K亚群禽白血病病毒CRISPR/Cas13a检测方法的建立及初步应用全文替换

为了快速、准确和简便地检测K亚群禽白血病病毒（ALV-K）,本研究参照GenBank中ALV-K的gp85基因设计了特异的RPA引物和用于LwCas13a反应系统的crRNA,通过优化反应条件建立了检测ALV-K的CRISPR/Cas13a方法,并验证了该方法的特异性、敏感性和符合性。结果显示,该法对感染鸡的其他常见病毒的检测均为阴性,特异性良好无交叉反应;灵敏度为50copies/μL;与PCR的检测结果有很好的符合性。本研究建立的CRISPR/Cas13a检测方法配合试纸条显色在1.5h左右可对ALV-K进行快速的鉴别诊断,为该病的诊断及防控净化提供了强有力的技术支撑。     

猪流行性腹泻病毒RAA-CRISPR/Cas13a检测方法的建立与初步应用

将重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification, RAA)与规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(CRISPR-Cas13a)技术相结合,即RAA-Cas13a,建议建立高效、灵敏、特异的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)检测方法。针对PEDV N基因保守区设计RAA特异性引物和CRISPR RNA(crRNA),利用RAA技术扩增样本核酸,并进行CRISPR-Cas13a荧光检测,以RT-qPCR为对照方法,评价该方法的灵敏度、特异性及与RT-qPCR法的一致性。结果表明,该方法最低可检测至10¹ copies·μL^-1,且与猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒及猪伪狂犬病病毒等常见猪源病原核酸检测无交叉反应。采用RAA-Cas13a检测40份临床样本与RT-qPCR方法阳性符合率为100%,阴性符合率为84.6%,总符合率为95%,Kappa值为0.881。本研究建立的RAA-Cas13...     

应用聚合酶链反应检测鸡传染性贫血病毒

根据鸡传染性贫血病毒（CAV）Cux－1株的基因序列,设计了一对引物,用这对引物对三株CAV的核酸模板进行PCR扩增,结果均能特异性地扩增出420bp的片段,但对其它5种禽病病原体核酸模板的扩增,结果均为阴性,该PCR能检出10fg鸡传染性贫血病毒DNA模板。     

家禽活疫苗中鸡传染性贫血病毒PCR检测方法的建立

为建立不依赖于病毒分离的快速,特异的禽活疫苗中鸡传染性贫血病毒(CAV)监测方法,本研究建立了CAV的PCR检测方法.试验表明:该PCR不仅具有良好的CAV特异性,且检测灵敏度达3.98个TCID50/反应.用该方法监测9份随机抽取的商品禽用活疫苗发现,其中2份活疫苗呈PCR强阳性.以上结果表明,本研究建立的鸡传染性贫血病毒PCR检测方法具有特异、敏感等特点,能用于禽用活疫苗中CAV污染的快速监测.     

应用PCR方法检测鸡传染性贫血病毒

根据发表的鸡传染性贫血病毒(CAV)序列,选择鸡传染性贫血病毒基因组保守区域。设计一对引物,建立了CAV快速诊断的PCR方法。特异性结果说明,该方法对CAV不同毒株均能扩增出明显的特异性条带,而新城疫病毒(NDV)Lasota株、传染性支气管炎病毒(IBV)M41株、鸡马立克氏病病毒(MDV)和鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)扩增结果均为阴性;PCR反应敏感性结果显示．该方法能检测出的DNA最低浓度为O．001pg／μl,可用于临床感染不同年龄鸡群的CAV的检测。     

鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸡传染性贫血病毒基因组保守区域设计1对扩增片段为164 bp的特异性引物,应用SYBR GreenⅠ染料建立了鸡传染性贫血病毒(CIAV)荧光定量PCR检测方法.以本室构建的阳性重组质粒作为模板,制定标准曲线,对CIAV阳性样品进行了敏感性、特异性和重复性、稳定性试验,并应用于临床检测.结果表明引物最佳终浓度为0.2 μmol/L,制作的标准曲线定量浓度范围宽,最低可检测到每个反应相当于10个拷贝的标准品DNA;与IBDV、ARV、MG都不反应;重复性、稳定性试验的变异系数都较小.对保存的25份疑似CIAV样品进行荧光定量PCR检测,结果检出9份阳性.本研究建立的荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上鸡感染CIAV的检测.     

用核酸探针检测鸡传染性贫血病毒

用核酸探针检测鸡传染性贫血病毒许兰菊王丽李慧张书松（河南农业大学牧医工程学院，郑州４５０００２）鸡传染性贫血病（ＣＩＡ）是由鸡贫血病毒（ＣＡＶ）引起雏鸡再生障碍性贫血的一种免疫抑制性疾病。病鸡全身淋巴组织萎缩、皮下和肌肉出血，有较高的死亡率，该病又称...     

