PK-15细胞的THBS3基因缺失抑制PRV复制

为探索猪血小板反应蛋白3(thrombospondin 3,THBS3)在PRV复制中的功能，利用CRISPR/Cas9系统构建THBS3基因缺失的PK-15稳定细胞株。首先，根据THBS3基因序列和CRISPR/Cas9靶点设计原则设计并合成2对sgRNA序列，退火后连接到Lenti-CRISPRv2慢病毒表达载体；与慢病毒包装质粒共转染人胚肾细胞(HEK293T)获得重组慢病毒，收集细胞上清并离心去细胞碎片后转导PK-15细胞，进行嘌呤霉素筛选获得THBS3敲除的PK-15细胞株；将重组病毒rPRV-GFP接种至野生型和缺失型细胞评价病毒复制差异。结果显示，表达sgRNA的重组质粒构建成功；将收获的慢病毒转导细胞后通过筛选获得1株无THBS3蛋白表达细胞株(PK-THBS3-KO),通过测序发现外显子3有1个碱基的插入；感染试验显示，THBS3基因缺失后抑制了PRV复制。结果表明，通过CRISPR/Cas9系统成功构建了PK-15的THBS3基因敲除的稳定细胞株，PRV感染试验显示基因缺失后抑制了病毒复制。     

基于CRISPR/Cas9技术的法尼醇X受体缺失株的构建及其对HeLa细胞增殖的影响

试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建法尼醇X受体（FXR）基因稳定敲除细胞株,并考察其对HeLa细胞增殖的影响。根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计3对特异性识别FXR基因第1外显子相关序列的上下游小向导RNA（small guide RNA,sgRNA）,以PX459质粒为载体,构建真核重组表达质粒。酶切和测序鉴定后将重组质粒转染至HeLa细胞中,用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,再用实时荧光定量PCR检测HeLa细胞FXR基因敲除稳定株中FXR的表达量,并用Western blotting方法鉴定HeLa细胞FXR基因敲除效果。最后用结晶紫染色试验检测FXR基因敲除对HeLa细胞增殖的影响。结果显示,经测序后,3对sgRNA位置与方向均正确插入到PX459质粒载体内,成功构建出重组表达质粒PX459-sgRNA;实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,转染后筛选出的细胞中FXR蛋白不表达,表明构建出稳定敲除FXR基因的HeLa细胞株;结晶紫试验结果发现,FXR基因敲除的HeLa细胞染色深度明显低于正常HeLa细胞,FXR基因敲除HeLa细胞孔D_{595 nm}值极显著低于野生型HeLa细胞孔（P<0.01）,说明HeLa细胞FXR基因敲除株的增殖能力较正常HeLa细胞显著降低。本试验利用CRISPR/Cas9技术成功获得了内源FXR基因敲除细胞株,且FXR基因敲除对癌细胞增殖具有显著抑制作用,为研究FXR的功能和作用机制提供了细胞模型,并为研究FXR在相关癌症发生发展中的作用奠定了基础。     

CRISPR/Cas9系统敲除山羊CDK2基因载体构建及转染效率检测

细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶-2(CDK2)是细胞通过和进入S期所必须的细胞周期调节激酶,与许多癌细胞的生长有关。然而,目前在山羊上关于CDK2基因敲除及相关功能的研究尚未见报道。研究采用CRISPR/cas9系统,首先设计CDK2基因的sgRNA片段,在合成CDK2 sgRNA核苷酸序列后,构建能够同时表达sgRNA和Cas9 D10A的质粒PYSY-CDK2 sgRNA,连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,对转化子进行验证,最后转染HEK293T细胞,检测细胞荧光和细胞增殖。酶切和测序结果证明,CDK2基因敲除载体构建正确;荧光显微镜检测显示,细胞转染效率在75%以上;细胞增殖检测表明,山羊CDK2敲除质粒不会对人源细胞增殖产生影响。说明采用CRISPR/Cas9构建的载体,可为后续获得山羊CDK2基因缺失型细胞系,研究支原体肺炎感染引发的细胞凋亡分子机制提供理论依据。     

