油菜茎基溃疡病菌的实时荧光PCR检测

 根据油菜茎基溃疡病菌Leptosphaeria maculans与其近似种ITS序列的差异,设计了检测L. maculans的引物Lmb3/R2和探针Probe-M,建立了L. maculans的实时荧光PCR检测方法。试验结果表明,来自加拿大、澳大利亚和乌克兰等国的22株L. maculans菌株都能得到阳性扩增,而供试的30株L. biglobosa菌株和6株其他菌株以及空白对照没有荧光信号的增加。该检测方法的灵敏度达到4 pg菌丝DNA,整个检测过程控制在4 h内,其快速、特异和灵敏的特点可以满足进境油菜籽样品的快速初检以及病菌分离物的快速鉴定。     

猕猴桃果腐病菌PCR和实时荧光PCR检测

为了快速、准确地鉴定猕猴桃果腐病菌(Neofabraea actinidiae),根据GenBank中N. actinidiae的β-tubulin序列设计特异引物NAC-F/R和探针NAC-P,建立了常规PCR和实时荧光PCR检测方法。利用引物NAC-F/R扩增供试的4株N. actinidiae能得到389 bp的预期目标条带,但扩增其他20个非N. actinidiae供试菌株不能得到预期产物,检测灵敏度为140 pg菌丝体DNA;探针NAC-P对供试4株N. actinidiae表现为阳性扩增,而对其他菌株和空白对照均表现为阴性扩增,检测灵敏度可达14 pg菌丝体DNA,比常规PCR高10倍。样品检测试验结果表明两种PCR方法可用于口岸植物检疫中快速、准确地检测猕猴桃果腐病菌。     

大豆南方茎溃疡病菌PCR检测方法的建立

大豆南方茎溃疡病是一种世界上危害严重的大豆病害,其病原菌（Diaporthe aspalathi）被列入我国进境植物检疫性有害生物名录。本文基于ITS序列差异设计引物和探针,建立了D. aspalathi常规PCR和荧光PCR检测方法。测试结果表明,常规PCR引物DM-F/DM-R3扩增33个供试菌株,6个D. aspalathi菌株出现394 bp的预期扩增条带,其余供试菌株均无目的条带,检测灵敏度为5 pg菌丝体DNA。探针DM-Pro仅对6个D. aspalathi菌株表现为阳性,其余供试菌株均为阴性,检测灵敏度为500 fg菌丝体DNA。同时,采用这两种方法对进境大豆种子及植株残体等样品进行了验证。以上结果表明,这两种检测方法具有快速、准确、灵敏等优点,可应用于口岸对大豆南方茎溃疡病菌的检疫鉴定及疫情监测。     

丁香疫霉病菌PCR和实时荧光PCR检测

 为了快速、准确地检测丁香疫霉病菌 (Phytophthora syringae, PSY),根据GeneBank中PSY的ITS序列设计特异引物Psy1/Psy2和探针P-Psy,建立了常规PCR和实时荧光PCR检测方法。利用引物Psy1/Psy2扩增供试的26株PSY能得到585 bp的预期目标条带,但扩增其它61个非PSY供试菌株不能得到预期产物,检测灵敏度为12 pg菌丝DNA;探针P-Psy对供试26株PSY表现为阳性扩增,而对其它菌株和空白对照均表现为阴性扩增,检测灵敏度可达120 fg菌丝DNA,比常规PCR高100倍;引物Psy1/Psy2和探针P-Psy对5 g土壤中PSY卵孢子的检测灵敏度分别为20 000个和200个。样品检测试验表明两种PCR方法可用于口岸植物检疫中快速、准确和特异地检测丁香疫霉病菌。     

进境玉米中玉米内州萎蔫病菌PCR检测方法评估

为了准确检测玉米样品中玉米内州萎蔫病菌（Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis,Cmn）,减少测试过程中的假阳性和假阴性结果,利用15对Cmn特异性引物/探针分别测试了Cmn及其他菌株63株,并测试了食用、种用和饲用进境玉米样品300个。测试结果表明,常规PCR和实时荧光PCR方法阳性检出率最高的引物/探针分别是引物PSA-7/PSA-R和探针Cmn-MGB;巢式PCR不适用于样品中Cmn的检测;检测过程中引物Cmn-4F/Cmn-4R和探针rpsJ27P出现假阴性,引物CmnFP/CmnRP出现假阳性。根据测试结果,引物PSA-7/PSA-R和探针Cmn11-P可用于口岸进境玉米样品Cmn检测。     

