不同保种时间及复苏代次弓形虫对小鼠致病性研究

为了评价液氮冻存不同时间后及在小鼠体内复苏不同代次的弓形虫速殖子感染小鼠致病性的研究,通过比较感染处理后的弓形虫小鼠健康及存活状况,筛选出更佳的液氮冻存时间和合适复苏代次,对于建立小鼠急性弓形虫感染模型及弓形虫致病机理等具有重要意义.通过腹腔注射不同保种时间(2、4、6月)和不同复苏代次(1、2、3代)弓形虫速殖子,观...     

TLR2和NLRP3对大肠杆菌诱导的细胞因子分泌、脏器损伤和小鼠死亡的调控作用

大肠杆菌(Escherichia coli)感染宿主时,体内免疫细胞表达的模式识别受体可对其进行识别,进而激活下游炎症信号转导通路,介导细胞因子分泌,从而对炎症反应进行调控。模式识别受体TLR2和NLRP3在大肠杆菌诱导的宿主炎症反应过程中发挥的具体调控作用尚不清楚。本研究分析了致病性大肠杆菌感染小鼠后血清、腹腔灌洗液和腹腔巨噬细胞上清液中促炎性细胞因子(TNF-α和IL-1β)和抗炎因子(IL-10)分泌的情况,以及小鼠组织脏器的损伤水平和存活率。结果显示,大肠杆菌感染小鼠后,TLR2^-/-和NLRP3^-/-小鼠与C57BL/6J小鼠相比死亡更为迅速。此外,大肠杆菌感染C57BL/6J小鼠的血清和腹腔灌洗液中,TNF-α和IL-10的分泌水平显著低于TLR2^-/-和NLRP3^-/-小鼠(P<0.001)。该结果与大肠杆菌感染小鼠腹腔巨噬细胞获得的结果可相互对应。免疫荧光检测结果显示,与野生型C57BL/6J小鼠相比,大肠杆菌感染TLR2^-/-和NLRP3^-/-...     

7种药物体内外抗弓形虫效果分析

为了初步了解甘草酸、苦参碱、黄芩苷、硝唑尼特、巴龙霉素、磺胺嘧啶钠和磺胺氯吡嗪钠7种药物抗弓形虫的效果,进行体外、体内抗弓形虫试验。采用MTT法首先测定试验药物对培养巨噬细胞(Ana-1)的安全浓度,然后用弓形虫RH株的速殖子感染培养的上述细胞,加入药物继续培养48 h后观察药物体外抑制虫体在细胞内的增殖,以相对弓形虫抑制率为指标判断体外抗弓形虫效果。用弓形虫RH株速殖子按5×105/只腹腔接种昆明种小鼠,接种后4 h,药物治疗组通过饮水中给药,观察比较给药后感染弓形虫小鼠的精神状态,并记录各组小鼠死亡的时间和数目,每组随机抽选2只小鼠镜检腹腔虫体数量。体外试验结果表明,甘草酸、黄芩苷、磺胺嘧啶钠和磺胺氯吡嗪钠4种药物可显著抑制细胞内弓形虫增殖;体内试验表明,磺胺氯吡嗪钠治疗效果最佳,磺胺嘧啶钠次之,黄芩、苷草再次之,其余药物抗弓形虫作用不明显。     

牛至精油及肉桂精油对弗氏柠檬酸杆菌感染小鼠的预防作用研究

试验旨在研究弗氏柠檬酸杆菌对小鼠的致病性及牛至精油和肉桂精油对小鼠抵抗弗氏柠檬酸杆菌感染的预防效果。致病性试验将30只小鼠随机分为5组，对照组小鼠腹腔注射0.2 mL生理盐水，1/2倍剂量组、1倍剂量组、2倍剂量组、4倍剂量组小鼠腹腔注射2.5×10⁹、5.0×10⁹、1.0×10¹⁰、2.0×10¹⁰ CFU/mL的弗氏柠檬酸杆菌菌液(100μL/g体重)，观察感染后小鼠临床症状及死亡情况。预防试验将30只小鼠随机分为对照组、模型组、牛至精油组、肉桂精油组及复合精油组(牛至精油和肉桂精油组合)。小鼠口服精油7 d后腹腔注射弗氏柠檬酸杆菌，观察小鼠脏器载菌量、空肠炎症细胞因子含量及空肠病理变化。结果显示，小鼠感染弗氏柠檬酸杆菌后出现眼球充血等临床症状后抽搐死亡。精油能够提高小鼠存活率，减少脏器载菌量和炎症细胞因子含量，缓解小鼠肠道损伤。研究表明，弗氏柠檬酸杆菌对小鼠具有较强致病性，精油能够提高小鼠的肠道屏障功能，阻止弗氏柠檬酸杆菌在小鼠肝脏及脾脏的定植，降低小鼠空肠促炎细胞因子的含量，提高小鼠的存活...     