Toll样受体7基因敲除对水疱性口炎病毒增殖的影响

【目的】 探究敲除Toll样受体7（Toll-like receptor 7，TLR7）基因对水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）复制的影响。【方法】 利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TLR7基因敲除的稳定猪肾上皮细胞（porcine renal epithelial cells，PK15）系。通过构建pTLR7-sgRNA重组质粒并转染至HEK293T/17细胞，收获慢病毒并感染PK15细胞，经嘌呤霉素筛选后得到PK15-TLR7^-/-多克隆细胞，并在Western blotting鉴定后通过有限稀释法获得PK15-TLR7^-/-单克隆稳定细胞系。为验证敲除TLR7基因稳定细胞系是否构建成功，分别利用光学显微镜和细胞毒性检测（cell counting kit 8，CCK-8）观察并检测PK15、PK15-TLR7^-/-细胞的形态与活力；利用荧光倒置显微镜和流式细胞术观察VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7^-/-细胞后病毒增殖情况；利用Western blotting和实时荧光定量PCR分别检测VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7^-/-细胞后GFP蛋白和VSV-N基因mRNA水平的表达情况；利用病毒滴度检测VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7^-/-细胞后子代病毒产生情况。【结果】 采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的3种sgRNA均对TLR7进行了有效的编辑，其中sgRNA2的基因编辑效率最高，但敲除TLR7基因并不影响PK15细胞的形态及活力；当感染VSV-GFP后，通过荧光显微镜观察发现，荧光强度随着时间逐次增加，且PK15-TLR7^-/-细胞的GFP荧光强度强于PK15细胞。流式细胞术检测结果显示，相同时间点的PK15-TLR7^-/-细胞感染VSV-GFP的比例显著或极显著高于PK15细胞（P<0.05；P<0.01）；实时荧光定量PCR结果表明，感染4~36 h VSV-N基因mRNA相对表达量随着时间逐渐增加，且PK15细胞中VSV-N基因的mRNA相对表达量显著或极显著低于PK15-TLR7^-/-细胞（P<0.05；P<0.01）；Western blotting结果表明，PK15与PK15-TLR7^-/-细胞中的VSV-GFP GFP蛋白均从6 h开始表达，表达量随时间逐渐增多，且在PK15-TLR7^-/-细胞中VSV-GFP GFP蛋白含量比PK15细胞更高；感染VSV-GFP 6 h后子代病毒开始释放，此时PK15细胞中VSV-GFP子代病毒滴度低于PK15-TLR7^-/-细胞（P>0.05），但PK15细胞中VSV-GFP子代病毒滴度随着感染时间的增加显著或极显著低于PK15-TLR7^-/-细胞（P<0.05；P<0.01）。【结论】 TLR7基因的敲除可以促进VSV在PK15细胞中的复制，初步验证了TLR7在天然免疫中的作用，为VSV等RNA病毒性疾病的防控提供新思路。     

