行了鉴定,其生理生化指标符合迟钝爱德华氏菌特点,GenBank中同源序列比对结果显示,该菌与迟钝爱德华氏菌的16S rDNA序列同源性高达99％,系统进化树中与迟钝爱德华氏菌自然聚为一支.药敏实验结果表明,该菌对氟苯尼考等10种药物敏感,对链霉素等4种药物中等敏感.     

大菱鲆源杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)的分离鉴定

从患腹水病大菱鲆Scophthalmus maximus的肝脏中分离到一株优势细菌G1,经人工感染实验表明G1为引发大菱鲆腹水病的致病菌,且半致死浓度为LD50=1.21×105 CFU·g-1。采用常规的生理生化鉴定方法及分子生物学方法对G1进行分析,结果表明,G1的16SrRNA基因序列与杀鱼爱德华氏菌Edwardsiella piscicida的同源性达100%,系统发育分析表明菌株G1与杀鱼爱德华氏菌分支聚为一支,结合生理生化鉴定结果确定G1为杀鱼爱德华氏菌。药敏试验表明菌株G1对头孢曲松、环丙氟哌酸、左氧氟沙星等8种抗菌药物高度敏感。     

养殖大菱鲆的爱德华氏菌病

2004年5月至2005年9月间,先后对潍坊、烟台、威海和青岛等沿海区域养殖的大菱鲆自然发生的6宗爱德华氏菌感染病例进行了流行病学、病原分离鉴定和组织病理学等方面的调查研究。根据分离菌株的形态、生理生化特性,并结合16S rDNA序列分析,将其鉴定为迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。人工感染实验证实该菌为大菱鲆爱德华氏菌病的致病菌。大菱鲆迟钝爱德华氏菌病具有急性和慢性两种感染形式。迟钝爱德华氏菌感染可引起大菱鲆肾脏、脾脏、肝脏、肠、鳃、皮肤等器官组织发生不同程度的病理变化,其显著特点是单核巨噬细胞增生,使得各器官组织出现巨噬细胞浸润现象。病鱼的组织病理变化以肾脏最为明显,包括巨噬细胞大量增生,多发性局灶坏死伴有渗出性炎症反应以及肉芽肿的产生;肾脏外观则显示异常膨大,正常组织转变为白色脓疡或豆腐渣状。本文属国内首次报道爱德华氏菌感染大菱鲆致病,为该鱼类的健康养殖和疾病防治提供参考和依据。     

一株黄颡鱼源迟缓爱德华氏菌弱毒株的分离鉴定及特性分析

为探明湖北荆州市某养殖基地患病黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)以烂身、腹水为主要症状且持续性死亡的确切病因，本研究对患病黄颡鱼进行了病原筛查，从患病黄颡鱼组织中分离到一株优势菌，经过形态特征、生理生化鉴定、16S rRNA测序和系统进化分析确定分离菌株为迟缓爱德华氏菌，命名为Et-4。结果显示：分离菌株Et-4具有较强的生物被膜形成能力，不携带esaV、fimA、gadB和katB四种主要的毒力基因。分离菌株Et-4人工感染健康黄颡鱼出现与自然发病类似的症状，并能从病鱼中再次分离出该菌，证实迟缓爱德华氏菌是引起此次黄颡鱼持续性死亡的致病原；分离菌株Et-4对黄颡鱼的LD₅₀为3.9×10⁶ CFU/g,结合毒力基因谱判定其为弱毒株。分离株Et-4携带耐药基因tet A、sulⅠ和add A1,对头孢类药物、庆大霉素、新霉素等敏感；对四环素类、青霉素类、万古菌素等耐药；中药抑菌实验表明乌梅和丁香对迟缓爱德华氏菌Et-4有明显的抑制效果。     

摄食不同饵料的大口黑鲈肠道菌群分析

为了探究投喂冰鲜杂鱼和人工配合饲料对大口黑鲈肠道菌群的影响,本研究采用变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE)对摄食不同饵料的2组鲈鱼肠道内容物的细菌群落结构进行了比较分析.结果显示,冰鲜组与饲料组的大口黑鲈肠道菌群组成相似性较低(相似性24％),且冰鲜组肠道菌群多样性高于饲料组.对2组大口黑鲈中共有条带和特异性条带进一步测序分析显示,2组大口黑鲈肠道共有菌有红螺菌、梭菌、保科爱德华菌、嗜麦芽窄食单胞菌和蓝细菌.冰鲜组大口黑鲈肠道中的特异性菌归属为拟杆菌、肉食杆菌、魏斯氏菌和邻单胞菌;饲料组大口黑鲈肠道中的特异性菌归属为黄杆菌、鲸杆菌、柠檬明串珠菌、缺陷短波单胞菌.研究表明,与投喂冰鲜杂鱼的大口黑鲈相比,人工配合饲料降低了大口黑鲈肠道菌群多样性,也抑制了拟杆菌等有益菌在大口黑鲈肠道内的分布.推测饲料组大口黑鲈生长较慢可能与其肠道菌群中拟杆菌与厚壁菌的比值下降有关.研究结果提示,在今后大口黑鲈养殖或者人工配合饲料研制过程中,添加拟杆菌等益生菌也许可促进大口黑鲈的生长和营养吸收.     

