牛源A型多杀性巴氏杆菌hyaD基因缺失株的构建及其在小鼠上的交叉保护性分析

hyaD为A型多杀性巴氏杆菌荚膜多糖合成相关基因,为探讨该基因对多杀性巴氏杆菌毒力及其免疫保护特性的影响,本研究利用同源重组方法,构建了牛源A型多杀性巴氏杆菌CQ2株（PmCQ2）的hyaD基因缺失株（ΔhyaD）。结果发现,与野生株相比,ΔhyaD的荚膜产生量及其感染后在脏器中的细菌定殖量均显著下降,其毒力显著降低。细胞试验发现,ΔhyaD更易黏附于巨噬细胞,被吞噬数量显著多于野生株,致使巨噬细胞相关炎性因子表达显著上调。hyaD基因的缺失,可调控与荚膜合成、LPS合成转运、铁转运等相关的基因表达显著下调,促使相关保护性抗原基因表达显著上调。以制备的PmCQ2株和ΔhyaD株灭活苗免疫小鼠（加强免疫1次）,免疫后第21天分别采用同源和异源多杀性巴氏杆菌攻毒,ΔhyaD株免疫小鼠肺组织感染后24 h无明显或轻微病理损伤,对牛源A型、B型和F型多杀性巴氏杆菌的免疫保护率分别为100%、100%和80%,对兔源、猪源和禽源A型多杀性巴氏杆菌的免疫保护率分别为90%、100%、100%;而野生株PmCQ2除对牛源A型多杀性巴氏杆菌的保护率在80%以上外,对牛源B型和F型及兔、猪、禽源A型多杀性巴氏杆菌均无明显交叉保护作用。研究结果表明,hyaD基因可通过调控荚膜产生及毒力相关因子表达影响菌株毒力;hyaD基因缺失可调控相关交叉保护性抗原表达,赋予菌株交叉免疫保护特性。该研究为多杀性巴氏杆菌通用型疫苗的研发提供了参考。     

牛源多杀性巴氏杆菌新型交叉保护性抗原的筛选

为了筛选多杀性巴氏杆菌潜在的交叉保护性抗原,首先对牛源多杀性巴氏杆菌PmCQ2株(A型)、PmCQ6株(A型)、PmB株(B型)、PmF株(F型)全基因组序列进行分泌蛋白及膜蛋白预测,并使用Signal、TMMHM在线分析筛选到48个候选共有抗原基因;然后分别克隆于pET-28α中构建原核重组表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达,SDS-PAGE检测获得31个重组表达蛋白。间接ELISA检测重组蛋白对3种不同血清型牛多杀性巴氏杆菌多抗的反应原性,发现13个重组蛋白具有较强的反应原性。最后选择5个重组蛋白免疫小鼠后,分别采用10LD50PmCQ2、PmB和PmF进行攻毒保护性试验,结果显示:r-PmCQ2_1g0376免疫后的小鼠对PmCQ2和PmB的攻毒保护率为50%和30%,对PmF则没有保护性;r-PmCQ2_4g0132免疫后对PmCQ2、PmB和PmF株的攻毒保护率分别为80%,20%和10%;r-PmCQ2_1g0311免疫后的小鼠对PmCQ2的攻毒保护率为30%,对PmB和PmF株均无保护性。本试验筛选出2个交叉保护性抗原,可以不同程度保护同源或异源菌株的攻击,为多杀性巴氏杆菌新型疫苗候选蛋白的筛选奠定了基础。     

牛源A型多杀性巴氏杆菌强毒株CQ2和弱毒株CQ6毒力相关基因分析.