鸡传染性贫血病毒的分离鉴定

在山东省从死亡率达７２％,混合感染多种病原微生物的海兰蛋白鸡和艾维茵肉鸡群中分离到３株鸡贫血病毒（ＣＡＶ）这些毒株耐体积分数５０％氯仿和７０℃水浴１５ｍｉｎ,能在ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１的细胞内增殖,用分离的细胞毒接种１日龄ＳＰＦ鸡呈现典型的难传染性贫血特征性的临床症状和病理变化;用间接免疫荧光检查感染的ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１细胞涂片和鸡组织触片,可见特异的核内荧光,分离毒株能被ＣＡＶ－ＴＫ５８０３株抗血清     

鸡传染性贫血病毒的分离鉴定

本试验于１９９２年自东北某地疑似鸡传染性贫血鸡群得到一分离物，该发离物能抵抗７０℃５分钟处理，对氯仿不敏感，不凝集鸡，小白鼠，绵羊红细胞，可引起１日龄ＳＰＦ鸡发病，表现出传染性贫血的特征病变，分离物能被鸡传染性贫血病毒抗血清中和，能在ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１细胞上适应增值并与参考毒ＧｉＦｕ－１，ＣＵＸ－１，ＴＫ５８０３在该细胞培养中产生一致的细胞病变，分离物与参考毒感染的ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１细胞用间接免疫     

应用PCR检测人工感染鸡体内鸡传染性贫血病毒的动态分布

应用聚合酶链反应技术检测人工感染１２周龄ＳＰＦ鸡体内鸡传染性贫血病毒的动态分布结果,感染后第２周可从外周血液白细胞中检出ＣＡＶ－ＤＮＡ,在第３周时达到最高峰,然后逐渐下降,第６周时检出率仅为６．３％,第７周以后均未能从血液白细胞中检测到ＣＡＶ－ＤＮＡ;人工感染后第２－１２周均能从骨髓,胸腺,脾,肾,肝和腔上囊等组织检出ＣＡＶ－ＤＮＡ,其中以骨髓和胸腺的检出率最高,其次脾,肾和肝,腔上囊最低,从１２     

鸡传染性贫血病毒的分子生物学研究进展

鸡传染性贫血病毒(CAV)为圆环病毒科、圆环病毒属,其核酸结构为环状单股DNA、衣壳呈二十面体对称,无囊膜.本文介绍了CAV基因组结构、基因组复制与转录、结构蛋白与功能,以及对该病防治的研究进展,并就该病毒的分子生物学研究前景做了分析.     

PCR和斑点杂交检测鸡传染性贫血病毒

通过聚合酶链反应（ｐｃＲ）扩增鸡传染性贫血病毒（ｃＡＶ）ＤＮＡ特定片段，将此ｐｃＲ产物用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记后作为探针进行斑点杂交，以此检测ＣＡＶ并作流行病学调查。对从江苏省不同地市随机采集的２月龄左右不同疾病的病鸡ＤＮＡ样品进行检测，在被检的５２个不同鸡群来源的病料中，有３６个鸡群来源的病料ＤＮＡ显示ＣＡＶ阳性（群阳性率为６９．２％）；备组织中ＣＡＶＤＮＡ含量有所差异，依次为胸腺＞脾、骨髓、肝＞肾、法氏囊、脑。用ＰＣＲ检测得到的阳性鸡的组织病料感染ＳＰＦ鸡，在感染后第２４天检查，出现贫血症状。初步调查表明，在江苏一些地区ＣＡＶ感染已相当普遍，但它与发病的关系还有待于进一步研究。     

鸡传染性贫血病毒研究进展

对鸡传染性贫血病毒的理化特性、基因组结构及其编码蛋白、复制、致病性和免疫预防与控制措施等进行了概述。     

应用间接免疫荧光抗体技术检测鸡传染性贫血病毒抗体

用MDCC－MSB1细胞增殖鸡传染性贫血病毒（CAV）CuX-1毒株制备抗原,建立了检测CAV抗体的间接免疫荧光的方法。应用该方法检测CAV基因工程亚单位苗首免、二免和三免后鸡体内的CAV抗体,结果表明首免一个月后,鸡血清中CAV抗体的滴度很低或几乎测不到抗体;二免一个月后,鸡血甭中可测到较高的CAV抗体;三免一个月后,鸡血清中的CAV抗体滴度更高。另外,应用此方法调查了某禽场3个批次鸡体内的CAV抗体,其中32日龄黄鸡和1日龄乌骨鸡体内的 CAV抗体为阴性,而1日黄鸡体内的CAV抗体为阳性。     

