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依据GenBank公布的猪圆环病毒2型Cap基因序列,在保守区域设计特异性引物和TaqMan探针,优化反应体系,建立评价猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒含量的实时荧光定量PCR检测方法,对方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,并验证灭活剂用量和灭活时间对检测结果的影响。结果显示:该方法只对猪圆环病毒2型基因有特异性扩增,其他3种对照病毒基因的扩增结果均为阴性;检测灵敏度达到102.0 TCID50/mL,比普通PCR方法高100倍;方法的重复性好,对同一样品进行10次检测,变异系数为2.28%;不同灭活剂用量和灭活时间对结果的影响较小,不会因各厂家使用的灭活剂用量和灭活时间不同,影响疫苗对比实验的公平性。该研究成功建立了一种评价猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒含量的实时荧光定量PCR检测方法,用于猪圆环病毒2型灭活疫苗样品中病毒抗原含量的定量,其结果可以反映不同猪圆环病毒2型灭活疫苗样品中抗原含量差异,为研究猪圆环病毒2型灭活疫苗病毒抗原含量评估方法提供了新的思路。 相似文献
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根据猪圆环病毒2型(PCV2)Rep基因序列,设计引物及探针,建立了PCV2实时荧光重组酶介导等温扩增(recombinase-aid amplification, RAA)检测方法。该方法能在40℃恒温条件下20 min内对病原进行快速检测,与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪传染性胃肠炎病毒、繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒3型和口蹄疫病毒均无交叉反应;对病毒核酸的最低检测限为21.2 copies/μL。用荧光PCR检测方法与建立的荧光RAA检测方法对66份临床样品进行检测,两种方法符合率为90.09%。结果表明,建立的PCV2实时荧光RAA方法适用于PCV2的快速检测。 相似文献
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分别靶向PRRSV ORF7基因和PCV4 ORF2基因的高度保守区,设计了2对特异性引物,建立了同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒4型(PCV4)的SYBR GreenⅠ-based双重实时荧光定量PCR方法。PRRSV和PCV4在同一样品中的区别在于它们独特的熔解温度(Tm),PRRSV为84.5℃,PCV4为79.0℃,而对其他非靶向的猪常见病毒没有显示特定的熔解峰,且检测极限分别为PRRSV的81.5 copies/μL和PCV4的41.1 copies/μL。采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR和常规PCR方法对30例有呼吸和繁殖衰竭症状的猪临床样本进行检测,检测结果显示,PRRSV阳性率为20.0%(6/30),PCV4阳性率53.3%(16/30),且PRRSV阳性样品中PCV4检出率为50.0%(3/6),较常规PCR检测更灵敏。该方法可能是检测PRRSV和PCV4共感染的一种快速、灵敏和可靠的方法。 相似文献
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为快速检测水貂圆环病毒(MiCV),本试验根据MiCV Cap基因序列设计合成特异性引物,建立了水貂圆环病毒SYBR Green II实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在模板浓度为1.0×106 ~1.0×101 copies/μL范围内呈良好线性关系,相关系数为0.9983。本试验建立的检测方法对水貂阿留申病毒、猪圆环病毒2型、水貂肠炎病毒、犬瘟热病毒和猪伪狂犬病毒进行检测均无特异性扩增,批内和批间CV均小于2%,对重组阳性质粒的检测下限为1.0×101 copies/μL,比普通PCR的敏感度高100倍,对阳性样品DNA的检测下限为2.38×10-2 pg/μL,比普通PCR的敏感度高1000倍。应用该方法对吉林省部分毛皮动物养殖场的水貂、狐狸、貉和环境样品进行检测,结果其阳性率分别为57.23%、48.42%、39.71%和68.48%。上述结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,为MiCV的诊断及流行病学调查提供技术支持。 相似文献
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猪圆环病毒2型LAMP检测方法的建立与评价 总被引:1,自引:0,他引:1
根据猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)Rep和Cap基因保守区设计2对引物,1对外引物和1对内引物;利用设计的4条引物,在Bst大片段聚合酶的作用下,对PCV2 DNA进行恒温扩增;扩增条件为63℃恒温反应1h;建立了PCV2环媒恒温扩增技术(LAMP)检测方法。对检测方法特异性评价表明,检测方法只能检测PCV2 DNA,对猪圆环病毒1型(Porcine circovirus type 1,PCV1)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)及猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)检测无交叉反应。灵敏度评价表明,该检测方法可以检测到样品中10个拷贝的PCV2 DNA含量。 相似文献
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本研究以猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白ORF2基因为目的基因,设计合成特异性引物和探针。PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体,筛选得到标准阳性质粒。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了PCV2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异性强,对猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)等猪常见病原的检测结果均为阴性;与普通PCR方法相比,其敏感性高出100倍,可达100拷贝/μL;对临床样品的检测证明,该方法可有效检测出淋巴结、肺脏等组织中的PCV2。 相似文献
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以胸膜肺炎放线杆菌(App)apx ⅣA基因和猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因为靶基因,分别设计特异性引物和探针,建立App和PCV-2的二重荧光PCR方法。App引物扩增的目的片段大小为132bp,PCV-2为169bp。建立的方法可在同一反应体系中同时对App和PCV-2进行定量检测鉴别,其敏感性分别为1×101拷贝和1×100拷贝,对其他猪病病原核酸的检测为阴性。利用该方法对10份人工感染临床样品进行检测试验,其结果符合率达100%,说明该方法可用于对临床样品中App和PCV-2的检测。 相似文献
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猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法的建立 总被引:2,自引:4,他引:2
通过条件优化,以定量的10倍系列稀释质粒pMD-ORF2(含PCV2-ORF2全基因)为标准品,进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪圆环病毒2型(PCV2)的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为109~100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×106、1.0×105、1.0×104拷贝/μL的标准品的最终实际测得值分别为1.000×106、0.935×105、0.987×104拷贝/μL,变异系数分别为2.527%、2.067%、2.092%。该方法的检测灵敏度与套式PCR(nPCR)相当,甚而高于常规PCR。 相似文献
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建立一种检测PCV3流行毒株感染的PCR方法,并分析Cap基因序列变异情况,为PCV3流行病学调查提供技术支持.根据GenBank中公开的PCV3全基因序列,分别设计了质粒构建引物和检测引物,通过构建阳性质粒、灵敏度试验、特异性试验、临床样品检测试验以及测序分析,建立PCR检测方法.结果显示:建立的PCR方法检测的极限... 相似文献
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为建立同时快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪圆环病毒3型(PCV3)的二重PCR方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV M基因和PCV3 Rep基因高度同源保守序列设计并合成2对特异性引物,分别扩增PEDV M基因与PCV3 Rep基因,经过反应条件优化,建立了检测PEDV与PCV3的二重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:该方法对PEDV和PCV3的检测结果为阳性,而对猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒等8种常见的病原体均未检测到荧光信号;且具有良好的线性关系,R^2为0.99;应用本方法对PEDV和PCV3的最低检出量分别为37.6拷贝/μL和61.2拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于2%。结果表明:本试验建立的PEDV和PCV3二重实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为快速、高效、定量检测PEDV和PCV3提供了技术帮助。 相似文献
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为了建立猪圆环病毒2型(PCV2)SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,采用PCR扩增PCV2 ORF2基因242 bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了PCV2荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.2×101拷贝/μL,与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、乙型脑炎病毒(JEV)核酸均不发生扩增反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明:建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PCV2的检测。 相似文献