鸡膜联蛋白A2在DF-1细胞中的表达及亚细胞定位

根据GenBank已发表的鸡膜联蛋白A2(ANXA2)基因序列,设计合成一对特异性引物从DF-1细胞总RNA的反转录产物中扩增鸡ANXA2基因开放阅读框,通过酶切、连接等方法将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1,构建重组真核表达载体pEGFP-ANXA2。利用脂质体转染法将pEGFP-ANXA2转染至DF-1细胞,24 h后分别检测融合蛋白EGFP-ANXA2在细胞中的表达及亚细胞定位情况。结果显示:成功构建了鸡ANXA2基因的重组真核表达载体pEGFP-ANXA2;将其转染DF-1细胞后得到与预期大小相符的EGFP-ANXA2蛋白条带,荧光显微镜观察显示EGFP-ANXA2主要定位在细胞质。研究结果为进一步开展鸡ANXA2在相关家禽病毒复制中的作用研究奠定了基础。     

鸡FOXL2慢病毒载体的构建及鉴定

FOXL2是影响鸡卵巢发育的重要候选基因。为了研究FOXL2基因的功能,研究构建了鸡FOXL2基因真核表达载体并在细胞水平进行初步验证。利用RT-PCR的方法扩增并克隆FOXL2基因,再将FOXL2亚克隆到慢病毒表达载体p LV-CMV-mcs-3xflag-EF1-GFP(简写为p LV),通过脂质体转染p LV-FOXL2转至DF-1细胞,36 h后荧光显微镜下观察细胞是否表达绿色荧光蛋白。结果显示,成功构建了鸡FOXL2基因过表达载体p LV-FOXL2,在荧光显微镜下可观察到DF-1细胞有绿色荧光蛋白的表达。研究结果为进一步研究FOXL2基因在鸡卵巢发育过程中的功能奠定基础。     

禽流感病毒M2蛋白跨膜区基因的缺失

根据禽流感病毒 (AIV ) A/ Chicken/ Korea/ MS96 / 96 (H9N2 )株的核苷酸序列 ,设计并合成引物 ,通过 RT- PCR,从AIV H9N1株感染的 MDCK细胞总 RNA中扩增出 2 94 bp的 AIV全长的 M2基因。通过软件分析其序列中的跨膜区后 ,将其与p GEM- T easy载体连接产物 p GEM- T/ M2为模板 ,通过 PCR扩增出约 90 bp左右 M2的膜外区编码序列和约 16 0 bp左右 M2的胞内区编码序列。将两个扩增产物同时作为模板 ,以 OE- PCR(overlap extension- PCR)扩增出约 2 5 0 bp的缺失跨膜区的 M2基因M2 d。测序结果表明 ,M2 d的序列除在跨膜区以 4个甘氨酸序列替代外 ,其余部分与 M2完全一致 ,由此说明 OE- PCR扩增法成功地将禽流感病毒 M2基因跨膜区缺失     

杏花鸡白细胞介素10(IL--10)基因的克隆及其表达分析

为研究杏花鸡白细胞介素10(IL-10)基因在抵抗鸡球虫病中的作用,应用PCR、基因克隆和测序等技术获得杏花鸡完整的IL-10基因CDS序列,进行杏花鸡IL-10基因CDS序列和核苷酸序列与其他物种间的同源性分析,比较在QM-7成肌细胞、鸡肠上皮细胞IEC、鸡巨噬细胞HD11和鸡成纤维细胞DF-1中IL-10基因的表达差异以及在不同肠道组织中IL-10的表达量差异。结果表明,完整地扩增了IL-10基因的完整CDS序列,发现了3个同义突变(162AG、180TC和303CT)。构建的发育树表明杏花鸡IL-10基因CDS序列和核苷酸序列与红色原鸡、鹌鹑、火鸡和珍珠鸡的同源性最高。IL-10在鸡肠上皮细胞的表达量最高,在盲肠扁桃体中表达量最高。球虫子孢子的入侵导致DF-1细胞和HD11细胞中的IL-10表达量升高。研究结果为IL-10基因在肠道免疫和抵抗球虫病的研究提供理论基础。     