桦褐孔菌多糖对弓形虫感染小鼠基因表达谱的影响

探讨桦褐孔菌多糖对感染弓形虫小鼠基因表达谱的影响,并对其抗虫机理进行分析。BABL/C小鼠腹腔接种RH株弓形虫速殖子103个,建立小鼠弓形虫感染模型。将小鼠随机分成3组:空白对照组、感染对照组、桦褐孔菌多糖治疗组。采集动物肝脏迅速冻存,提取总RNA,检测RNA质量,扩增RNA,进行芯片杂交,扫描后进行数据分析。结果:经SOM分析筛选出桦褐孔菌多糖治疗组的有效差异基因,并对其进行功能注释,分析其治疗弓形虫的主要原因。结果表明:桦褐孔菌多糖可有效治疗弓形虫感染引起的病理损伤,其抗弓形虫机理是通过调节宿主细胞因子水平,促进Th1/Th2平衡,控制Toll样受体信号通路以及对机体整体调控达到抗弓形虫目的。     

氟康唑抗弓形虫速殖子作用的超微结构观察

为探讨氟康唑在体外杀灭弓形虫速殖子的效果,抽取感染弓形虫RH株速殖子小鼠腹水,选择活跃的速殖子并稀释至含虫密度为1×105个/m L,加入氟康唑溶液使其终浓度为1.5 mg/m L,以未加药物的相同腹水作阴性对照,加入阿奇霉素的作为阳性对照。应用透射电镜观察药物作用1小时、4小时时虫体超微结构的变化并拍照。结果表明:随着氟康唑作用时间的延长,弓形虫速殖子超微结构逐渐遭到破坏,细胞内容物外溢,最终崩解死亡。相同时间内阿奇霉素作用的速殖子出现细胞膜结构受损,速殖子从头、尾两端开始断裂。说明氟康唑在体外可以杀死弓形虫速殖子,达到了和阿奇霉素一样的效果,且效果与时间有关。     

弓形虫和新孢子虫交叉反应抗原MIC7A对小鼠的免疫保护效力分析

弓形虫和新孢子虫是两种亲缘关系接近的顶复亚门原虫,二者之间存在一定程度的交叉免疫保护作用,这种作用可能是基于交叉反应抗原产生的。本研究旨在表达并鉴定弓形虫和新孢子虫的交叉反应抗原TgMIC17A,通过将其应用于小鼠的免疫保护试验,评估该抗原对弓形虫和新孢子虫感染产生的交叉免疫保护作用。对TgMIC17A进行基因克隆和原核表达,通过免疫印迹试验鉴定其反应原性和交叉反应性。重组蛋白免疫小鼠后测定血清特异性IgG抗体水平,评价其免疫原性。二免后,分别用1×10³个弓形虫Pru速殖子、1.5×10⁷个新孢子虫Nc1速殖子攻虫,对小鼠的体重变化、存活率进行监测,并在攻虫30 d后检测各组存活小鼠的脑荷虫量,评价TgMIC17A重组蛋白免疫小鼠后对弓形虫和新孢子虫的交叉免疫保护效果。结果显示,rTgMIC17A可以被弓形虫和新孢子虫的阳性血清识别,相较于未免疫组小鼠,免疫组小鼠体内可产生高水平特异性IgG抗体(P＜0.01),且感染弓形虫或新孢子虫的脑荷虫量均显著降低(P＜0.01)。本研究克隆并表达了TgMIC17A,鉴定其为新孢子虫和弓形虫的交叉反应抗原。该抗原可以刺激小鼠产生较好的体液免疫反应,并对弓形虫和新孢子虫的感染产生一定的交叉免疫保护作用,可以为弓形虫和新孢子虫共感染的防治,以及筛选具有交叉免疫保护力的重组疫苗提供可借鉴的研究资料。     

