CRISPR/Cas9体外酶切检测猪生长抑素基因定点修饰靶点活性的研究

本试验旨在通过CRISPR/Cas9体外酶切法检测猪生长抑素(SST)基因定点修饰靶点的活性。试验设计5个长20 bp的单链导向RNA(sgRNA),即SST-sgRNA-g1、SST-sgRNA-g2、SST-sgRNA-g3、SST-sgRNA-g4和SST-sgRNA-g5。化学合成sgRNA寡核苷酸序列,将寡核苷酸序列连接到可同时表达Cas9和sgRNA的质粒中,挑选正确克隆的质粒作为模板进行体外转录形成SST-sgRNA。利用CRISPR/Cas9体外酶切含靶点的DNA片段,根据酶切条带的灰度换算成sgRNA活性。结果显示目的sgRNA寡核苷酸双链成功插入到质粒中且序列正确,以质粒为模板体外转录SST-sgRNA成功。靶位点经Cas9蛋白酶切后与标准sgRNA1和sgRNA2酶切活性作比较,确定靶点SST-sgRNA-g1、SST-sgRNA-g4和SST-sgRNA-g5活性较高,可为在细胞水平、胚胎水平做基因定点修饰提供依据。     

FecB基因作为小尾寒羊多胎候选基因的研究

试验采用已知繁殖性能的33只小尾寒羊母羊(山东梁山和泰安)、14只蒙古羊母羊(甘肃武威)的血样,提取DNA.用FecB基因作为小尾寒羊多胎候选基因进行研究,利用Australian Sheep Gene Mapping Web SiteAF298885引物(BMPR-IB基因,forced-PCR引物,即FecB基因引物)进行PCR扩增,对其PCR产物用AvaⅡ酶切进行酶切鉴定基因型.研究结果表明①小尾寒羊基因型由3种基因型-BB、B+、++组成,其基因型频率分别为0.303 0、0.606 1、0.090 9,突变杂合B+和突变纯合BB为优势基因型、野生型++很低;蒙古羊分别为0、0.071 4、0.928 6;只由两种基因型-++、B+组成,不存在BB型,而且B+频率也很低,未突变野生型-++型为优势基因型.小尾寒羊与蒙古羊在基因型组成上差异均极显著(P＜0.01),这两个品种的多胎表型一致.②小尾寒羊B和+基因频率分别为0.606 1和0.393 9,突变基因B(FecB)为主导基因,蒙古羊分别为0.035 7、0.964 2,蒙古羊以未突变+为主导基因.因此,证明FecB基因是小尾寒羊多胎重要的分子标记,但FecB基因是否是小尾寒羊多胎基因需进一步深入系统研究.③小尾寒羊品种内BB和B+基因型均为多胎表型,通过对小尾寒羊3种基因型第1、2胎次平均产羔数统计发现BB型>B+型>++型,但在研究中发现具有多胎表型而基因型是野生型++的3只小尾寒羊,因此有待进一步研究.     

绵羊FecB基因KASP检测方法的建立及其在肉羊育种中的应用

为了建立绵羊FecB基因检测的竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele-Specific PCR,KASP)方法并对检测反应体系进行优化,试验首先采用基因组PCR产物直接测序法筛选BB、B+和++基因型绵羊个体各3只,然后参照KASP原理及基本反应体系对已知FecB基因型个体进行分析,并通过体系优化建立FecB基因KASP检测方法,最后对不同品种羊FecB基因型多态性进行分析。结果表明:KASP技术能够分辨不同FecB基因型;KASP检测体系优化调整幅度不大;杜泊羊不含有FecB基因,纯种德国肉用美利奴羊(德肉美)和东北细毛羊仅含有稀少的B+基因型个体,德肉美与小尾寒羊杂交羊中尽管++基因型仍然为优势基因型,但BB和B+基因型频率稳步提升,且处于Hardy-weinberg不平衡状态。说明在绵羊高繁殖性状育种中用KASP技术检测FecB基因是可行的。     