应用实时荧光PCR检测苹果果实球壳孢腐烂病菌

根据苹果果实球壳孢腐烂病菌(Sphaeropsis pyriputrescens Xiao&J.D.Rogers)ITS区序列设计特异性引物和TaqMan荧光探针,建立了苹果果实球壳孢腐烂病菌的实时荧光PCR检测方法。该方法能够特异性检测苹果果实球壳孢腐烂病菌,供试的目标菌株检测结果为阳性,而苹果轮纹病菌、苹果炭疽病菌、苹果干腐病菌和苹果褐腐病菌、苹果腐烂病菌等5种对照菌株检测结果为阴性。该方法具有快速、简便、准确的优点,适合于该病害的快速诊断和口岸检验检疫运用。     

进境玉米中玉米内州萎蔫病菌的PCR检测

 为了快速准确检测进境玉米样品中的玉米内州萎蔫病菌Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis(Cmn), 根据GenBank中Cmn的16S-23S序列设计引物CM1/CM4和引物PSM1/CM3。引物PSM1/CM3仅能从供试的4株Cmn菌株中扩增获得208 bp的预期产物, 而其他36株对照菌株均不能扩增出预期条带。灵敏度测试结果表明引物CM1/CM4和PSM1/CM3组合的巢式PCR方法的检测灵敏度高于常规PCR, 检测灵敏度可达40 fg DNA或6.8 CFU目标细菌。常规PCR和巢式PCR方法对进境美国玉米样品的阳性检出率分别为8%和24%, 试验结果表明所建立的PCR方法可用于玉米样品中Cmn的快速检测。     

不同引物PCR检测向日葵黑茎病菌的灵敏度比较及应用

为准确快速筛查进境油葵种子中携带的向日葵黑茎病菌Plenodomus lindquistii,采用常规PCR方法比较了3对向日葵黑茎病菌PCR检测引物320FOR/320RVE、LEPB/LEPF和LLF/LLR的灵敏度,对哈萨克斯坦进境120批油葵种子样品进行PCR检测,并对检测为阳性的样品进行产物序列测定及病原菌分离。结果显示,引物320FOR/320RVE的检测灵敏度最高,可达10-5ng/μL,引物LEPB/LEPF和LLF/LLR分别为10-4ng/μL和10-3ng/μL。利用引物320FOR/320RVE、LEPB/LEPF和LLF/LLR对120批进境油葵种子样品进行检测,阳性检出率分别为65%、50%和45%,阳性检出率高低与引物的检测灵敏度相一致。阳性样品扩增的产物序列与Gen Bank中向日葵黑茎病菌的序列同源性最高;分离的病原菌菌落为乳白色至灰白色,分生孢子器黑褐色、球形并产生透明状分生孢子液,分生孢子单胞、无色、肾型、两端有油球,与已报道的向日葵黑茎病菌的病原特征描述一致,初步鉴定哈萨克斯坦进境油葵种子中存在向日葵黑茎病菌。     

进境哈萨克斯坦油葵中向日葵黑茎病菌的检疫鉴定

依据出入境检验检疫行业标准SN/T 3174-2012,对新疆口岸进境的哈萨克斯坦油葵中的向日葵黑茎病菌进行检疫鉴定。挑取油葵样品中的可疑病种子和植株残体作为实验材料,分别提取其DNA,用向日葵黑茎病菌特异性检测引物LEPB/LEPF对挑取的样品进行PCR检测初筛,初筛结果阳性者,进行病原分离培养。对分离获得的阳性纯培养菌株的菌落、孢子形态进行观察,PCR检测及致病性测定,最终确定其为向日葵黑茎病菌。本研究从进境哈萨克斯坦油葵中分离到检疫性病原菌,新疆周边口岸应进一步加强疫情监测与调查。     

水稻细菌性条斑病菌和白叶枯病菌数字PCR检测方法的建立

基于水稻细菌性条斑病菌的假定膜蛋白基因和水稻白叶枯病菌的rhs家族基因分别设计引物和探针,建立了这两种病菌的数字PCR检测技术。特异性测试结果显示,两种检测方法均可特异性检测到目标病菌的供试菌株,而其他对照菌和空白对照均为阴性。两种检测方法对目标菌的检测下限分别达到了9个和16个拷贝/反应,且成功检测到人工模拟带菌及自然带菌种子样品中的病菌。     