干扰素基因刺激因子基因敲除对猪伪狂犬病病毒复制的影响

研究干扰素基因刺激因子(STING)基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响。用CRISPR/Cas9技术敲除猪肺巨噬细胞系(3D4/21)的STING基因,用T7核酸酶检测靶基因敲除效率,用细胞计数试剂盒检测基因敲除细胞的活力,用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组病毒PRV-GFP感染基因敲除细胞,用流式细胞术检测感染细胞的荧光强度,用定量RT-PCR检测PRV的gB、TK基因表达及其感染细胞的IL-1β、IFN-β、ISG15基因转录,用Western blot检测PRV gE蛋白表达水平,用病毒滴定法测定子代病毒滴度。结果显示:设计的3个STING基因外显子2特异sgRNA均能切割3D4/21细胞的靶序列,其中sgRNA3的基因编辑效率最高;对sgRNA1介导STING基因敲除系进行克隆化,获得基因敲除细胞系3株,基因敲除对细胞活力无影响;亲本细胞培养的PRV-GFP感染阳性细胞占80.77%,STING基因敲除细胞培养的PRV-GFP感染阳性细胞占95.55%;STING基因敲除对PRV基因表达具有促进作用,亲本3D4/21细胞的病毒滴度为10~(6.2) TCID_(50)·0.1 mL~(-1),STING基因敲除细胞的病毒滴度为10~(8.3)TCID_(50)·0.1 mL~(-1),病毒感染细胞的IL-1β、IFN-β和ISG15转录下调明显。STING基因敲除能促进PRV在3D4/21细胞中复制,可能与感染细胞的IL-β、IFN-β和ISG15表达抑制有关。     

O型口蹄疫病毒OA58株3C基因的克隆与真核表达

利用RT-PCR技术扩增获得了长度约640bp的口蹄疫缡毒目的基因，回收片段后与pMD18-T载体进行连接，测序结果表明获得了口蹄疫病毒3C基因。将重组质粒pMD18-3C与表达载体pEGFP-N1分别用BarnH I＋XhoI双酶切后，进行定向亚克隆，对重组表达质粒pEGFP-3C进行PCR、酶切鉴定及DNA测序，结果表明重组表达质粒所含的3C基时读码框正确。用pEGFP-3C转染BHK-21细胞，荧光显示目的基因EGFP发出绿色荧光；对3C转录的mRNA进行RT-PCR鉴定，证实3C基因在BHK-21细胞中得到了表达。     

干扰素调节因子3基因敲除对伪狂犬病病毒增殖的影响

试验旨在研究敲除干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3,IRF3)对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)复制的影响。使用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了IRF3基因敲除PK15细胞系。通过构建重组质粒pIRF3-sgRNA,转染至HEK293T/17细胞,收获慢病毒并感染PK15细胞,经嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7酶切鉴定后通过有限稀释法获得PK15-IRF3^-/-单克隆稳定细胞系。为验证敲除IRF3基因稳定细胞系是否构建成功,采用实时荧光定量PCR、Western blotting方法检测PRV相关基因及蛋白的表达,应用荧光显微镜和流式细胞术观察病毒复制情况并进行病毒滴度检测。结果显示,PK15-IRF3^-/-细胞系感染PRV-GFP后PK15-IRF3^-/-细胞荧光强度明显强于PK15细胞。感染PRV野毒(PRV-QXX)后PK15-IRF3^-/-病毒滴度明显强于PK15细胞,PRV的gE蛋白水平明显高于PK15细胞。在mRNA水平检测两种细胞中PRV TK基因的变化也得到相同的结果。进一步研究表明,在感染PRV-QXX后,PK15细胞中IFN-βmRNA会随着时间增加显著增高(P<0.05),但PK15-IRF3^-/-细胞中IFN-βmRNA则无明显变化。上述结果表明,敲除IRF3基因后显著促进PRV的增殖,IRF3在病毒的复制中发挥着重要作用,为伪狂犬病的防控提供了新的方法和策略。     

利用CRISPR/Cas9系统构建Prdx6基因敲除的RAW264.7细胞系

利用CRISPR/Cas9系统构建敲除Prdx6基因的RAW264.7小鼠巨噬细胞系,为探讨Prdx6与布鲁菌感染及胞内寄生的关系构建细胞模型。针对Prdx6基因的第1外显子设计sgRNA,构建重组表达载体Prdx6-pX459-sgRNA,将重组质粒转染RAW264.7细胞,嘌呤霉素初步筛选。单细胞接种并扩繁,提取基因组DNA,PCR及测序鉴定。结果表明,在敲除细胞株基因组中存在碱基缺失,导致移码突变。说明成功获得敲除Prdx6基因的RAW264.7细胞系。     