茶树油对三种常见致病菌的体外抑菌活性研究

为了确定茶树油的体外抑菌敏感度和最低体外抑菌浓度,本试验抑菌剂选择茶树油,供试菌选择沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,进行体外抑菌试验,并测定茶树油原液的抑菌圈以及不同稀释度的茶树油和1.5×10⁸ cfu/ml菌悬液混合培养后在600 nm波长处的光密度值。试验结果表明,茶树油在3种细菌中对金黄色葡萄球菌最为敏感,对沙门氏菌和大肠杆菌次之,对3种菌的抑制培养最大突变区间分别为金黄色葡萄球菌2^-3×10^-1～2^-2×10^-1、沙门氏菌2^-4×10^-1～2^-3×10^-1和大肠杆菌2^-7×10^-1～2^-6×10^-1。     

几种药物抗小鼠弓形虫感染的初步效果

为寻找有效的抗弓形虫药物,选择了临床上使用较多的6种药物进行抗小鼠弓形虫感染初步实验。用刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）长宁株（CN株）速殖子,按1×104/鼠腹腔接种昆明系雄性小白鼠,接种后4 h用药组通过灌服或饮水用药,每鼠剂量分别为阿奇霉素（Azithromycin）150、120、90 mg/（kg·d）,泰妙菌素（Tiamulin）100 mg/（kg·d）,克拉霉素（Clarithromycin）15 mg/（kg·d）,磺胺氯吡嗪钠（Sulfachloropyrazine sodium）150、120、90 mg/（kg·d）,甲硝唑（Metronidazole）150 mg/（kg·d）,甲氧苄胺嘧啶（Trimethoprim）10 mg/（kg·d）,连续用药5~6 d,接种后10 d结束实验。结果阿奇霉素、磺胺氯吡嗪钠组的平均存活天数明显高于感染不用药组（P〈0.05）,泰妙菌素、克拉霉素、甲硝唑、甲氧苄胺嘧啶组在所用剂量下的存活天数与感染不用药组无明显差异（P〉0.05）;用药后4－7 d,取腹腔液镜检速殖子,与感染不用药组相比,阿奇霉素组减少70%以上,磺胺氯吡嗪钠组减少99%以上。研究结果提示,磺胺氯吡嗪钠具有良好的抗弓形虫效果,其推荐剂量与用药疗程还有待进一步研究。     

中药复方制剂治疗急性感染弓形虫小鼠的效果研究

观察研制的中药复方制剂治疗急性感染弓形虫小鼠的效果。在测定感染弓形虫小鼠最小致死量的基础上,比较不同剂量的中药复方制剂(35、25和15 g/kg)和磺胺间甲氧嘧啶钠(300、200和100 mg/kg)的疗效。为进一步验证治疗剂量的效果,每只鼠经腹腔感染25个弓形虫速殖子后4 h,鼠逐只经胃灌服25 g/kg中药复方制剂或200 mg/kg磺胺间甲氧嘧啶钠,每日2次,连用5 d,同时设感染不用药组与空白对照组,以小鼠存活率与平均存活时间、腹腔液中虫体数、组织病变程度以及SOD活性等指标评价药物效果。不同剂量治疗效果的比较显示,中药高剂量组、中剂量组与磺胺间甲氧嘧啶钠中剂量组的小鼠存活率、平均存活时间及腹腔液中虫体数相近,三者间差异不显著(P>0.05)。验证试验显示,中药复方制剂组(25 g/kg)与磺胺间甲氧嘧啶钠组(200 mg/kg)的小鼠存活率、平均存活时间、腹腔液中虫体数和血清SOD活性相近,两者间无显著差异(P>0.05),两者均能减轻肝、肺、脾的组织病变。中药复方制剂具有一定的抗弓形虫效果,25 g/kg的剂量效果最佳。     