为探讨牛源A型多杀性巴氏杆菌强毒株(PmCQ2)与弱毒株(PmCQ6)其所含毒力基因的差异,本研究选择了多杀性巴氏杆菌17个与毒力相关的基因(tbpA、hgbA、hgbB、tonB、ptfA、pfhA、nanB、nanH、toxA、oma87,sodA、sodC、fimA、hsf-1、tadD、pmHaS、hadA)进行检测。试验结果显示,所检测的17个毒力相关基因中,有14个基因在PmCQ2和PmCQ6中都存在,tox A和hgb B基因在两菌株中均未检出,tadD基因仅存在于PmCQ6中。以上结果提示,CQ2株与CQ6株之间的毒力差异原因可能是:除上述所检测的毒力相关基因外,可能还存在其他毒力相关基因;二者毒力基因的表达调控存在差异。     

牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌疫苗候选株的筛选及鉴定

为了筛选生长快、毒力强、免疫原性好、副反应小的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）灭活疫苗菌株，本试验选取6株来自不同地区致犊牛肺炎死亡的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌分离株，测定了培养基生长曲线、小鼠毒力、菌体脂多糖（LPS）含量及各菌株灭活菌苗免疫小鼠和家兔后的抗体效价，并进行了攻毒保护试验。结果显示，分离株Pm2、Pm3、Pm5生长速度较快、毒力较强、LPS含量较多，均含有与毒力和免疫相关的ptfA和fimA基因；免疫小鼠及家兔未发现明显不良反应，在二免后14 d血清抗体达1：64~1：128，强毒攻毒后全部存活，而PBS对照组全部死亡。本试验结果表明，Pm2、Pm3、Pm5均可作为多杀性巴氏杆菌灭活菌苗的候选菌株，其中Pm3作为首选株。     

牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌疫苗候选株的筛选及鉴定

为了筛选生长快、毒力强、免疫原性好、副反应小的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)灭活疫苗菌株,本试验选取6株来自不同地区致犊牛肺炎死亡的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌分离株,测定了培养基生长曲线、小鼠毒力、菌体脂多糖(LPS)含量及各菌株灭活菌苗免疫小鼠和家兔后的抗体效价,并进行了攻毒保护试验。结果显示,分离株Pm2、Pm3、Pm5生长速度较快、毒力较强、LPS含量较多,均含有与毒力和免疫相关的ptfA和fimA基因;免疫小鼠及家兔未发现明显不良反应,在二免后14d血清抗体达1∶64~1∶128,强毒攻毒后全部存活,而PBS对照组全部死亡。本试验结果表明,Pm2、Pm3、Pm5均可作为多杀性巴氏杆菌灭活菌苗的候选菌株,其中Pm3作为首选株。     

牛源多杀性巴氏杆菌荚膜血清型及毒力基因检测

为了确定12株牛源多杀性巴氏杆菌的血清型及毒力基因的携带情况,本研究采用PCR技术对12株牛源多杀性巴氏杆菌(pasteurella maltocida,Pm)进行荚膜血清型鉴定和6种毒力基因(tbp A、hgb A、hgb B、ptf A、pfh A、tox A)的检测,并对其序列进行比对分析。结果显示:12株多杀性巴氏杆菌均为荚膜血清A型;100%的荚膜血清A型Pm携带hgb A毒力基因和pfh A毒力基因;41.67%的荚膜血清A型Pm携带nan H毒力基因;58.33%的荚膜血清A型Pm携带ptf A毒力基因;而对于tbp A与tox A两种毒力基因在12株牛源荚膜血清A型Pm中均未检测到。     

重组牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌脂蛋白E的免疫保护性研究

为鉴定多杀性巴氏杆菌脂蛋白E的免疫保护性,本研究从牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌PM-HLJ株的基因组DNA中扩增出大小为1 011 bp的脂蛋白E编码基因(PlpE),经序列测定显示,其氨基酸序列与A型多杀性巴氏杆菌参考株PlpE序列一致性为95.83%。将PM-HLJ的PlpE基因克隆于表达质粒pET-30a(+)并诱导表达,将表达的重组脂蛋白E纯化后经腹腔免疫小鼠,间接ELISA检测结果显示各免疫组均产生了针对重组脂蛋白E的IgG抗体,免疫保护试验显示,当小鼠免疫剂量为20μg、30μg、40μg和60μg时,保护率分别达到20%、40%、80%和100%。结果表明,牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌重组脂蛋白E具有良好的免疫保护作用。     