策勒黑羊和多浪羊FecB基因多态性及其与产羔数的相关性研究

为了探讨策勒黑羊和多浪羊FecB基因多态性及其与产羔数的相关性,为新疆南疆绵羊多胎品系的选育提供参考,试验以策勒黑羊、多浪羊为研究对象,利用PCR-RFLP技术对这两品种绵羊FecB基因单核苷酸多态性进行检测,同时研究该基因对这两品种绵羊产羔数的影响。结果表明:策勒黑羊FecB基因检测到3种基因型,即BB、B+、++,基因型频率分别为0.14,0.44,0.42,B、+基因频率分别为0.35,0.65;多浪羊FecB基因检测到2种基因型,即B+、++,基因型频率分别为0.52,0.48,B、+基因频率分别为0.26,0.74。基因型为BB型的策勒黑羊平均产羔数为2.87只/胎,显著高于++型(P0.05);基因型为B+型的多浪羊平均产羔数为2.55只/胎,显著高于++型(P0.05)。说明策勒黑羊和多浪羊FecB基因具有多态性,其中BB型、 B+型可用于南疆绵羊多胎品系的分子辅助育种。     

BMPR-IB不同基因型对凉山黑绵羊不同生理时期主要生殖激素的影响

为研究凉山黑绵羊在发情前期、发情期、发情后期和发情间期BMPR-IB基因不同基因型与生殖激素之间的调控关系,利用公羊试情法和外阴部观察法判断发情状态,采集凉山黑绵羊4个时期的颈静脉血,提取DNA,利用PCR扩増、酶切技术、琼脂糖凝胶电泳检测BMPR-IB基因的基因型,通过ELISA技术检测4种主要生殖激素在不同生理时期血液中的含量。结果显示,凉山黑绵羊BMPR-IB基因共有BB型、B+型和++型3种基因型。在发情期,FSH分泌量BB基因型显著高于B+基因型和++基因型（P<0.05）;在发情前期, LH分泌量BB基因型显著高于B+基因型和++基因型（P<0.05）;在发情中期和发情后期, P4分泌量BB基因型大于B+基因型和++基因型,且差异显著（P<0.05）;E2分泌量在4个时期BMPR-IB基因不同基因型之间差异均不显著（P>0.05）。综上,凉山黑绵羊BMPR-IB存在多胎基因,而且有3种基因型;BMPR-IB基因的突变对FSH、LH和P4的分泌有促进作用。     

绵羊主效基因FecB的检测与肉用多羔核心群的建立

基于前期本实验室建立的绵羊多羔性状主效基因FecB高通量检测技术(TaqMan探针法),对10个绵羊群体的16 460只绵羊进行了多羔性状主效基因FecB的检测,结果发现小尾寒羊、湖羊以及滩羊的B等位基因频率与前人实验结果一致,有些群体经过长期选择已处于Hardy-Weinberg不平衡状态(P<0.05);本课题组与多个企业经过长期努力已建立了多个肉用多羔绵羊核心群,通过比较发现BB型绵羊产羔数极显著高于B+型,B+型极显著高于++型,且高繁殖力核心群3种FecB基因型小尾寒羊产羔数高于普通小尾寒羊群体。绵羊多羔性状主效基因FecB的检测和肉用多羔绵羊核心群的建立为绵羊群体改良提供了支撑。     

三江白猪氟烷基因的基因频率分析

本试验随机抽取216头30日龄左右的三江白猪,从外周血液中提取基因组DNA,经纯化后应用所设计的引物进行PCR扩增,酶切鉴定后分析三江白猪氟烷基因(RYR1)的基因与基因型频率。结果表明:PCR反应条件优化后,扩增出659 bp的特异性基因片段,经HhaⅠ和HgiAⅠ两种内切酶消化后,发现三江白猪T/T(Haln/Haln)基因型频率为4.16%;C/C(HalN/HalN)型为88.43%;C/T(HalN/Haln)型为7.41%。HalN基因频率为92.13%,Haln基因频率为7.87%。此结果表明,三江白猪中氟烷敏感基因频率和基因型频率均较低,可以通过标记辅助选择方法很快予以剔除。     