伪狂犬病病毒在NF-κB家族p65基因敲除细胞系的复制规律研究

试验旨在研究伪狂犬病病毒(PRV)在NF-κB家族p65基因敲除细胞系中的复制规律。利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因定点修饰技术构建猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)p65基因稳定敲除细胞系。通过构建p65-sgRNA重组质粒,转染至HEK293T/17细胞,收取慢病毒,感染3D4/21细胞后利用嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7核酸酶检测敲除效率,再通过有限稀释法获得3D4/21-p65^-/-的稳定细胞系。CCK-8试剂盒检测3D4/21细胞中敲除p65基因后对细胞增殖的影响;流式细胞术检测PRV-GFP感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后病毒增殖的差异;实时定量PCR检测PRV感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、TK基因mRNA表达水平及PRV感染细胞诱导的IL-1β和IL-6基因mRNA水平表达的变化;Western blotting检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后子代病毒滴度。结果表明,sgRNA2和sgRNA3的基因编辑效率较高,对其进行克隆化培养进而获得敲除p65基因的稳定表达细胞系;CCK-8试剂盒检测细胞活力表明,p65基因敲除对细胞活力无影响;流式细胞仪检测表明,同一时间点PRV-GFP在3D4/21-p65^-/-中的增殖显著高于对照细胞;实时荧光定量PCR表明在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、TK基因的mRNA表达水平,而抑制了IL-1β、IL-6基因的mRNA表达;Western blotting结果表明,在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定结果表明,同一时间点PRV-QXX在3D4/21-p65^-/-细胞中子代病毒的复制显著高于对照细胞。以上结果均表明,p65基因敲除可促进PRV在3D4/21细胞中复制。     

干扰素调节因子3基因敲除对伪狂犬病病毒增殖的影响

试验旨在研究敲除干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3,IRF3)对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)复制的影响。使用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了IRF3基因敲除PK15细胞系。通过构建重组质粒pIRF3-sgRNA,转染至HEK293T/17细胞,收获慢病毒并感染PK15细胞,经嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7酶切鉴定后通过有限稀释法获得PK15-IRF3~(-/-)单克隆稳定细胞系。为验证敲除IRF3基因稳定细胞系是否构建成功,采用实时荧光定量PCR、Western blotting方法检测PRV相关基因及蛋白的表达,应用荧光显微镜和流式细胞术观察病毒复制情况并进行病毒滴度检测。结果显示,PK15-IRF3~(-/-)细胞系感染PRV-GFP后PK15-IRF3~(-/-)细胞荧光强度明显强于PK15细胞。感染PRV野毒(PRV-QXX)后PK15-IRF3~(-/-)病毒滴度明显强于PK15细胞,PRV的gE蛋白水平明显高于PK15细胞。在mRNA水平检测两种细胞中PRV TK基因的变化也得到相同的结果。进一步研究表明,在感染PRV-QXX后,PK15细胞中IFN-βmRNA会随着时间增加显著增高(P0.05),但PK15-IRF3~(-/-)细胞中IFN-βmRNA则无明显变化。上述结果表明,敲除IRF3基因后显著促进PRV的增殖,IRF3在病毒的复制中发挥着重要作用,为伪狂犬病的防控提供了新的方法和策略。     

表达高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的伪狂犬病病毒拯救与纯化

为研制预防高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)感染的重组伪狂犬病病毒(PRV)活载体疫苗候选毒株，本研究依据HP-PRRSV HuN4毒株GP5基因序列设计并合成1对特异引物，BamHⅠ引入到引物的5′端，从HP-PRRSV毒株的RNA中，用RT-PCR扩增HP-PRRSV GP5基因。将BamHⅠ酶切的PCR产物与同样酶切并去磷酸化的PRV转移载体pG相连接，构建重组质粒pG-GP5/HP-EGFP。采用脂质体转染法将pG-GP5/HP-EGFP质粒转染已接种PRV三基因缺失毒株rPRV-gE^-/gI^-/TK^-的ST细胞中，经病毒空斑纯化，获得携有HP-PRRSV GP5基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因的重组伪狂犬病病毒rPRV-GP5/HP-EGFP。将重组病毒rPRV-GP5/HP-EGFP接种CRISPR/Cas9 EGFP敲除质粒转染过的ST细胞，经4轮病毒空斑纯化，最终获得无绿色荧光蛋白的重组病毒rPRV-GP5/HP。经PCR鉴定及测序，证实获得的rPRV-GP5/HP在EGFP基...     