Chinese1弓形虫对雄性小鼠生殖系统的病理损伤

雄性BALB/c小鼠腹腔注射10~4个绵羊源弓形虫TgSheepCHn1(Chinese1)速殖子,分别采集弓形虫感染后2,4,6,8,10 d(days post infection,DPI)和6周的小鼠血清、睾丸、附睾、输精管、精囊腺、尿道球腺和凝固腺,血清检测睾酮含量,采用HE和IHC染色方法分析生殖系统的病理损伤情况和弓形虫的分布。结果发现,与对照组比较,雄性BALB/c小鼠感染弓形虫后睾酮含量先增加,8 DPI后减少(P0.05)。6 DPI后,小鼠生殖器官出现病理损伤,特点为副性腺生殖器官:睾丸曲细精管内生精细胞层数减少,生精细胞数目减少并且排列紊乱;睾丸和附睾管内精子数量减少,精囊腺内分泌蛋白减少,实质少见炎症反应;精囊腺、尿道球腺和凝固腺上皮细胞变性、脱落。6 DPI后,在各器官均可观察到弓形虫,多分布在被膜疏松结缔组织和间质,且随感染时间延长,弓形虫数量显著增加(P0.05)。感染后6周,睾酮和生殖系统结构未见明显异常表现。结果表明,小鼠感染弓形虫,对睾酮含量影响不明显,但虫体可侵入雄性生殖系统和副性腺,并引起损伤,推测弓形虫急性感染可减弱雄性动物生育功能,并可能通过精液传播。     

猪链球菌2型、7型及9型小鼠感染模型的初步建立

本实验为了研究猪链球菌2型(SS2)、猪链球菌7型(SS7)及猪链球菌9型(SS9)菌株对BALB/c小鼠的致病性,探究BALB/c小鼠作为猪链球菌动物感染模型的可行性以及作为后续实验的依据的可靠性。本研究通过腹腔注射猪链球菌感染BALB/c小鼠,对死亡小鼠进行无菌解剖分离菌株并培养,对培养的菌株进行革兰氏染色法和PCR鉴定;同时利用荧光定量的方法检测各个脏器细菌的载量和组织切片HE染色观察脏器的病理变化。实验结果显示：攻毒的小鼠出现典型的临床症状并死亡,经过实验验证后确定小鼠是由于感染猪链球菌而致病、致死;测定SS2、SS7及SS9的LD₅₀分别为3.7×10⁷、4.1×10⁷、7.9×10⁷ CFU/mL。因此BALB/c小鼠对猪链球菌易感,可以作为实验室研究猪链球菌良好的实验动物。     

GCA对小鼠腹腔巨噬细胞抗氧化作用的影响

以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象,探讨牛羊胆汁提取物甘氨胆酸（glycocholic acid,GCA）的抗氧化作用。将GCA分为1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7 μg/mL 5个质量浓度,与小鼠腹腔巨噬细胞共同孵育24 h后,按照试剂盒说明书提供的方法测定小鼠腹腔巨噬细胞中抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性以及丙二醛（MDA）含量。结果表明,GCA能降低小鼠腹腔巨噬细胞中MDA的含量,同时提高小鼠腹腔巨噬细胞GSH-Px、SOD的活性,从而调节小鼠腹腔巨噬细胞的抗氧化应激水平。该试验结果提示甘氨胆酸具有改善抗氧化应激反应的能力。     

隐性弓形虫感染小鼠诱发急性弓形虫病模型的研究

为建立环磷酰胺诱导隐性弓形虫感染小鼠复发为急桂弓形虫病的模型,20只ICR小鼠腹腔注射弓形虫Prugniaud株包囊10个/只鼠,10只小鼠注射等量无菌PBS.2个月后给所有小鼠每天腹腔注射环磷酰胺100 mg/kg,连续注射14d.隔天监测小鼠体重、全血中白细胞数和弓形虫基因,同时取濒死小鼠肝、脾和肺组织,进行HE染色和免疫荧光检测.结果发现,感染小鼠注射环磷酰胺后第8天开始出现急性弓形虫病的症状；与试验前比较,小鼠体重和白细胞数明显下降；第10天时全血中再次发现弓形虫基因；第10天后濒死小鼠组织中检测到弓形虫基因,HE染色发现明显病理损伤,免疫荧光检测到弓形虫抗原.证明环磷酰胺可成功诱导隐性弓形虫感染小鼠复发为全身性的急性弓形虫病.     