三江白猪氟烷基因频率分析

本试验随机抽取216头30日龄左右的三江白猪,从外周血液中提取基因组DNA,经纯化后应用所设计的引物进行PCR扩增,酶切鉴定后分析三江白猪氟烷基因(RYR1)的基因与基因型频率.结果表明PCR反应条件优化后,扩增出659 bp的特异性基因片段,经Hha Ⅰ和HgiAⅠ两种内切酶消化后,发现三江白猪T/T(Haln/Hal)基因型频率为4.16%;C/C(HalN/HalN)型为88.43%;C/T(HalN/Haln)型为7.41%.HalN基因频率为92.13%,Haln基因频率为7.87%.此结果表明,三江白猪中氟烷敏感基因频率和基因型频率均较低,可以通过标记辅助选择方法很快予以剔除.     

牛FSHR基因5′端侧翼序列的分析和多态性研究

以中国西门塔尔牛基因组DNA为模板，参照绵羊的FSHR基因序列设计和合成引物、PCR扩增获得长度为931bp，包括5′端侧翼797bp和结构基因第一外显子区134bp的牛FSHR基因片段，将该片段克隆于PUC18载体中，作序列分析发现：牛的FSHR基因转录启动子的遗传结构与人和鼠的FSHR基因不同，它的基因转录启动区含有TATA盒和类CAAT盒序列。在检索出的转录调节元件、或特征性序列位点，牛与绵羊在5个序列位点有碱基变异，这可能与牛和绵羊的产仔率高低不同相关，对34头份中国西门塔尔牛的扩增产物，应用PCR－RFLP方法进行多态性分析，TaqⅠ酶切出现了多态性，酶切产物电泳呈现3种基因型，由2种等位基因构成，通过对基因频率和基因型频率在种用公牛，双胎母牛和随机牛类群中分布的比较研究结果，认为该基因与牛的繁殖性状存在连锁相关。     

铜绿假单胞菌oprH基因DNA疫苗的构建与检测

研究旨在构建铜绿假单胞菌oprH基因的DNA疫苗。试验根据GenBank中已发表的铜绿假单胞菌的oprH基因序列,设计合成了一对特异性引物,利用PCR技术由铜绿假单胞菌基因组DNA中扩增获得该目的基因,进行胶回收纯化并与T载体进行连接,经双酶切和PCR鉴定后将重组质粒进行酶切回收目的基因片段,并将其亚克隆于真核表达载体pCAGGS-HA中,以双酶切和PCR方法进行鉴定。结果显示：PCR成功扩增出约600 bp的oprH基因,连接T载体后的重组质粒经双酶切和PCR鉴定,均可获得大小正确的目的基因片段。真核重组载体鉴定结果显示,oprH基因成功克隆于真核表达载体pCAGGS-HA中。研究表明,试验成功构建了oprH基因的DNA疫苗,为进一步研究其免疫效果及铜绿假单胞菌新型疫苗的研制提供参考。     

黄淮山羊微卫星多态性及其与产羔数相关性的研究

以绵羊FecB、GDF9和BMP15为候选基因,同时选择绵羊6号染色体与FecB基因紧密连锁的6个微卫星标记,分析其在黄淮山羊中的多态性及其与产羔数的关系。结果表明:在黄淮山羊中均未发现FecB、GDF9基因和BMP15基因突变。微卫星Lscv043、BMS2508、300U、GC101均为多态位点;而GC101与产羔数具有较强的相关性,在GC1013种基因型中200bp/238bp基因型群体对应的第1胎产羔数和第2胎产羔数均显著高于其他2种基因型群体的对应产羔数(P<0.05);但是各基因型群体之间第3胎产羔数差异不明显;同样基因型200bp/238bp对应群体的平均产羔数极显著高于其他2种基因型群体的平均产羔数(P<0.01)。其他位点的不同基因型群体之间产羔数差异均不明显。这些结果表明,FecB基因所在区域位点对山羊产羔数亦具有一定影响,可以作为山羊早期选育的理论依据。     