DF-1细胞中TLR7编码基因的敲除及其抗FAdV-4感染的天然免疫应答

旨在构建高质量的禽源细胞系，应用CRISPR/Cas9技术实现鸡胚成纤维细胞(DF-1)的Toll样受体7(TLR7)编码基因的敲除，构建稳定的细胞培养禽腺病毒4型(FAdV-4)增殖体系。采用荧光定量PCR的方法对FAdV-4感染DF-1细胞后先天性免疫信号通路中效应分子进行检测，选择转录水平显著上调的基因TLR7作为研究对象；构建sgRNA载体与Cas9表达载体共转染DF-1细胞，经绿色荧光蛋白(GFP)阳性特征分选单克隆，PCR验证及增毒试验筛选后获得TLR7编码序列敲除的DF-1-TLR7-KO#3单克隆细胞系，命名为DF-1-TLR7-KO细胞。对敲除前后DF-1细胞的天然免疫系统对FAdV-4感染的拮抗效应和病毒在不同细胞中增殖效率的差异进行了研究。结果表明：成功构建的TLR7编码序列敲除的DF-1细胞系，与原始细胞相比病毒增殖能力提高。试验对细胞的天然免疫系统与FAdV-4感染的互作机理进行了初步探索，为更好地研究宿主对病毒入侵的应答机制，提高疫苗生产效能提供了研究基础和生物材料储备。     

猪恒定链的原核表达及其分子结构与功能分析

为研究猪恒定链(Ii)分子结构与功能,通过PCR扩增编码完整Ii及其异构体的基因片段,克隆至T pMD18-T载体,在对目的基因进行测序及分析其基因与编码蛋白分子结构,确定功能域及其分子遗传变异的基础上,构建pET-32a-Ii重组载体,转化BL21进行诱导表达,并分析表达产物的免疫活性。结果显示,PCR扩增了645bp和837bp的Ii及其异构体编码基因,DNA序列分析其编码氨基酸分别为215个和279个,异构体Ii多出了64个氨基酸构成的Tg区;分子结构分析显示,猪Ii分子由胞内区、跨膜区和胞外区3部分组成,包含有内体定位基元、Ii-key、CLIP、TRIM等功能域,其中内体定位基元含有特征性L7I和PML17双亮氨酸基序,Ii-key、CLIP、TRIM氨基酸序列与人和小鼠Ii具有高度一致性。遗传变异分析表明,猪Ii分子与人、小鼠等哺乳动物的Ii同源性为62.7%~95.6%,与鸡、鸭、鸽、鹅等禽类Ii的同源性为48.7%~49.5%;空间结构分析显示,猪Ii有3个相似的α-helix构成,其间间隔由相似氨基酸构成的2个转角,转角关键位点氨基酸具有高度一致性;Ii编码基因在BL21细胞获得了有效表达,目的蛋白大小约41ku,Western blot和免疫荧光检测显示,表达产物具有良好的反应原性。试验成功获得了猪Ii及其异构体编码基因,明确了其功能区、分子遗传变异等特征,诱导表达获得了具有良好免疫活性的Ii重组蛋白,为进一步研究猪Ii分子结构与功能奠定了基础。     

鸡importin β1基因真核表达载体的构建及亚细胞定位

根据GenBank已发表的鸡importinβ1基因序列,设计合成一对特异性引物从重组克隆质粒pCR2.1-importin β1中扩增鸡importinβ1基因开放阅读框,通过酶切、连接等方法将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1构建重组真核表达载体pEGFP-importin β1。利用脂质体转染法将pEGFP-importin β1转染DF-1细胞,24h后分别检测重组蛋白EGFP-importin β1在细胞中的表达及亚细胞定位情况。结果表明,成功构建了鸡importin β1基因的重组真核表达载体pEGFP-importin β1;将其转染DF-1细胞后得到与预期大小相符的EGFP-importin β1重组蛋白条带,荧光显微镜观察显示重组蛋白主要定位在细胞核。研究结果为进一步开展鸡importin β1蛋白与相关家禽病毒蛋白的相互作用研究奠定了工作基础。     