5种中药对急性感染弓形虫小鼠的治疗效果

首先,测定感染小鼠最小致死量;然后,通过体内安全性试验确定各种药物治疗剂量;最后,评价5种中药对急性感染弓形虫小鼠的治疗效果,即:各药物组每只小鼠经腹腔感染25个弓形虫速殖子后4h,小鼠逐只经胃灌服剂量为25g/kg的白牛胆、垂花香薷、黄皮叶或桦褐孔菌,或10.4mg/kg蟾酥、200mg/kg磺胺间甲氧嘧啶钠,每日2次,连用5d,同时设感染不用药组和空白对照组,以小鼠存活率与平均存活时间、腹腔液中虫体数、组织病变程度以及SOD活性等指标评价药物效果。结果显示,磺胺间甲氧嘧啶钠、蟾酥、桦褐孔菌、黄皮叶、白牛胆、垂花香薷组的小鼠存活率分别为66.67%、61.11%、50.00%、5.56%、0%和0%。蟾酥、桦褐孔菌与磺胺间甲氧嘧啶钠组的小鼠平均存活时间、腹腔液中虫体数和血清SOD活性相近,三者间无显著差异(P0.05),均显著好于黄皮叶、白牛胆、垂花香薷和感染不用药组(P0.05)。在磺胺间甲氧嘧啶钠组和蟾酥组在肺脏仅出现肺泡隔毛细血管轻微充血,在肝脏和脾脏无明显病变或病变不明显;桦褐孔菌组的肝脏也无明显病变;其他治疗组的脾脏均有不同程度坏死。结果表明,蟾酥与桦褐孔菌的抗弓形虫效果与磺胺间甲氧嘧啶钠相近,白牛胆、垂花香薷和黄皮叶的抗弓形虫效果不明显。     

腺病毒介导的高效生产水牛转基因胚胎条件的摸索

试验旨在探究腺病毒感染水牛颗粒细胞和胚胎的最佳条件,以提高转基因水牛胚胎的生产效率。以水牛颗粒细胞和体外发育的胚胎为研究对象,分别用0、1×10~0、1×10^-1、1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5 GFU/mL腺病毒感染水牛颗粒细胞,获得最佳感染浓度后,在最佳浓度条件下分别感染24、48、72、96 h,摸索最佳感染时间,用倒置荧光显微镜观察试验结果。利用腺病毒感染水牛颗粒细胞的最佳浓度和时间分别感染2细胞和4细胞期胚胎,对胚胎的最佳感染条件进行摸索,分析胚胎分裂率、囊胚率和转染囊胚率。结果显示,1×10^-2 GFU/mL浓度和48 h感染时间可获得水牛颗粒细胞的最佳腺病毒感染效率。腺病毒感染2细胞和4细胞期无透明带和非完整透明带胚胎后胚胎发绿光,而感染完整透明带胚胎后不发光,2细胞期胚胎感染后停止发育,4细胞期开始感染的非完整透明带胚胎可继续发育至囊胚。于4细胞期分别感染完整透明带组、非完整透明带组和无透明带组水牛胚胎,结果显示,非完整透明带转染组在囊胚率和囊胚转染效率上均优于其他组。综上,非完整透明带,1×10^-2 GFU/mL和48 h为感染浓度和时间,4细胞期为感染起始期的腺病毒介导的水牛转基因胚胎生产方法能够实现目标基因在水牛胚胎中的高效表达,从而达到提高转基因水牛胚胎生产效率的目的。     