CRISPR/Cas9技术在畜禽育种中的研究进展

利用传统方法在畜禽特定基因座上进行基因组修饰时,只能通过在体细胞中进行同源重组再经细胞核移植实现。传统同源重组方法的困难性和低效性阻碍了基因修饰在畜禽遗传育种中的广泛应用。近年来,位点特异性核酸内切酶的发现为靶向基因修饰提供了一条更直接的途径,主要由于这些酶能直接在DNA序列上进行一步式的基因编辑。成簇规律间隔短回文重复序列/Cas关联蛋白9(clustered regularly interspersed short palindromic repeat/CRISPR associated protein 9,CRISPR/Cas9)是一种RNA导向的DNA内切酶,精准定位于特定的靶位点,高效完成RNA导向的DNA识别及编辑。CRISPR/Cas9技术作为精准而强大的第3代基因组编辑工具,已经成功应用于猪、牛、山羊、绵羊和鸡上,这些CRISPR/Cas9基因编辑畜禽可作为研究人或畜禽生理和病理的生物模型、生产功能性蛋白质的生物反应器或器官移植的供体。特别是在畜禽生产方面,CRISPR/Cas9基因编辑可用于改善生产遗传特性及畜产品质量,提高畜禽对疾病的抵抗力。作者对当前畜禽中特定位点基因组修饰的CRISPR/Cas9技术的原理及基因组编辑在畜禽育种中应用的最新进展进行了综述,以期为推进CRISPR/Cas9技术在畜禽育种中的研究提供参考。     

8个繁殖相关基因在利用羔羊超排技术获得的FecB杂交羊卵巢颗粒细胞上的差异表达分析

家畜的繁殖性状是畜牧业重要的经济性状之一,FecB基因是公认的多胎主效基因。本试验以布鲁拉美利奴羊与新吉细毛羊杂交一代为研究对像,对不携带FecB基因(++型)和携带FecB基因杂合型(B+型)的1月龄母羊超数排卵后,采用手术法进行活体采集卵泡液,收集并培养卵巢颗粒细胞,利用实时荧光定量PCR分析++型和B+型卵巢颗粒细胞上BMPR-1B、BMP15、GDF9、GnRHR、LHR、FSHR、ESR、AMH共8个基因表达情况。结果显示:++型和B+型卵巢颗粒细胞的BMPR-1B、GnRHR、LHR、FSHR基因mRNA表达水平差异不显著(P0.05);B+型卵巢颗粒细胞的BMP15、AMH基因mRNA表达水平显著高于++型(P0.05), GDF9、ESR基因mRNA表达水平极显著低于++型(P0.01),ESR基因mRNA表达水平显著高低于++型(P0.05)。本试验对利用羔羊超排技术获得的FecB杂交羊卵巢颗粒细胞繁殖相关基因的表达状况进行了分析,进一步明确了利用羔羊超排技术获得的卵母细胞体外成熟阶段的发育环境,为探讨FecB杂交羊对羔羊超排技术的应答机制、优化卵母细胞体外培养技术提供参考。     

九种微孢子虫核糖体小亚单位RNA(SSUrRNA)基因拷贝数的研究

以已克隆测序的家蚕微孢子虫 (镇江株 ,Nosemabombycis)的核糖体小亚单位RNA(SSUrRNA)编码基因(12 0 5bp)为模板 ,用随机引物合成法标记的探针 ,在与 9种微孢子虫及家蚕基因组DNA的 6种限制性内切酶的酶切产物的Southern杂交图谱中 ,9种微孢子虫基因组DNA酶切产物的杂交图谱极为相似 ,而与家蚕基因组DNA的任何一种酶的酶切产物均无杂交信号 ,表明微孢子虫和家蚕的SSUrRNA基因同源性很低或没有同源性。同时还证实了已克隆的SSUrRNA基因来源于微孢子虫基因组DNA ,不是从家蚕基因组DNA扩增而来。在酶解较为完全的酶切产物的杂交图谱中 ,微孢子虫基因组DNA中SSUrRNA基因的拷贝数至少在 15以上     