如皋黄鸡新基因LBC多抗的制备及其亚细胞定位

克隆如皋黄鸡LBC(Libichun)基因CDS区,通过GFP-LBC融合蛋白和间接免疫荧光法(IFA)来实现该基因的亚细胞定位,为其基因功能研究奠定基础。提取如皋黄鸡18日龄的鸡胚睾丸RNA,巢式PCR方法扩增LBC基因的CDS区,构建真核表达载体pEGFP-N1-LBC转染DF-1细胞,48h后观察其绿色荧光表达情况,同时制备LBC基因的多克隆抗体,利用IFA标记LBC基因的表达部位。本研究成功克隆出如皋黄鸡LBC基因的完整编码区,成功制备抗体和构建pEGFP-N1-LBC、pcDNA3.0-LBC。GFP-LBC融合蛋白和IFA的结果显示,如皋黄鸡LBC基因在细胞质和细胞核中都有表达,为下一步LBC基因的功能研究奠定了基础。     

鸡RNF165蛋白多克隆抗体制备及其生物信息学分析

【目的】制备鸡环指蛋白165(RNF165)多克隆抗体并对RNF165蛋白进行生物信息学分析,以期为研究鸡RNF165的生物学功能提供参考。【方法】以鸡胚成纤维细胞(DF-1)为试验材料,提取总RNA,反转录获得cDNA,通过PCR扩增RNF165基因,将其连接至pET-28a(+)质粒构建重组表达质粒pET-28a-RNF165。将测序正确的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达,将表达的融合蛋白纯化后按照制定的免疫程序免疫7周龄BALB/c雌鼠。第3次免疫7 d后,分离小鼠血清,用Western blotting检测鼠抗RNF165蛋白多克隆抗体的特异性,间接ELISA法测定其效价。使用在线生物信息学软件对RNF165蛋白理化性质、信号肽、磷酸化位点、亚细胞定位、跨膜结构、二级结构和保守结构域进行分析。【结果】成功扩增得到大小为1 068 bp的RNF165基因。成功构建原核表达载体pET-28a-RNF165,并诱导表达出约43 ku的RNF165蛋白。Western blotting结果显示,制备的鼠抗RNF165蛋白多克隆抗体能特异性识别DF-1细胞中过表达的...     

E3泛素连接酶FBXL8对A亚群禽白血病病毒复制的影响

【目的】制备鸡E3泛素连接酶FBXL8多克隆抗体,探究鸡源FBXL8对A亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup A,ALV-A)在鸡胚成纤维细胞(DF-1)内复制的影响。【方法】以DF-1细胞cDNA为模板,通过PCR扩增FBXL8基因,构建鸡源FBXL8原核表达重组质粒pET-28a-FBXL8,将其转化大肠杆菌表达菌株RIL进行诱导表达及纯化,将表达产物His-FBXL8免疫10月龄新西兰大白兔制备多克隆抗体,利用Western blotting和间接ELISA分别检测抗体特异性及效价;针对已公布的FBXL8基因序列设计过表达引物及靶向FBXL8基因的干扰序列,构建过表达质粒psi-flag-FBXL8及干扰质粒pLKO.1-FBXL8-shRNA,使用Western blotting检测其表达效果。将构建成功的过表达质粒和干扰质粒转染DF-1细胞,24 h后感染ALV-A,通过半定量PCR、Western blotting分别检测ALV-A的结构蛋白P27、GP85表达水平。【结果】PCR成功扩增出大小为1 182 bp的FBXL8基因片段,...     