花鲈源杀鱼爱德华菌耐药谱及毒力相关性分析

从广东省珠海市养殖花鲈（基因鉴定出87株杀鱼爱德华菌（）。耐药谱分析显示,杀鱼爱德华菌对利福平（98.85%）、麦迪霉素（96.55%）、红霉素（95.40%）、青霉素（68.96%）、磺胺异恶唑（58.62%）、复方新诺明（28.73%）、阿莫西林（21.83%）、庆大霉素（13.79%）、新霉素（10.34%）、呋喃唑酮（3.45%）、诺氟沙星（2.29%）、氯霉素（2.29%）、多西环素（2.29%）、土霉素（1.15%）、氟苯尼考（1.14%）、恩诺沙星（0%）耐药。杀鱼爱德华菌共有32种耐药谱型且均为多重耐药菌株,多重耐药指数为0.423。斑马鱼致死率结果发现,杀鱼爱德华菌是一株中高毒力菌株;进一步的相关性分析揭示,杀鱼爱德华菌毒力与庆大霉素抗性呈正相关（<0.01）呈负相关。综上所述,花鲈源杀鱼爱德华菌为高毒、多重耐药的菌种,其毒力与耐药性多呈现负相关,推测是由于细菌因获得外源DNA而产生额外的生物成本所致。     

黄颡鱼鲇爱德华氏菌的分离鉴定及其致病性研究

从患头顶溃疡症的黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)内脏组织中分离出致病力强的菌株JZ086,对该菌进行了形态学、生理生化特性的测定,并进行了Biolog全自动微生物分析系统及16S rDNA序列鉴定。结果显示:人工感染实验证实该菌为黄颡鱼的病原菌,其半数致死量(LD50)为1.7×105CFU。Biolog全自动微生物分析系统鉴定结果显示该菌为鲇爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)。16S rDNA序列分析显示该菌与鲇爱德华氏菌的亲缘关系最近,同源性高达99%;系统进化树中与鲇爱德华氏菌(AB050826)自然聚为一支,二者遗传距离约为0.002。鉴定结果确认JZ086为鲇爱德华氏菌。药物敏感性试验结果显示,该菌对所测试的15种药物都敏感,其中对氨苄西林、环丙沙星、左氧氟沙星、妥布霉素等尤其敏感。     

一例黄颡鱼腹水症的诊治

正2019年6月,四川内江一土池养殖的黄颡鱼(已达上市规格)出现群体性死亡,死亡率20%～30%。濒死鱼出现离群、塘边游动、腹部膨大,部分鱼眼球出血、尾部和下颌部充血、出血等症状。经实验室细菌鉴定和人工感染实验,最后确定引起此次黄颡鱼发病的主要病原为杀鱼爱德华氏菌。     

黄唇鱼迟缓爱德华氏菌分离鉴定及药敏分析

2023年入夏以来,东莞市黄唇鱼(Bahaba taipingensis)自然保护区救护基地出现黄唇鱼发病和死亡病例,症状主要为食欲下降,体表发红、充血,眼球突出,角膜白浊溃烂,吻部溃烂;解剖后发现腹腔有大量腹水,肝肿大呈褐色。为确定其病因,针对性制定防治措施,采集死亡病鱼的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠、鳃丝等组织样品。从病死鱼体内分离到一株优势菌株,命名为DG230920,通过对菌株的形态特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列综合分析,鉴定该菌为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。病理组织学检测结果显示,心脏、肝脏、脾脏、肾脏和鳃均有明显的炎症反应,肠出血、黏膜上皮细胞脱落,脾淋巴细胞稀疏、内皮细胞变性坏死,肾小管变性坏死,鳃见鳃丝脱落、出血。对分离菌株进行药敏分析,结果为对环丙沙星、左氧氟沙星高度敏感,最低抑菌质量浓度仅≤0.25 mg·mL^-1;其次是厄他培南,最低抑菌质量浓度≤0.5 mg·mL^-1。结果表明,黄唇鱼发病原因可能是迟缓爱德华氏菌感染,分离菌株遗传序列稳定,对临床使用的抗菌药物均为敏感。研究提示,...     

[鱼师]诺卡菌特异性PCR快速检测方法的建立

[鱼师]诺卡菌（Nocardia seriolae）是危害中国南方大口黑鲈（Micropterus salmoides）养殖业的主要病原之一,由于该菌在培养基上生长缓慢,对其分离鉴定造成诸多不便。文章根据[鱼师]诺卡菌16S-23S转录间隔区（ITS）序列设计特异性引物建立了[鱼师]诺卡菌特异性PCR快速检测方法。试验结果表明,利用设计的特异性PCR引物只能扩增出[鱼师]诺卡菌特异性片段,检出限为5pg模板DNA。在此基础上研制了PCR快速检测试剂盒并对[鱼师]诺卡菌人工感染的大口黑鲈组织进行了检测,结果显示该试剂盒能从未出现明显发病症状的大口黑鲈组织中检出阳性片段,阳性率为100％,比传统细菌分离鉴定方法更加灵敏、快速且高效,具有较好的应用前景。     