兰花褐斑病菌实时荧光PCR检测

兰花褐斑病菌(Acidovorax avenaesubsp.cattleyae)是兰花上一种重要进境检疫性有害生物,可通过植株和种子远距离传播,其传染性强,对兰花危害性大。根据核糖体ITS序列设计了TaqMan-MGB探针并建立了实时荧光PCR检测方法。该方法能够特异性检测兰花褐斑病菌,所有供试的目标菌株检测结果均为阳性,而其它28个对照菌株(含同属内其它种及avenae种下其它亚种)均为阴性。利用该方法从发病兰花植株总DNA中检测到该病菌。本方法灵敏度高,检测极限达9×10-9μg DNA,操作方便快速,结果可靠,适合于口岸兰花的进出境检疫及兰花种苗健康质量控制。     

玉米细菌性枯萎病菌PCR检测

 根据GenBank中玉米细菌性枯萎病菌及其近似种的16S序列差异,设计了一对玉米细菌性枯萎病菌特异性引物Ps2r/Ps3r,该引物能从供试的7株玉米细菌性枯萎病菌中特异性扩增出一条268 bp的预期条带,供试的32株近似种菌株都没有扩增产物;与国内外文献报道的其它5对特异性引物相比,除引物PSA/PSB外,引物DEP1/DEP2、ES16/ESIG2c、HRP1d/HRP3c和CPSL1/CPSR2c在不同程度上对部分近似种菌株出现了扩增。试验结果表明,引物Ps2r/Ps3r和PSA/PSB能特异性扩增玉米细菌性枯萎病菌,得到预期的扩增产物。对不同系列稀释度的DNA和玉米样品中病菌的检测结果表明,由引物Ps1/Ps4和Ps2r/Ps3r组合的巢式PCR方法的检测灵敏度高于引物ITSA/ITSB和PSA/PSB组合的巢式PCR方法,也高于Bio-PCR检测方法;前者可以检测到玉米种子中300 cfu/sample的目的细菌,该检测方法在进境玉米种子样品玉米细菌性枯萎病菌的检疫中具有比较理想的应有潜力和推广价值。     

利用TaqMan探针检测水稻细菌性谷枯病菌

利用TaqMan探针建立了水稻细菌性谷枯病菌(Burkholderia glumae)实时荧光PCR检测方法。根据水稻细菌性谷枯病菌gyrB基因,设计并合成特异性引物和探针,对8株不同来源水稻细菌性谷枯病菌和其他同属或同寄主的参试菌株进行了检测。结果显示,该方法检测的特异性强,灵敏度可达菌悬液浓度102cfu/mL,该方法快速、简便、准确,适用于出入境检验检疫及种子健康检测领域。利用该方法对国内采集的83份水稻材料进行了检查,未发现阳性结果。     

美国进境樱桃果实中梨火疫病菌的检测

为了筛选快速、灵敏的梨火疫病菌检测方法,利用常规PCR、套式PCR和实时荧光PCR方法分别对美国进境的326批樱桃果实中梨火疫病菌进行检测。结果显示,3种PCR方法的检出率不同,不同引物或探针的检出率也存在差异。在常规PCR中,引物Ams3/Ams4c、P29A/P29B和PEANT1/PEANT2的检出率分别为35.28%、24.85%和16.87%;单管套式PCR和套式PCR的检出率分别为23.01%和50.61%;4种实时荧光PCR的检出率分别为17.48%(探针PA)、32.21%(探针Ams)、29.14%(探针ITS)和23.93%(SYBR GreenⅠ)。在所有试验方法中由引物P29A/P29B和PEANT1/PEANT2组成的套式PCR的检出率最高。检测结果证实了进境樱桃果实中存在梨火疫病菌DNA,套式PCR和常规PCR(引物Ams3/4c)可用于进境樱桃样品中梨火疫病菌的常规检测。     

兰花褐斑病菌可视化基因芯片检测技术

兰花褐斑病菌(Acidovorax cattleyae,Ac)是一种严重为害兰花的检疫性有害生物。根据Lep A基因序列设计特异性引物和探针,利用可视化基因芯片技术,建立了Ac的基因芯片检测方法。测试结果显示,供试的3株兰花褐斑病菌菌株均为阳性,其他19株对照菌株为阴性。菌体DNA的检测灵敏度可达到450 fg,是常规PCR的100倍;人工模拟感染兰花样品的检测灵敏度为1.6×10~3 CFU。可视化基因芯片检测技术的强特异性,高灵敏度,易操作性和低成本特点适合口岸一线和基层实验室开展兰花褐斑病菌的快速检测。     