籽鹅与东北白鹅抑制素α-亚基成熟区编码序列的克隆与序列分析

为了成功扩增籽鹅与东北白鹅抑制素(INH)α-亚基成熟区cDNA基因,将籽鹅和东北白鹅编码序列的同源性与NCBI公布的鸡的对应序列进行比较,同源性分别为94.74%、94.44%。结果表明:利用T4 DNA连接酶将经SacⅠ和XhoⅠ酶切后的质粒连接到pET32a中,转化至BL21(DE3)感受态细胞后提取质粒,成功筛选出阳性表达质粒。     

表达H5亚型禽流感病毒不同形式HA基因重组鸭瘟病毒的构建及HA表达形式的鉴定

为研究禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因的信号肽以及跨膜区对HA蛋白在重组病毒中表达的影响,本研究以鸭瘟病毒(DEV)为载体,在DEV基因组的US7和US8基因之间通过同源重组插入去除信号肽或跨膜区的H5N1亚型AIV HA基因编码序列,分别构建了缺失信号肽HA基因的DEV重组病毒(r DEV-PK)和缺失跨膜区HA基因的DEV重组病毒(r DEV-PSM),并传至20代,经PCR对插入的外源基因编码序列扩增及序列测定,表明外源基因能够在重组病毒基因组中稳定存在;间接免疫荧光和western blot鉴定结果表明去除信号肽的HA蛋白能够在重组病毒感染的鸡胚成纤维细胞浆中正确表达,而去除跨膜区的HA蛋白能够在感染细胞的培养液中检测到。本研究为表达H5N1亚型AIV HA基因重组DEV载体弱毒疫苗在鸭体内免疫机制的进一步研究奠定基础。     

牛干扰素诱导跨膜蛋白基因的克隆、序列分析及表达

参照GenBank中牛干扰素诱导跨膜蛋白(bIFITMs)编码序列设计上、下游引物,通过RT-PCR技术扩增目的序列。将扩增产物连接至pMD18-T载体上,测序,使用DNAStar、DNA MAN、MEGA6.0等生物信息学软件对其进行核苷酸、氨基酸序列同源性分析以及关键位点氨基酸比对,并完成进化树的绘制。同时,将测序正确的目的序列进一步亚克隆至真核表达载体pLV-EGFP,转染HEK293T、BHK-21细胞,通过RT-PCR,蛋白免疫印迹(Western blot)验证外源基因在细胞内的表达情况。结果表明,获得bIFITMs编码序列,完成其相关生物信息学分析,同时,成功构建含有bIFITMs编码序列的重组真核表达质粒pLV-bIFITM1、pLV-bIFITM2、pLV-bIFITM3,且在HEK293T、BHK-21细胞中有效表达,为进一步探讨bIFITMs的抗病毒作用以及动物转基因抗病毒育种提供了试验基础。     

利用CRISPR/Cas9技术对鸡AMHR2基因进行精确编辑

为了在鸡基因组上对AMHR2基因进行精确编辑,该研究利用crispr.mit.edu:807网站设计并通过PCR退火拟合获得成对的AMHR2基因靶位点,将靶位点分别整合进pX330-U6-Chimeric_dBsa I-CBh-hSpCas9载体骨架,构建靶向AMHR2基因的成对CRISPR/Cas9敲除载体。将包含成对靶位点的DNA序列整合进pB-CMV-DsRed-CAG-Chimeric.200 bp repeat.Puro-T2A-GFP载体骨架,构建与敲除载体对应的双荧光报告载体。载体测序鉴定正确后分别共转染HEK293T细胞与鸡DF-1细胞,通过细胞荧光粗略判断CRISPR/Cas9系统是否工作。随后,利用Puromycin对基因编辑阳性的DF-1细胞进行药物筛选富集,提取细胞基因组进行TA克隆,进一步检测CRISPR/Cas9系统的工作效率。结果表明靶向鸡AMHR2基因的CRISPR/Cas9敲除系统构建成功,且成对靶位点敲除系统的工作效率高于单一靶位点敲除系统,CRISPR/Cas9敲除系统在DF-1细胞基因组上对AMHR2基因的敲除效率约为60.0%,并在鸡DF-1细胞基因组上实现了AMHR2基因的精确编辑。     