禽致病性大肠杆菌luxS和rbsC双基因缺失株的构建及其生物特性分析

禽致病性大肠杆菌(APEC)能引起家禽严重的呼吸系统和全身性疾病,由于APEC耐药菌株的不断出现迫使新型抗菌方式的研发迫在眉睫.本研究旨在评价APEC的luxS和rbsC双缺失的突变株作为减毒疫苗候选株的潜力,通过在APEC分离株DE17的单基因缺失株DE17ΔluxS的基础上,利用Red重组系统构建双基因缺失株DE1...     

禽巴氏杆菌链霉素依赖株选育的研究

本研究用亚硝酸作为禽多杀性巴氏杆菌诱变剂,在含有一定剂量的链霉素的选择培养基上,将一株毒力较强的野生型禽多杀性巴氏杆菌经过诱变选育出一株依赖链霉素的突变株。突变株的形态、染色、生长特性、生化反应等与原野生型菌株相同,突变株经扫描电子显微镜观察,亦显示有荚膜,菌体不呈链状,经动物测试,其遗传稳定性及安全性良好,具有中等程度的保护效力。     

牛源A型多杀性巴氏杆菌强弱毒株差异基因的SSH法筛选

近年来由于牛的频繁调运,由牛源A型多杀性巴氏杆菌引起的牛肺炎型疾病呈现出流行趋势。为探讨牛源A型多杀性巴氏杆菌强弱毒株间的基因差异,本研究利用抑制消减杂交技术(SSH)对牛源A型多杀性巴氏杆菌强毒株Pm CQ2和弱毒株Pm CQ6进行试验分析,共得到28个差异基因片段,测序比较发现其中27个与毒力、代谢、转录及DNA合成相关的基因片段,另1个基因片段所编码的为假定蛋白。该结果为牛源A型多杀性巴氏杆菌的后续致病机制研究提供了参考。     

基于牛源A型多杀性巴氏杆菌溶血表型的蛋白组学分析

为探究多杀性巴氏杆菌在厌氧条件下出现溶血现象的原因,设计以牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2为模式菌株,对其在有氧和厌氧环境培养条件下所得菌体进行TMT蛋白组学分析,结合生物信息学分析筛选潜在溶血因子,同时用qRT-PCR及Western blot方法验证蛋白组结果.结果 显示,蛋白组学定量检测到1603个蛋白,其中厌氧...     

牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的实验室制备及小鼠攻毒试验分析

从患病牛中分离的两株A型多杀性巴氏杆菌WC1654株和LD01株分别进行生化试验、PCR鉴定、LD50测定、细菌灭活、疫苗配置、小鼠免疫和攻毒保护试验。PCR结果显示,两株多杀性巴氏杆菌WC1654株和LD01株均含有5种毒力基因。攻毒试验结果灭活疫苗对免疫小鼠保护率为60%。为巴氏杆菌病高效疫苗的研究与开发奠定基础,为防治牛A型多杀性巴氏杆菌病提供一种生物制品。     

副猪嗜血杆菌qseC基因缺失突变对生物被膜形成的影响

通过构建副猪嗜血杆菌qseC突变体,探讨qseC基因的缺失对副猪嗜血杆菌生长和生物被膜形成的影响。利用自然转化方法构建副猪嗜血杆菌qseC基因的突变体,测定副猪嗜血杆菌野生株SC096与缺失株ΔqseC的生长情况并绘制生长曲线。结晶紫染色法定性检测野生株和突变体生物被膜的差异;通过96微孔板定量方法检测突变体生物被膜的量;电镜观察二者生物被膜的变化。结果如下:成功构建qseC基因突变体。生长曲线显示副猪嗜血杆菌野生株SC096与缺失株ΔqseC生长速度基本一致。缺失株ΔqseC较之野生株SC096生物被膜的形成能力有所减弱。研究表明,qseC基因对副猪嗜血杆菌生物被膜的形成有重要的调控作用。     

