感染鸡胚的鸭肝炎病毒适应毒株的筛选试验

自Levine等（1950）首次于鸡胚中分离到鸭肝炎病毒（DHV）以来．在感染鸡胚上进行的血清中和试验在鸭病毒性肝炎的诊断上得到了广泛应用，并被公认为权威的诊断方法，虽然近几年发展而成的琼扩、间接血凝、ELISA等方法逐渐取代了繁琐、费时的中和试验，但由于DHV细胞培养上的难度，鸡旺接种在DHV的增殖等方面仍有切实的应用价值。为了更有效地便于实验观察及收获病毒，我们对DHV的鸡胚适应毒株进行了筛选、比较，以寻找最适鸡胚毒株。1材料与方法1．1材料111试验用毒林：QI弱毒株、ATCC（Cg／DZ）标准毒株、E52。疫苗毒株，由南…     

鸭肝炎病毒A66弱毒株在鸡胚成纤维细胞上的培养：张小飞

将鸡胚致弱的鸭肝炎病毒（ＤＨＶ）Ａ６６侏接种于鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）进行细胞培养,通过对细胞培养物进行病毒滴度测定、鸡胚中和试验和电镜检查,证明了ＤＨＶＡ６６毒株能够在ＣＥＦ上增殖。试验还表明,犊牛血清对ＤＨＶ增殖具有明显的抑制作用。此外,还根据细胞培养物病毒滴度毒滴度测定结果绘制出了病毒在ＣＥＦ上的生长曲线。     

鸭肝炎病毒A66弱毒株在鸡胚成纤维细胞上的培养

将鸡胚致弱的鸭肝炎病毒 ( DH V) A6 6 株接种于鸡胚成纤维细胞 ( CEF)进行细胞培养 ,通过对细胞培养物进行病毒滴度测定、鸡胚中和试验和电镜检查 ,证明了 DHV A6 6 毒株能够在 CEF上增殖。试验还表明 ,犊牛血清对 DH V增殖具有明显的抑制作用。此外 ,还根据细胞培养物病毒滴度测定结果绘制出了病毒在 CEF上的生长曲线。     

禽波氏杆菌鸡胚强毒株对雏鸡的致病性

以从孵化场将出壳鸡胚中分离到的鸡胚强毒株禽波氏杆菌LL09作为试验菌株,分别经鼻腔、眼睛和腹腔3种感染方式和1,7,14,21d不同日龄感染海蓝褐蛋雏鸡,检测其致病过程、病理变化,以及LL09在不同感染方式和不同感染日龄对雏鸡的生长抑制和NDV灭活苗免疫后HI抗体水平的影响差异。结果发现:LL09能引起雏鸡眼睛分泌物增多,咳嗽等呼吸道症状,且能入侵内脏组织,导致气管黏膜纤毛细胞脱落,肺出血,心肌细胞、肝细胞、脾细胞、肾小管上皮细胞等变性坏死等病理变化。3种感染方式中以腹腔感染危害最为严重,入侵内脏组织的比例最高,对雏鸡的生长抑制作用最强,对NDV免疫后HI抗体水平的影响最大,其次是经鼻腔感染组和经眼睛感染组。LL09分别于不同日龄感染雏鸡结果发现,感染日龄与LL09对雏鸡的危害直接相关,越早期感染,对雏鸡的体质量抑制越严重,对NDV免疫后的HI抗体水平的影响越大,内脏组织的感染几率越高。尤其是1d和7d感染组危害比较严重,而21d感染雏鸡症状不明显,且未在除气管和肺脏以外的内脏组织中检测到LL09的感染。对禽波氏杆菌LL09鸡胚强毒株的致病性检测结果表明,LL09作为鸡胚分离株,同样可以导致禽类的呼吸道感染,且能入侵内脏组织,以腹腔感染和1周内感染的危害最为严重。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒鸡胚致弱毒株的选育