牛卵泡TEDDM1表达特点及其功能分析

旨在研究牛卵泡跨膜附睾蛋白1(transmembrane epididymal protein 1,TEDDM1)的分子特征和立体结构,并结合TEDDM1在不同生理状态牛卵泡的表达特性分析其功能。本研究采集牛发情期第一卵泡波优势卵泡(dominant follicle,DF)和从属卵泡(subordinate follicle,SF),分别分离颗粒细胞(granulosa cells,GCs),提取总RNA后反转录,设计牛 TEDDM 1特异性引物进行PCR扩增、克隆、测序,获得全CDS区后运用生物信息学方法对序列结构进行分析;以牛 RPLP 0作为内参基因,在DF和SF中使用qRT-PCR对 TEDDM 1的表达量进行检测;兔抗TEDDM1一抗检测TEDDM1在牛卵泡中的表达和定位。结果表明, TEDDM 1基因CDS区全长903 bp,编码300个氨基酸,有7次跨膜的α螺旋结构,属于典型的G蛋白偶联受体,该基因氨基酸序列与非洲野牛( Bison bison bison )序列相似性最高,为99.4%;功能域分析表明,TEDDM1分子中存在未知功能结构域,蛋白家族716(domains of unknown function protein families 716,DUF716)结构域。qRT-PCR分析表明, TEDDM 1 mRNA在SF的表达量显著高于DF( P <0.05);免疫组化分析表明,TEDDM1在DF和SF的颗粒层和膜层细胞均有表达,特异性显色强度表明TEDDM1在SF颗粒层和膜层细胞表达量均高于DF。本研究为进一步探讨TEDDM1在牛卵泡发育过程中的调控作用及其在信号转导和激素调节中的功能提供了依据,为后期深入研究牛卵泡发育机理奠定基础。     

CRISPR/Cas9系统在鸡MSTN上的效率验证

随着基因编辑技术的飞速发展,CRISPR/Cas9技术逐渐成为主流。为了验证CRISPR/Cas9系统在鸡基因组上的切割效率,在鸡肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因第1、第2外显子上各自筛选了5个Cas9靶点,构建p X330-sg RNA表达载体;将GFP质粒电转入DF-1细胞,通过检测表达GFP细胞的比例来优化电转程序;将载体用优化后的电转程序电转入DF-1细胞,培养72 h;最后收集细胞提取基因组,通过T7核酸内切酶Ⅰ(T7EⅠ)酶切试验,选出具有Cas9切割效率的靶点片段,将该片段连入p MD19-T载体,测序并分析结果。结果表明CRISPR/Cas9系统可以成功对DF-1细胞基因组进行切割并引入突变,其中1号外显子上4号靶点的突变率为64.3%,2号外显子上2号靶点的突变率为23.3%。研究表明CRISPR/Cas9系统在DF-1细胞中可以有效切割基因组,为CRISPR/Cas9技术应用于鸡的基因组编辑提供科学依据。     