牛源A型多杀性巴氏杆菌pm0979和pm0442基因编码蛋白对小鼠的免疫保护性研究

为评价牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌(Pm) pm0979和pm0442基因编码蛋白的免疫保护效果,本研究以牛源PmCQ2株基因组DNA为模板,经PCR扩增得到pm0979、pm0442全长基因,将其分别克隆到pET-30a、pET-32a载体并转化BL21 (DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导表达,分别获得大小约41.8 ku (rPM0979)和21.6 ku (rPM0442)的重组蛋白;将其亲合层析纯化后分别免疫小鼠,以PmCQ2株进行攻毒试验,测定其抗体产生情况和保护效果.结果表明,两种重组蛋白均可以诱导小鼠产生较高水平的抗体;其中rPM0979对小鼠的免疫保护高于rPM0442,保护率可达60％.结果表明,重组蛋白PM0979可作为Pm的一种疫苗候选蛋白,为进一步的疫苗研制奠定了基础.     

牛A型巴氏杆菌高、低毒力株LPS激活RAW264.7细胞TLR4信号通路的比较分析

本研究旨在比较牛A型多杀性巴氏杆菌高毒力株(PmCQ2)和低毒力株(PmCQ6)脂多糖(LPS)对小鼠巨噬细胞RAW264.7内TLR4信号通路的影响。选用体外培养RAW264.7细胞,经LPS刺激后检测细胞内TLR4信号激活及对TNF-α和IL-12p40表达的影响;并利用Western blot检测LPS对IκBα磷酸化及NF-κBp65活化的影响。结果显示,高毒力株LPS_PmCQ2和低毒力株LPS_PmCQ6分别刺激RAW264.7细胞后,均能显著提高TLR4的表达,并诱导细胞因子TNF-α和IL-12p40的分泌表达;LPS_PmCQ2和LPS_PmCQ6均能诱导IκBα磷酸化,促进NF-κBp65核转位,但二者没有显著差异(P>0.05)。本研究表明牛A型多杀性巴氏杆菌高、低毒力株LPS均能参与TLR4介导的小鼠巨噬细胞免疫应答,且二者对TLR4介导的IκBα-NF-κB信号通路的作用无显著差异,暗示牛A型多杀性巴氏杆菌对小鼠巨噬细胞的毒力与LPS无明显相关性,可能由其他毒力因子决定。     

不同动物源生产用多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因序列分析

为了解国内不同动物源生产用多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因的变异情况,采用PCR方法对16株不同动物源生产用多杀性巴氏杆菌的ompH基因进行扩增测序和分析。结果显示：16株菌株的ompH基因开放阅读框在1002～1056 bp之间;信号肽为N端20个氨基酸残基,成熟蛋白氨基酸残基数量在313～331 aa之间,氨基酸同源性为82.1%～100%;基于ompH氨基酸序列的系统发育树中鸡源菌株（荚膜A型）、猪源和牛源菌株（荚膜B型）分别在不同的分支。序列分析结果表明,ompH基因序列差异与荚膜型之间存在相关性,而与毒力大小无相关性。     

猪四环素饮水投药的药理学研究

德国柏林自由大学Astrid Bethe等科学家从150个猪场的健康猪以及息肺炎和萎缩性鼻炎的猪身上采集了382份多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）菌株,专门研究了多杀性巴氏杆菌的共生菌株和致病菌株毒力相关基因（virulence—associated genes,VAGs）与核糖体基因型[ribotyping）的基因差异性。     