鸡传染性支气管炎病毒RT-PCR检测方法的初步建立

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchi-tis Virus,IBV)引起的一种急性、高度接触传染性呼吸道疾病。该病给养禽业造成了巨大的经济损失,使感染的肉鸡被淘汰,产蛋鸡产量下降。该病在流行病学、临床症状、病理变化等方面与新城疫等禽病存在着一些相似的地方,有时会给临床诊断带来了一定的困难。目前使用传统方法(如病原分离及血清学方法)进行实验室诊断不仅耗时     

鸡传染性贫血病毒、传染性法氏囊病毒与大肠杆菌混合感染的诊治

鸡传染性贫血与传染性法氏囊病是由病毒感染导致的鸡主要免疫抑制病,雏鸡同时或先后感染此2种病原,即会使二者相互促进,增强感染力和致病力,进一步继发细菌感染,造成严重损失。某个体养殖户鸡群发生以消瘦、贫血为主的鸡病。根据发病特点、临床症状、剖检、实验室检查确诊为鸡传染性贫血病毒、传染性法氏囊病毒与大肠杆菌混合感染。采取及时隔离、加强消毒及饲养管理、选用敏感药物、饲料饮水加药控制继发感染等综合防制措施,有效控制了该病。     

鸡传染性支气管炎病毒纳米PCR检测方法的建立及初步应用

根据鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的3′端非编码区保守区域,设计并合成一对特异性引物,建立IBV纳米PCR检测方法,并进行了特异性、灵敏性和重复性试验,然后将建立的方法进行初步应用。结果显示:该方法特异性良好,能从4种不同基因型IBV核酸样品中检测到约346bp的目的条带,而对禽偏肺病毒、H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、马立克氏病病毒、禽白血病病毒、鸭肝炎病毒等其他病原检测结果均为阴性;敏感性试验表明,纳米PCR的最低检测浓度为1.01×10^-4ng/μL,其敏感性是普通PCR的10倍;重复性试验显示3次均能检出IBV核酸。纳米PCR方法的临床应用表明,送检样品及攻毒鸡样品的检出率分别达到50%(10/20)和60%(30/50),与普通PCR方法检测结果符合率为100%。研究建立的IBV纳米PCR检测方法具有较高的敏感性和良好的特异性,为IBV的临床诊断、病原检测和流行病学调查提供了新的技术手段。     

鸡传染性贫血

鸡传染性贫血 (ＣｈｉｃｋｅｎＩｎｆｅｃ ｔｉｏｕｓＡｎｅｍｉａ，ＣＩＡ)是由鸡传染性贫血病毒 (ＣｈｉｃｋｅｎＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＡｎｅｍｉａＶｉｒｕｓ，ＣＩＡＶ)引起的以雏鸡再生障碍性贫血、全身淋巴组织萎缩、皮下和肌肉出血及高死亡率为特征是一种传染病 ,又称为出血性综合症或贫血性皮炎综合症 ,是继鸡传染性法氏囊病之后又一种重要的免疫抑制性疾病。１病原学ＣＩＡＶ属于环状病毒科病毒基因组由１个单链环状ＤＮＡ组成 ,分子量２．３ｋｄ。纯化病毒仅含一个多肽 ,分子量５０ｋｄ。电镜下ＣＩＡＶ呈球形或六角形 ,直径约为…     

实时荧光定量PCR检测鸡传染性贫血病毒方法的建立

建立了Taqman实时荧光定量PCR方法检测鸡传染性贫血病毒(CAV)。选取CAV病毒的序列设计引物和探针。以梯度稀释的含有CAV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。2.0×105～2.0×102个拷贝,4个数量级的范围内定量PCR有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为200个拷贝。根据病毒拷贝数与定量反应Ct值的关系,绘制了标准曲线。该方法具有特异性,对传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒和马立克病毒核酸都没有扩增反应。采用实时荧光定量PCR方法检测试验感染鸡的肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、法氏囊、泄殖腔棉拭子等样品,所有检测样品都有"S"型扩增曲线,且荧光信号值高。实时定量PCR检测CAV的方法,灵敏度高,特异性好,可以进行定量分析,在禽病的快速检测上具有重要意义。     

鸡传染性支气管炎病毒793/B RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank已发表的鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）793／BS1基因序列，设计1对引物，扩增891bp特异性核酸片段，建立了检测IBV793／B的RT—PCR方法。特异性试验结果表明，IBV793／B能扩增出891bp的核酸片段，而IBVM41H120H52毒株以及新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）、传染性法氏囊病病毒（IBDV）均无特异性条带出现。敏感性试验结果表明，该方法的最低检出量为10pg的模板。上述结果表明，本试验所建立的RT—PCR方法敏感性高、特异性强。利用建立的RT—PCR方法对从山东省分离的8株疑似鸡IBV793／B进行检测，结果7株为阳性。该方法的建立为IBV793／B的诊断及流行病学调查提供了可靠的方法。