Cullin-2基因敲除A549细胞系构建及其对A型流感病毒复制的影响

CRL复合体是泛素蛋白酶体降解系统中的核心酶,很多病毒会劫持宿主CRL复合体,激活或干扰其底物的降解,创造有利病毒复制的环境。本研究为了探讨CRL2复合体和流感病毒之间的关系,利用CRISPR/Cas9技术构建CRL2复合体骨架蛋白Cullin-2基因稳定敲除A549细胞系,并验证Cullin-2基因敲除对流感复制的影响。设计两条靶向Cullin-2的sgRNA,构建到敲除载体中,包装成慢病毒感染细胞,经过药物筛选和亚克隆纯化后,利用蛋白免疫印迹法和敲除位点测序鉴定,并比较野生型和Cullin-2敲除细胞中AIV的复制效率。结果显示,Cullin-2敲除对流感病毒滴度和病毒蛋白水平影响不显著,但会导致细胞因子转录水平的上调,为CRL复合体与流感病毒致病性机制关系研究提供新的思路。     

H240R和MGF505-7R基因缺失非洲猪瘟病毒的构建及其生长特性的初步研究

为探究H240R和MGF505-7R基因对非洲猪瘟病毒(ASFV)复制水平的影响，本研究采用PCR扩增ASFV HLJ/18株H240R基因和MGF505-7R基因阅读框前后各1 000 bp的同源臂，分别克隆至p BS-EGFP及p BSMcherry载体中，构建同源臂质粒p BS-GFP-H240R和p BS-Mcherry-MGF505-7R，采用PCR和测序鉴定正确。根据CRISPR/Cas9系统sg RNA设计原则设计分别靶向H240R和MGF505-7R基因的小向导RNA (sgRNA)，并克隆至p X330载体中，构建重组质粒p X330-sg H240R和p X330-sg MGF505-7R，经测序鉴定正确后，将线性化的同源臂质粒p BS-GFP-H240R与p X330-sg H240R共转染猪肺泡巨噬细胞(PAM)，再以ASFV感染，通过观察荧光并采用噬斑筛选纯化，构建H240R基因缺失病毒ASFV-ΔH240R；采用上述类似的方式构建MGF505-7R基因缺失病毒ASFV-Δ7R；在ASFV-ΔH240R的基础上，将线性化的同源臂质粒p BS-Mcherry-M...     

基于CRISPR/Cas9技术构建犬IRGM4、IRGM5和IRGM6基因敲除的MDCK细胞系

由干扰素诱导细胞产生的GTP蛋白酶M(IRGMs)在抵御病原微生物中发挥着核心作用。为建立IRGMs基因缺失的MDCK细胞系,本研究利用CRISPR/Cas9技术根据MDCK中IRGM4、IRGM5和IRGM6的基因序列设计并合成正链和负链引导RNA(gRNA)的靶DNA序列,以本实验室构建的含有单链引导RNA(sgRNA)骨架转录序列的通用质粒(p Gen-sgRNA)为模板,将U6启动子与合成的相关基因gRNA靶序列经PCR融合扩增,其产物再与sgRNA的骨架转录序列进行重叠延伸PCR扩增,并将扩增产物克隆于p GEM-T载体中,分别构建了具有靶向不同目的基因ORF的gRNA重组质粒。将这些重组质粒分别与pMJ920质粒共转染于MDCK细胞中,通过G418筛选和流式细胞仪分选,并以终点稀释法纯化培养筛选出的单细胞克隆株。经gRNA靶序列片段的测序鉴定,获得了目的基因敲除的MDCK细胞系,并分别命名为MDCK-IRGM4-、MDCK-IRGM5-和MDCKIRGM6-。通过western blot检测经γ干扰素诱导条件下的这3种IRGMs基因在敲除细胞系中相应的蛋白表达均为阴性。这3种MDCK细胞IRGMs敲除的细胞系的建立,为进一步研究IRGMs基因在抗细胞内病原微生物感染中的功能奠定了基础。     