牛溶血性曼氏杆菌及牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗对小鼠的保护性研究

牛溶血性曼氏杆菌及牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌是导致牛呼吸道疾病（bovine respiratory disease,BRD）的重要细菌性病原,每年给养牛业带来巨大的经济损失,目前对其疫苗研究仍显不足。本研究选用牛溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica,Mh） Mh422株和牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm） PmCQ2株作为疫苗菌株,分别制备了2种菌体浓度的Mh和Pm单价灭活菌苗及3种菌量配比（1∶1、2∶1和3∶1）的Mh-Pm二联灭活苗,以小鼠为模型,皮下多点免疫（0.2 mL）,加强免疫2次,免疫剂量均为首免的一半。首免后第7天及其后每隔5 d,小鼠尾静脉采血分离血清,ELISA方法检测抗体效价,三免后第20天,分别以Mh422或PmCQ2进行腹腔攻毒测定免疫保护效果。结果显示,所有小鼠接种疫苗均无不良反应,二免后第10天抗体达较高水平,三免后抗体水平持续升高,第15天到达高峰,其后25 d维持高水平,后缓慢下降。Mh单菌苗的2种免疫剂量对Mh422株攻毒的免疫保护率均为0,而Pm单菌苗的2种免疫剂量对PmCQ2株攻毒的免疫保护率全为100%;Mh和Pm间无交叉免疫保护作用;3种菌量配比的Mh-Pm二联疫苗对Mh422株和PmCQ2株攻毒的各自免疫保护率分别为53%～71%和100%。该研究结果表明,所制备的Mh422单菌苗对同型攻毒无免疫保护作用,在诱导机体抗体产生方面,Mh和Pm间无相互抑制作用,PmCQ2株具有促进Mh422株灭活疫苗对Mh422的免疫保护作用,这为牛溶血性曼氏杆菌和牛多杀性巴氏杆菌二联疫苗的进一步研究提供了理论基础。     

多杀性巴氏杆菌脂多糖的结构与功能研究进展

多杀性巴氏杆菌是一种兼性厌氧的革兰阴性菌,能够造成多种动物的巴氏杆菌病。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)既是细菌重要的毒力因子,又是主要的保护性抗原。依据LPS血清学反应,多杀性巴氏杆菌可分为16个血清型。与大多数革兰阴性菌不同,多杀性巴氏杆菌的脂多糖不含O-抗原,仅由类脂A和核心寡糖两部分组成。近年来人们通过质谱检测和基因测序陆续揭示了这16个血清型核心寡糖的化学结构和合成基因。研究表明,各血清型内核心寡糖结构十分保守,合成基因分散存在于基因组;外核心寡糖的化学组成具有多样性,其合成基因成簇存在,形成外核心寡糖基因簇。虽然有些血清型共享同样的外核心寡糖基因簇,但由于基因突变造成它们外核心寡糖结构的异质性。研究还发现核心寡糖的结构与多杀性巴氏杆菌的毒力有关。作者在本文中综述了多杀性巴氏杆菌16个血清型的核心寡糖的化学结构、基因组成及其结构与毒力的关系,为多杀性巴氏杆菌病的防治提供借鉴。     

不同动物源多杀性巴氏杆菌荚膜分子分型及其致病性研究

为了确定西南民族大学动物医学实验室分离的鸭源、猪源、牛源和山羊源多杀性巴氏杆菌(Pm),即Q1、Z1、N1、Y1株的荚膜血清型及其致病性,试验采用PCR方法对分离的这4株不同动物源多杀性巴氏杆菌的种属和荚膜血清型进行鉴定,对目的基因测序分析,并用Balb/c小鼠对分离菌的致病性进行研究。结果表明:4株菌均为多杀性巴氏杆菌;鸭源Q1株为荚膜血清A型、猪源Z1株和牛源N1株为荚膜血清B型、山羊源Y1株为荚膜血清D型;对目的基因测序后与GenBank上已公布的相应荚膜血清型比对,同源性为98%～100%;不同动物源多杀性巴氏杆菌对Balb/c小鼠的致病性研究显示,猪源荚膜血清B型多杀性巴氏杆菌对Balb/c小鼠有较强的致病力。