将分离的一株DHv—Ⅰ野毒株经鸡胚传代,培育出DHV—Ⅰ的80代鸡胚致弱毒GFS99株。该弱毒株对1日龄雏鸭无致病性;在雏鸭体内连续盲传5代,也未出现毒力返强现象;1日龄雏鸭免疫100倍稀释的尿囊液弱毒GFS99后7天攻强毒GQY07株,保护率高达100％,且7日龄时即可产生高峰期中和抗体,后抗体效价有所下降,但易感期的3周内抗体保持较高水平;另外该弱毒的外源病原检验结果均为阴性和特异性实验结果良好。综上述结果表明,该弱毒GFS99株无外源病毒污染、特异性强、安全性好、遗传性稳定、免疫原性强,可以作为制备DHV—Ⅰ弱毒疫苗的候选株。     

鸭甲型肝炎病毒二价卵黄抗体(1型+3型)不同时间的治疗效果评估

将1型鸭甲型肝炎病毒RPVA1901-Z株、3型鸭甲型肝炎病毒RPVA1902-Z株分别人工感染4日龄健康易感雏鸭,在攻毒后4 h、8 h、12 h、18 h和24 h分别皮下注射鸭甲型肝炎病毒二价卵黄抗体（1型+3型）进行治疗。结果表明,攻毒后4～8 h治疗,治愈率100%,攻毒后12 h治疗,治愈率70%～80%,攻毒后18h治疗,治愈率24.9%～50%,攻毒后24 h治疗,治愈率7.7%～23.5%;攻毒对照死亡率90%～100%;健康对照组100%存活。感染后越早免疫,治疗效果越佳。     

血清3型鸭甲型肝炎病毒阳性血清的制备

通过使用血清3型鸭甲型肝炎疫苗免疫SPF鸡,制备了一批血清3型鸭甲型肝炎诊断用阳性血清,并对其进行了无菌、支原体和特异性检验以及中和效价测定。结果表明,该血清无菌检验合格,无支原体污染,特异性良好,无禽类常见13种外源病毒抗体,血清中和效价为10-2.8。本研究为鸭甲型肝炎病毒血清学鉴定及相关研究提供了重要的物质基础。     

鸭肝炎病毒Ⅰ型的分离及其鸡胚适应性

鸭病毒性肝炎(duckviralhepatitis-Ⅰ．DVH—Ⅰ)1945年首次发现于美国的长岛。1953年起蔓延至世界各地．是小鸭的一种急性致死性传染病。该病的特征是发病急．传播迅速．死亡率高．主要感染5周龄以内的小鸭．以2周龄内的雏鸭最易感．对新生鸭的发病率高达100％．死亡率90％以上。近几年来．该病在浙江省养鸭地区的发生率呈上升趋势。现将鸭肝炎病毒Ⅰ型的分离及其鸡胚适应性的试验结果介绍如下。     

1株基因3型鸭甲肝病毒鸡胚化弱毒株的培育

为研发基因3型鸭甲肝病毒(Duckhepatitis virustype3,DHAV-3)的弱毒活疫苗,用SPF鸡胚对DHAV-3Y株进行了连续传代致弱,由此获得第80代鸡胚适应毒。致病性试验结果显示,第80代毒株对1日龄雏鸭已无致病性。免疫攻毒保护试验显示,雏鸭在1日龄时经肌肉注射途径免疫第80代鸡胚适应毒,能有效抵抗7日龄时的强毒感染,保护指数为100%。表明第80代鸡胚适应毒是一株具有良好免疫原性的鸡胚化弱毒疫苗候选株。     

芒果苷抗DHAV-1致鸭胚肝细胞炎性损伤的研究

【目的】探究芒果苷(mangiferin, Man)对鸭甲型肝炎病毒1型(Duck hepatitis A virus-1,DHAV-1)致鸭胚肝细胞(DEHCs)炎性损伤的影响。【方法】从14日龄SPF级麻鸭鸭胚肝脏组织分离原代DEHCs,用含不同浓度芒果苷(0、5、10、20、40、80和160μmol/L)的培养液培养48 h后,通过CCK-8法检测其安全浓度范围;用安全浓度的芒果苷培养DEHCs 12、24和48 h后,检测培养液上清中乳酸脱氢酶(LDH)的活力,判定芒果苷对DEHCs的毒性作用。将DEHCs分为对照组(Mock)、模型组(Model)、芒果苷组(Man10、Man20和Man40)和利巴韦林组(Rib),每组3个重复,所有组细胞血清饥饿培养12 h后,Mock组加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基,Model、Man10、Man20、Man40和Rib组用DHAV-1(MOI=1.0)攻毒2 h后,Model组更换为含10%FBS的DMEM培养基,Man10、Man20、Man40培养基中分别添加10、20和40μmol/L芒果苷,Rib组添加1μm...     