基于TaqMan MGB探针的可可花瘿病菌快速检测方法

可可花瘿病菌是一种我国进境植物检疫性真菌?本文根据可可花瘿病菌EF1α基因的保守序列, 设计并合成1对特异性的实时荧光PCR引物和1条TaqMan MGB探针, 建立了可可花瘿病菌的实时荧光PCR检测方法?特异性试验结果表明, 该检测方法能够特异性检出可可花瘿病菌; 实时荧光PCR优化反应条件为引物终浓度0.2 μmol/L, 探针终浓度0.6 μmol/L; 灵敏度试验结果表明, 20 μL反应体系中可可花瘿病菌DNA含量最低检测限为10 pg; 重复性试验结果表明, 该检测方法的重复性和稳定性良好; 接种试验样品检测结果表明, 该方法可用于疑似携带可可花瘿病菌样品的检测与初筛?本文建立的方法具有良好的灵敏性?特异性和应用性, 为可可花瘿病菌早期快速检测提供了一种有效手段?     

TaqMan探针实时荧光PCR快速检测苹果牛眼果腐病菌方法的建立

苹果牛眼果腐病菌(Neofabraea malicorticis、N.perennans、N.alba和N.kienholzii)是我国检疫性植物病原真菌,为建立该病菌的实时荧光PCR检测法,根据病菌及其近缘种的翻译延伸因子(EF-1α)的保守序列设计了特异性探针,分别以苹果牛眼果腐病菌菌株和本研究构建的EF-1α重组质粒DNA为阳性标准品检验探针的特异性和灵敏度。结果显示探针MAL-P、PER-P、ALB-P和KIE-P分别对N.malicorticis、N.perennans、N.alba和N.kienholzii表现特异性阳性扩增,而与近缘种及其他常见的果腐病菌无交叉反应,单重探针和4种探针混合液的灵敏度分别达1 fg/μL和10 fg/μL DNA。总计从美国、智利、新西兰、法国进境截获的29批可疑病果的分离物中检测到PCR阳性荧光信号,包括20批N.perennans、8批N.alba和1批N.kienholzii。该方法在6 h内即可完成整个检测流程,其特异性强、灵敏度高,适用于实际样品中苹果牛眼果腐病菌的快速检测。     

实时荧光PCR检测瓜炭疽病菌

采用实时荧光PCR技术建立了瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)的检测方法。根据瓜炭疽病菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因序列,设计了该病菌特异性引物和TaqMan探针,并对所设计的引物和探针的反应条件进行了优化。采用本试验建立的实时荧光PCR方法对瓜上的其他菌株及近似菌株进行检测,可将瓜炭疽病菌与其他病原菌区分开。灵敏度试验表明,25μL体系中只要有39.6pg的核酸量就可以被检测到,检测灵敏度达到1.584pg/μL,比普通PCR检测灵敏度高100倍。同时对田间采集的病株和未知样品进行的检测证明了引物和TaqMan探针的特异性。     

向日葵黑茎病菌TaqMan-MGB探针实时荧光快速检测方法

 向日葵黑茎病菌是我国进境检疫性有害生物名录中的一种检疫性真菌。根据向日葵黑茎病菌及其近似种的ITS序列差异,设计并合成特异性引物和探针,建立了向日葵黑茎病菌的实时荧光PCR检测方法。特异性试验结果表明,该检测方法能特异性检测向日葵黑茎病菌;灵敏度试验结果表明,最低检测限量为20 μL反应体系中总DNA含量0.1 pg;实时荧光PCR优化反应条件为引物终浓度0.6 μmol·L^-1,探针终浓度0.3 μmol·L^-1。实际样品检测结果表明,该方法可用于疑似携带向日葵黑茎病菌样品的检测与初筛。此方法快速、灵敏,整个反应过程约1 h,检测过程完全闭管,无需PCR后续处理,为早期快速检测向日葵黑茎病菌提供了重要参考。     

利用实时荧光PCR技术检测风信子黄腐病菌

风信子黄腐病菌是我国禁止入境的病原细菌之一,我国目前尚无该病的发病报道.本研究根据风信子黄腐病菌基因组16S-23S ribosomal RNA intergenic spacer保守序列,设计并合成了1对特异性引物和1条具有稳定点突变特异性探针进行实时荧光PCR检测,风信子黄腐病菌有很强的荧光信号,供试的其它7种病原细菌菌株均没有荧光产生.与常规PCR相比,实时荧光PCR检测特异性强,灵敏度高,适合病害的快速诊断和口岸检验检疫应用.经优化反应条件,建立了稳定的风信子黄腐病菌实时荧光PCR检测方法.