中华鳖爱德华菌病病原菌的分离鉴定及致病因子研究

采用API 20E系列生化鉴定及16S rDNA和gyrB基因序列同源性分析方法,对从患病中华鳖(Trionyx sinen-sis)肝脏中分离到的一株细菌TL5m进行了鉴定,并通过人工感染试验,对该菌株进行了毒力检测;此外分别提取该TL5m株的主要致病因子外膜蛋白、脂多糖和胞外产物,对中华鳖进行毒力和免疫保护率试验。结果显示:菌株TL5m的API 20E鉴定编码为4544000,99.9%为迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda);其16SrDNA序列和gyrB基因序列(GenBank登录号分别:EF121756和GU563803)与迟钝爱德华氏菌的同源性最高(分别为94%和98%);菌株TL5m对中华鳖的半数致死量LD50为2.45×106 CFU/ind。药敏感结果显示菌株对磷霉素、菌必治、头孢孟多、头孢噻吩、壮观霉素高度敏感。外膜蛋白攻毒剂量60μg/ind和脂多糖攻毒剂量400μg/ind时,对中华鳖的致死率都为33.3%,胞外产物对中华鳖的LD50为31.73μg/ind;全菌灭活苗、胞外产物、外膜蛋白和脂多糖的免疫保护率分别为75%、62.5%、25%和87.5%。结果表明,发病中华鳖的病原菌为迟钝爱德华氏菌,其分泌的胞外产物对中华鳖具有较高毒力;提取的脂多糖对中华鳖遭受迟钝爱德华氏菌攻击具有较高免疫保护率。     

大口黑鲈源鳗弧菌的分离鉴定

为探明引起大口黑鲈(Micropterus salmoides)体表及内脏出血病的病原，本研究从发病大口黑鲈肝、脾、肾处分离病原，得到1株形态一致的优势菌株2004301,采用腹腔注射方式进行人工回感实验，证实菌株2004301能够引起养殖大口黑鲈内脏出血症状并死亡，且具有较强毒力。综合形态学观察、生理生化特性分析、基于16S rRNA基因和hsp 60基因构建的系统发育树及特异性基因检测结果，将菌株2004301鉴定为鳗弧菌(Vibrio anguillarum)。菌株2004301对32种药物的敏感实验证实其对恩诺沙星、氟苯尼考、磺胺甲恶唑、环丙沙星、氧氟沙星等抗菌药物敏感。     

盐度对大口黑鲈幼鱼生长性能、肌肉品质及抗氧化能力的影响

为探讨盐度对大口黑鲈(Micropterus salmoides)幼鱼生长性能、肌肉品质和抗氧化能力的影响，分别在淡水、3、6、9、12的盐度梯度下养殖体长为(6.24±0.39) cm、体质量为(5.42±0.58) g的大口黑鲈幼鱼49 d,统计其存活、生长及摄食情况，测定各盐度下大口黑鲈幼鱼肌肉组织的营养成分和大口黑鲈幼鱼肝脏、肾脏、鳃组织中超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活力。结果显示：(1)各盐度组大口黑鲈幼鱼成活率均为100%;体长、体质量、增长率、特定生长率和摄食率随盐度的升高均表现出逐渐降低的趋势，饵料系数则表现出逐渐升高的趋势。(2)盐度对大口黑鲈幼鱼水分、粗蛋白和灰分的影响不显著；粗脂肪含量差异明显，且盐度越高粗脂肪含量越低。随着盐度的升高，肌肉中各必需氨基酸质量分数、总量、鲜味氨基酸含量及必需氨基酸指数均呈现先增高后降低的趋势。(3)肝脏中SOD活性随盐度的增加先降低后升高，肾脏中SOD活性随盐度的增加先升高后降低；盐度12组幼鱼肝脏中的CAT显著高于其他盐度组，肾脏和鳃组织中CAT活性很低。大口黑鲈在盐度12以下的水环境中可以存活生长，在盐度6以...     

大口黑鲈肝脾肿大病病原研究

为了查明2009年10月广东省佛山地区养殖大口黑鲈(Micropterus salmoides)中暴发的传染性疾病的病原,对病鱼的肝脏、脾脏和腹隔膜进行切片电镜观察,发现细胞质中有大量病毒颗粒,切面为六角形,直径约145～150 nm,病毒为二十面体对称结构、无囊膜、似虹彩病毒的病毒粒子.用除菌的病鱼组织滤液感染健康大口黑鲈,被感染鱼死亡率达90%以上.根据已知虹彩病毒主要衣壳蛋白(MCP)基因序列设计特异引物,提取人工感染发病鱼的肝脏、脾脏、肾脏组织的DNA进行PCR扩增,将扩增片段进行序列测定与分析,结果表明该序列与已报道的鳜(Siniperca chuatsi)传染性脾肾坏死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus,ISKNV)MCP基因同源性为98%.电镜观察和MCP基因测序分析结果显示,该病毒的分类地位为虹彩病毒科(Iridoviridae)细胞肿大病毒属(Megalocytivirus).