磺胺氯吡嗪处理弓形虫速殖子抑制消减文库的构建和初步分析

为了研究和探索磺胺氯吡嗪抗弓形虫的作用机理,构建磺胺氯吡嗪处理弓形虫的抑制性消减文库.将刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH株速殖子腹腔注射(10000个/只鼠)感染昆明系小鼠,大量收集并纯化速殖子.用250 mg/mL磺胺氯吡嗪PBS溶液和PBS分别浸泡速殖子,37℃恒温箱孵育2h,分别提取虫体的总RNA和mRNA,以PBS处理的正常虫体cDNA为驱动组,以药物处理虫体cDNA为实验组,构建药物处理前后弓形虫速殖子的抑制性消减文库,对部分阳性克隆进行测序和序列分析.结果显示,提取的虫体总RNA纯度高,合成的双链cDNA经RsaⅠ酶切反应较完全;从消减文库中随机选择100个阳性克隆进行PCR扩增,其插入片段长度在200～750 bp之间,文库的重组率达93％以上;随机挑取30个阳性克隆进行测序,获得11个单一序列,Blast分析显示有7个单一有效EST序列与已知蛋白质相似性较高.结果表明,已成功构建磺胺氯吡嗪处理弓形虫速殖子的抑制性消减cDNA文库,并对部分阳性克隆进行了初步分析,为深入研究磺胺氯吡嗪的抗弓形虫机制和寻找药物作用的关键靶分子奠定了基础.     

弓形虫能量代谢及营养物质的来源概述

弓形虫病是由弓形虫感染引起的严重人兽共患寄生虫病,对人类健康及畜牧业发展造成巨大威胁.弓形虫通过独特的代谢途径从宿主细胞获得营养物质进而满足其在细胞内增殖及存活.虫体自身的糖酵解及三羧酸循环途径对于其正常生长至关重要,糖酵解关键酶被抑制可促进缓殖子的形成,明确糖酵解及营养物质存储在缓殖子阶段的作用,将有助于揭示包囊形成...     

刚地弓形虫SRS29C核酸疫苗的构建及SRS29C与SAG1联合免疫保护性的比较研究

为了探究刚地弓形虫表面蛋白(surface antigen, SAG)SRS29C基因和SRS29C、SAG1联合基因的核酸疫苗对小鼠急性感染弓形虫的免疫保护效果，试验利用PCR方法扩增了SRS29C基因片段并将其克隆至真核表达载体pEGFP-N1中，构建重组质粒pEGFP-SRS29C,并对该质粒进行酶切鉴定，同时用该质粒对HEK293T细胞进行转染，再用Western-blot方法检测目标蛋白在细胞中的表达情况；用重组质粒pEGFP-SRS29C和pEGFP-SAG1单独免疫或联合免疫小鼠，用ELISA法测定血清IgG水平，CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖能力，流式细胞仪测定CD₄⁺和CD₈⁺T淋巴细胞百分比，ELISA试剂盒检测脾脏细胞因子的表达情况；进行小鼠体内攻虫试验，记录小鼠存活时间。结果表明：成功构建了重组质粒pEGFP-SRS29C,表达的蛋白质大小为66 ku; pEGFP-SRS29C组和联合免疫组与PBS组和空载体组相比血清IgG含量、脾淋巴细胞增殖率、CD4⁺     

弓形虫MORN2基因敲除株的构建及其表型鉴定

本研究旨在构建弓形虫（Toxoplasma gondii）Ⅰ型RH虫株的膜占位与识别联结蛋白2（membrane occupation and recognition nexus protein，MORN2）基因敲除株，探究MORN2基因的表型功能。利用CRISPR/Cas9技术在sgRNA设计网站筛选出以MORN2基因为靶标的sgRNA并设计引物，以pSAG1∷CAS9-U6∷sgUPRT质粒为模板，在Q5酶作用下构建出MORN2靶向CRISPR的质粒；在MORN2靶点两翼约500 bp设计同源臂引物，以pUPRT∷DHFR-D质粒为模板构建含有乙胺嘧啶药物抗性基因（DHFR）的同源片段；将CRISPR质粒与同源片段电转染到弓形虫速殖子中，进行乙胺嘧啶药物筛选、96孔板单克隆筛选及PCR鉴定。结果显示，试验成功获得MORN2基因敲除株，在体外噬斑试验中，该敲除株的生长速度与野生型RH虫株基本一致；在体内感染试验中，分别以100和1 000个敲除株的速殖子腹腔注射小鼠，小鼠的死亡时间与对照组基本一致，说明MORN2基因的缺失几乎不影响RH虫株在体外培养时的生长速度和感染小鼠的毒力。本研究证明了MORN2基因在RH虫株中无表型功能，为进一步探究弓形虫的功能基因奠定了基础。