Marc145细胞源LSm1基因的巢式PCR扩增及生物信息学分析

为分析LSm1基因的特点,预测其编码蛋白的生物学功能,试验利用巢式PCR方法对Marc145细胞源LSm1基因进行扩增、克隆及序列测定,应用生物信息学方法对Marc145细胞源LSm1基因进行序列分析,并对其编码蛋白进行二级结构、B细胞表位、保守结构域、跨膜结构域和信号肽预测。结果显示,经过两轮的PCR扩增,成功获得402 bp的Marc145细胞源LSm1基因,编码133个氨基酸。Marc145细胞源LSm1基因核苷酸序列与人类、灵长类同源性较高,其次是海洋哺乳动物类,最后是陆地野生动物及家畜,同源性为92.8%~99.8%,而其编码的氨基酸虽没有此规律,但氨基酸序列同源性均较高,为97.8%~99.3%。系统进化树结果显示,Marc145细胞源LSm1基因与人类LSm1基因亲缘关系较近,处在同一分支,其次是灵长类。LSm1蛋白二级结构中α-螺旋和无规则卷曲所占比例较大,分别为45.11%和24.06%。预测此蛋白存在4个B细胞优势抗原表位,具有Sm超家族保守结构域,无跨膜区域,无信号肽区域。结果表明,LSm1蛋白在细胞内转录及表达水平可能较低,细胞cDNA需通过巢式PCR扩增两轮才能出现目的条带,本试验方法为LSm1基因的扩增提供了参考。同时,LSm1生物学功能预测结果为获得LSm1人工表达蛋白与针对LSm1蛋白的特异性抗体制备,以及在细胞水平研究LSm1的功能机制及其在病毒复制中的作用奠定基础。     

边缘革蜱aqp基因的生物信息学分析及克隆与表达

蜱类水通道蛋白(AQP)是负责胞内外水分子运输的蛋白质，属于内在蛋白超家族成员。该蛋白是一种潜在的抗蜱疫苗候选抗原。为探究边缘革蜱(Dm) AQP (Dm AQP)的生物学特性及其是否具有抗原性，本研究利用PCR扩增Dm两条不同的Dmaqp基因，分别得到582 bp的Dmaqp1基因和1 094 bp的Dmaqp2基因，并将其翻译成相应的蛋白，经各种生物信息学软件分析后显示，Dm AQP1和Dm AQP2蛋白理论等电点分别为4.76和8.65,Dm AQP1有4个跨膜区及1个天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(NPA)结构，Dm AQP2有4个跨膜区以及2个NPA结构；Dm AQP1和Dm AQP2蛋白分别有5个和9个B细胞抗原表位，11个和25个磷酸化位点，两种蛋白均为疏水性蛋白；Dm AQP1和Dm AQP2蛋白二级结构均主要由α-螺旋以及无规则卷曲组成，分别占34.02%、39.69%和32.93%、39.52%。基于Dmaqp1和Dmaqp2基因，从其编码区选择抗原决定簇密集且跨膜区域少的片段进行截短基因的PCR扩增，构建原核表达质粒p ET-32a-jd Dmaqp1和p ET-28a...     

我国东北地区野生鸟类A亚群禽白血病病毒分子流行病学调查及env基因序列分析

为了解野生鸟类禽白血病病毒(ALV)的感染情况,本研究采集了300份野生鸟类样品,将样品处理后接种DF-1细胞,利用p27抗原ELISA、IFA、PCR等方法检测,其中两份样品为ALV阳性并对其env基因扩增.结果表明,其中gp85编码序列与已发表的A亚群ALV (ALV-A)的同源性最高,为91.1％～100％,而与已发表的鸡的B、C、D、E、J亚群ALV的gp85编码序列的同源性仅在28.0 ％～80.3％之间.遗传进化树分析也表明这两份ALV阳性样品的gp85编码序列属于ALV-A.本实验在我国野生鸟类群体中首次分离和鉴定出ALV-A,表明目前我国野生鸟类已经存在A亚群ALV的感染.     

鸡外周血白细胞中Toll样受体的克隆

Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）是近年来发现的先天性免疫跨膜受体和信号转导受体,是病原模式识别（Pathogen-Associated Molecular Patterns,PAMP）受体之一.目前已经识别了10种鸡的Toll样受体（chicken Toll-Like Receptor,chTLRs）.TLRs分布于鸡的不同器官、组织和细胞;由于参与不同的免疫应答,不同的TLR在鸡体中的表达丰度也不相同.本实验,利用RT-PCR方法从三黄鸡外周血淋巴白细胞中扩增出鸡Toll样受体1、4、7基因（TLR1、4、7）.结果显示,扩增出的TLR1基因片段为737 bp,TLR4基因片段为1 246 bp,TLR7基因片段为533 bp,与GenBank中鸡TLR序列同源性达98％～99.8％.