适应Vero细胞传染性腔上囊病毒X毒株对鸡胚的致病性试验

适应Ｖｅｒｏ细胞传染性腔上囊病毒（ＩＢＤＶ）Ｘ毒株,通过对鸡胚的致死作用、病理变化的结果表明,ＩＢＤＶ Ｘ毒株在Ｖｅｒｏ细胞上传代后,各试验代次毒株均能适应鸡胚,并引起鸡胚死亡,对鸡胚的致病性随传代次数的增加而减弱。     

中药复方制剂鸡胚内抗鸭肝炎病毒试验

采用鸡胚培养法和琼脂扩散试验测定了2种中药复方制剂对鸭肝炎病毒的抑制作用。结果表明,2种中药复方制剂对鸡胚毒副作用较小,在药物与病毒同时接种情况下,能抑制鸭肝炎病毒在鸡胚中的增殖。     

鸡传染性法氏囊病野毒株的分离鉴定及河北弱毒株培育的研究

从河北省６个地区鸡传染性法氏囊病（ＩＢＤ）的鸡群中，分离到６株强毒，均能使易感鸡３６小时发病并死亡，发病率达６０～１００％，死亡率１０～７０％。人工感染鸡能见到与野外病例相同的病变。经血清学试验、鸡胚接种、电镜观察均证明，分离物为传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ），其中有的毒株，毒力非常强。利用其中毒力最强的１株病毒，经鸡胚多次传代培养育成１株免疫原性好，免疫期长，免疫效果容易监测的弱毒株，经野外试验证明，该毒株是防治ＩＢＤ的一个很理想的毒株。     

IBDV不同野毒株鸡胚传代及各变异代次回归鸡后的致病性

对分离于河南省的YX08、YX12、YB02等3个传染性法氏囊病毒（IBDV）野毒株进行了鸡胚适应性培育,对各代病毒进行了生物学试验,并对其VP2高变区基因进行了RT-PCR扩增和序列分析。结果显示,各毒株随传代次数的增加,与经典毒株Cu-1及弱毒株P2的同源性有所增高;各毒株的变异代次和变异位点不尽相同,但232、233、234及253位氨基酸的密码子在传代过程中是易变密码子;各毒株对鸡胚的半数致死量随着传代均降低了2～3个稀释度;鸡胚中病毒的滴度在10代以后较传代初期均有提高。接种供试雏鸡后,各毒株的鸡胚毒出现的临床症状均较其法氏囊毒晚24～36 h,致死率有所下降,但各毒株鸡胚毒与其囊毒病理变化相似。     

雏鸭人工接种鸭肝炎鸡胚化弱毒株MY后组织结构动态变化的比较研究

对鸭肝炎鸡胚化弱毒株MY接种4日龄雏鸭后的组织变化进行了动态观察比较研究.结果显示:雏鸭接毒12 h肝、肾呈现轻度细胞变性;48 h后组织变性程度减轻,汇管区周围细胞增生;144 h细胞核、浆染色加深,组织修复迹象明显;14 d结构正常.接毒12 h脾脏白髓、法氏囊滤泡中淋巴细胞减少,72 h脾、24 h法氏囊中淋巴细胞有所增多.心脏、肺、脑组织在接毒各期皆有轻度的充血、出血.鸭肝炎鸡胚化弱毒株MY与标准毒导致的多组织变性、坏死相比,其变性轻而可逆;与疫苗HY所致的组织变化相似,但结构恢复时间早.结果表明:鸭肝炎鸡胚化弱毒株MY接种4日龄雏鸭,虽可造成雏鸭肝、肾等实质器官轻微的组织病变,但损伤的组织结构可在短期内修复,并恢复至正常;脾脏、法氏囊中的淋巴细胞在接毒后,也由减少到增多.本研究为鸭肝炎鸡胚化弱毒株MY用作鸭肝炎疫苗株的安全性从病理组织学角度提供了依据.     