利用CRISPR/Cas9编辑系统构建pAPN基因敲除的IPI-2I细胞系

试验旨在采用CRISPR/Cas9技术获得猪氨基肽酶N（porcine aminopeptidase N,pAPN）基因敲除的猪回肠上皮（immortal pig intestinal-2I,IPI-2I）细胞系,进而在细胞水平上研究pAPN在冠状病毒入侵过程中的作用及相互作用机制。本研究将已构建好的靶向pAPN基因第2外显子上的2个sgRNA载体（pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5）共转染IPI-2I细胞。转染48 h后,荧光显微镜下观察IPI-2I细胞绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）和红色荧光蛋白（red fluorescent protein,RFP）的发光情况,并用流式细胞仪收集带有GFP和RFP荧光标记的细胞,用来筛选单克隆细胞。然后取少量单克隆细胞提取DNA,用PCR扩增打靶区域附近的序列,测序鉴定其基因型,以获得pAPN基因敲除的IPI-2I细胞株。选择野生型和pAPN基因纯合片段敲除的IPI-2I细胞,提取细胞总蛋白,通过Western blotting检测pAPN基因敲除前后IPI-2I细胞中pAPN蛋白的表达。结果表明,转染48 h后,通过荧光显微镜可以观察到IPI-2I细胞中大部分细胞能够同时表达GFP和RFP,说明pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5质粒载体已经转入IPI-2I细胞。PCR和测序结果表明,共获得48株片段敲除单克隆细胞（片段敲除效率为15.5%）,其中16株为单等位基因敲除,32株为双等位基因敲除;在32株双等位基因敲除细胞中,有23株细胞为纯合片段敲除。Western blotting结果表明,pAPN基因纯合片段敲除的细胞中检测不到pAPN蛋白的表达。综上,本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统成功构建了pAPN基因纯合敲除的IPI-2I细胞系,为阐明pAPN在冠状病毒入侵过程中的作用机制以及制备猪抗病新品种奠定了基础。     

伪狂犬病病毒在NF-κB家族p65基因敲除细胞系的复制规律研究

试验旨在研究伪狂犬病病毒（PRV）在NF-κB家族p65基因敲除细胞系中的复制规律。利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因定点修饰技术构建猪肺泡巨噬细胞（3D4/21）p65基因稳定敲除细胞系。通过构建p65-sgRNA重组质粒,转染至HEK293T/17细胞,收取慢病毒,感染3D4/21细胞后利用嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7核酸酶检测敲除效率,再通过有限稀释法获得3D4/21-p65^-/-的稳定细胞系。CCK-8试剂盒检测3D4/21细胞中敲除p65基因后对细胞增殖的影响;流式细胞术检测PRV-GFP感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后病毒增殖的差异;实时定量PCR检测PRV感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、TK基因mRNA表达水平及PRV感染细胞诱导的IL-1β和IL-6基因mRNA水平表达的变化;Western blotting检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后子代病毒滴度。结果表明,sgRNA2和sgRNA3的基因编辑效率较高,对其进行克隆化培养进而获得敲除p65基因的稳定表达细胞系;CCK-8试剂盒检测细胞活力表明,p65基因敲除对细胞活力无影响;流式细胞仪检测表明,同一时间点PRV-GFP在3D4/21-p65^-/-中的增殖显著高于对照细胞;实时荧光定量PCR表明在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、TK基因的mRNA表达水平,而抑制了IL-1β、IL-6基因的mRNA表达;Western blotting结果表明,在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定结果表明,同一时间点PRV-QXX在3D4/21-p65^-/-细胞中子代病毒的复制显著高于对照细胞。以上结果均表明,p65基因敲除可促进PRV在3D4/21细胞中复制。     