鸡胚血清中被动抗体吸收规律的研究

<正>研究以双抗体夹心ELISA法检测420枚(只)从鸡胚9日龄至雏鸡5日龄的血液抗体Ig G变化趋势,结果发现血清抗体Ig G从0.27μg/m L递增至18.27μg/m L,并以雏鸡3日龄时血液中Ig G抗体含量最高。1材料与方法1.1鸡Ig G的提取与鉴定Ig G从蛋鸡血清中提取,按何昭阳等[1]报道的方     

血清3型鸭甲型肝炎病毒弱毒疫苗株培育及免疫原性研究

近年来鸭甲型肝炎病毒血清3型引起的小鸭肝炎在我国广泛流行,严重危害着肉鸭养殖业.本研究采用鸭胚连续传代对血清3型鸭甲型肝炎病毒分离株进行致弱,通过检测不同代次的鸭胚组织毒的毒力、稳定性及免疫原性,结果发现该病毒在鸭胚中连续传代至第53代以后对雏鸭无致病性,在雏鸭体内连续继代不出现毒力返强.雏鸭经颈部皮下接种5×105.9ELD50的第54代病毒后可刺激机体产生坚强的免疫力.1日龄雏鸭免疫后4 d对强毒感染的保护指数为81.4%,免疫后6天的保护指数为100%.3日龄雏鸭免疫后5 d攻毒保护率为100%.1日龄雏鸭免疫后1周,血清中和抗体水平为10-3.29,至第4周达到高峰,之后开始缓慢下降.试验结果表明,3型鸭甲型肝炎病毒株第54代弱毒具有良好的免疫原性、毒力稳定,雏鸭接种后诱导产生的免疫力完全可以保护小鸭渡过鸭肝炎易感期,可作为疫苗候选株     

血清3型鸭甲型肝炎病毒TaqMan RT-qPCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中已发布的血清3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)基因序列,针对VP1基因序列的保守区域设计一对引物及一条特异性TaqMan探针建立了DHAV-3的TaqMan荧光定量检测方法(TaqManRT-qPCR)。通过对反应条件和反应体系的优化,建立的TaqManRT-qPCR方法在6.39×10^8~6.39×10^0拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,R2值为0.999。该方法能特异地检测出DHAV-3,与血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)及其他常见鸭病病原无交叉反应,且组内和组间重复性试验变异系数均小于1%。用普通RT-PCR方法和建立的TaqManRT-qPCR方法,对63份临床疑似鸭肝炎的肝组织样品进行检测,结果RT-PCR方法检出DHAV-3的阳性率是34.92%(22/63),TaqManRT-qPCR方法检出的阳性率是41.27%(26/63);对49份DHAV-3感染康复鸭的肛拭子样品进行检测,RT-PCR和TaqManRT-qPCR方法检出阳性率分别为22.45%(11/49)和85.71%(42/49);用TaqManRT-qPCR方法和鸡胚半数致死量法(ELD50)对DHAV-3(SD70株)鸡胚病毒含量进行检测比较,两种方法检测结果呈正相关。结果表明所建立的TaqManRT-qPCR检测方法特异性好,灵敏度高,为DHA-3快速诊断和流行病学调查提供技术手段。     

鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株适应在鸭胚成纤维细胞上生长的研究

对分离自鸭体的鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株(DEV-CHv)进行了适应在鸭胚成纤维细胞(DEF)上生长的研究。结果表明,DEV-CHv病死鸭肝脏悬液以绒毛尿囊腔途径经10日龄鸭胚连续传代2次,取尿囊液接种细胞的方法可获得适应DEF生长的DEV-CHv,而肝组织内病毒直接接种在DEF上则不生长。DEV-CHv刚适应DEF时以细胞变圆、折光度增强为病变特征,而适应DEF后以细胞脱落和形成圆形蚀斑为特征。适应DEF的DEV-CHv通常30h左右使细胞脱落,36h左右在细胞单层上形成蚀斑,48h时细胞病变可达80%以上。     

鸭肝炎病毒在鸭胚成纤维细胞上的适应性研究

将鸭肝炎病毒(DHV)E53鸡胚致弱株适应鸭胚成纤维细胞(DEF),连续传代至第16代时出现细胞病变(CPE),第21代时CPE呈现规律性,接毒后72 h CPE达80％,其病变特征是细胞间隙增宽、细胞崩解死亡、脱落.经病毒细胞培养物滴度测定、RT-PCR检测和间接免疫荧光法鉴定,证明DHVE53株能够在DEF上增殖.