重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对高致病性PRRSV N蛋白基因表达的抑制作用

构建表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的siRNA重组伪狂犬病病毒3株,将其感染PK-15细胞,在细胞水平上评价重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对N蛋白表达的抑制效果.PCR扩增带CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因,通过酶切将CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因分别插入伪狂犬病病毒转移载体pUSKBH中,构建重组伪狂犬病病毒通用转移载体pUsiRNA.分别用BamH Ⅰ和HindⅢ酶切pUsiRNA,回收后与HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的3个siRNA分子连接,构建表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒表达载体.将鉴定正确的重组伪狂犬病病毒表达载体与伪狂犬病病毒DNA共转染PK-15细胞,经同源重组及噬斑纯化获得表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒株,应用PCR及Southern blot鉴定重组病毒.将HN1株N蛋白基因的真核表达质粒pAcGFP1-N转染PK-15,经筛选获得稳定表达N蛋白基因的细胞.将鉴定正确的表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒接种于稳定表达N蛋白基因的细胞,利用绿色荧光蛋白基因及半定量RT-PCR检测重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA对N蛋白表达的抑制效果.结果显示,PCR扩增到的CMV-siR-NA-poly(A)片段约为0.7kb,新霉素基因约1.5kb.经酶切、PCR及测序鉴定,构建了表达siRNA的通用伪狂犬病病毒转移载体pUsiRNA.经PCR及Southern blot检测,获得了3株表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒gG-/siRNAN1、gG-/siRNAN2和gG-/siRNAN3;经荧光显微镜观察和半定量RT-PCR检测表明,重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA能够显著抑制N蛋白在PK-15细胞中表达,其中gG-/siR-NAN2抑制效果最好.这为深入研究N蛋白基因siRNA抑制HP-PRRSV复制奠定基础,并为HP-PRRSV的防制提供新的思路.     

结核分枝杆菌rv3802c基因双顺反子真核表达质粒的构建及鉴定

为了构建结核分枝杆菌rv3802c基因双顺反子真核表达质粒,本研究利用重叠延伸PCR技术扩增出rv3802c-HisFlag基因片段,将其克隆到真核表达载体pCDNA3.1(+)上,测序验证后,将基因合成的内部核糖体进入位点和增强型红色荧光蛋白基因片段(IRES-DsRed2)定向插入到这个重组质粒上,经酶切鉴定获得双顺反子表达质粒pC3.1-3LHF-Red。将质粒pC3.1-3LHF-Red转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,通过荧光显微镜观察到增强型红色荧光蛋白成功表达;经Western blot分析表明Rv3802c-HisFlag融合蛋白在CHO细胞中获得了表达。结果表明,本研究成功构建了共表达增强型红色荧光蛋白和Rv3802c-HisFlag融合蛋白的双顺反子表达质粒pC3.1-3LHF-Red,为进一步研究结核分枝杆菌Rv3802c蛋白在分枝杆菌感染细胞过程中的作用奠定基础。     

Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D在杆状病毒表达系统中的表达

以Ⅱ亚单纯疱疹毒-2333株(HSV-2)的基因组DNA为模板扩增编码HSV-2糖蛋白D(glyco-protein D)基因,与载体pFastBacⅠ连接,转化E.coilDH5α感受态细胞,经PCR及测序鉴定正确。将pFastBacⅠ-gD重组质粒转座至DH10Bac获得重组穿梭质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Sf9细胞表达重组蛋白,经对表达条件进行优化,SDS-PAGE和Western blot鉴定,成功表达HSV-2 gD蛋白,为下一步的工作奠定了基础。