东北寒区肉羊新品种群FecB基因鉴定与基因频率分析

本试验旨在对两个东北寒区肉羊新品种群体进行FecB基因鉴定和基因多态性分析。通过提取两个群体个体外周血基因组DNA样品,基因组PCR直接测序和HRM法检验,结果发现两个群体中均含有FecB基因,但无论从基因型频率还是等位基因频率均存在明显差异。首先肉毛兼用型群体只含有少量B+基因型个体,B等位基因频率只有3%左右,且处于Hardy-Weinberg平衡状态。多胎型群体中FecB基因含量则显著提高,BB和B+基因型频率依次上升至7%和25%左右,且处于Hardy-Weinberg不平衡状态,说明FecB基因在该群体中受到较为强烈的选择压力。如需利用两个群体进行兼具产肉性能和高繁殖性能肉羊新品种(系)培育,较为理想的策略是在进一步提升两个群体优良特性的前提下,开展两个群体间杂交。     

绵羊GDF9基因mRNA、DNA和调控区序列克隆及其在11个品种中遗传多态性检测

本研究旨在克隆绵羊生长分化因子9(Growth differentiation factor 9,GDF9)基因mRNA、DNA和调控区全序列,并检测其在11个绵羊品种中的遗传多态性,探究GDF9基因与绵羊多羔性状的关系。首先应用RACE和PCR技术克隆GDF9基因全长序列,其次利用SNaPshot分型技术检测11个绵羊品种GDF9基因遗传多态性。结果显示,克隆获得GDF9基因mRNA全长1 852bp(GenBank序列号:KR063137),编码区两侧翼分别具有5′-UTR58bp(1~58nt)和3′-UTR 432bp(1 421~1 852nt)。进一步克隆获得长为2 898bp的DNA序列和2 304bp的调控区序列,分析发现调控区序列比数据库序列(NC_019462.1)多两个长片段。序列比对发现了已知突变G260A(G1)和调控区新突变-2078CG。分型结果显示,11个绵羊品种均不含FecGE、FecGH、FecGT、FecGF、FecGV突变,而G260A和-2078CG广泛存在于除草原型藏羊外的各绵羊品种中,G260A表现3种基因型(AA、BB和AB),首次在小尾寒羊和山谷型藏羊中检测到BB型突变纯合子。-2078CG也存在3种基因型,基因型结果表明该位点与G260A完全连锁。关联分析结果显示,小尾寒羊AB型产羔数显著高于AA型(P0.05)。本研究完善了绵羊GDF9mRNA、DNA和调控区全长序列,为进一步研究GDF9基因功能奠定了基础。同时在不同绵羊品种中发现了G260A和-2078CG突变,其中G260A作为潜在的有效遗传标记可用于提高绵羊的产羔数。     

乌湖杂交羊GnRHR与INHA基因多态性及其互作效应对产羔数的影响

试验旨在探究GnRHR和INHA基因遗传变异及其互作效应对绵羊产羔数的影响。参考GenBank发布的绵羊GnRHR基因（登录号：AH004943）和牛INHA基因（登录号：U16237）的DNA序列设计引物，采用PCR-SSCP技术检测GnRHR和INHA基因在乌湖羊、湖羊、乌骨绵羊中的遗传多态性，分析多态位点与产羔数的相关性，以及GnRHR和INHA基因间互作效应。结果显示，乌湖羊和湖羊群体GnRHR和INHA基因均存在多态位点，分别检测到GG、GC、CC和AA、AB、BB基因型，乌骨绵羊因样本较少，未发现多态位点。测序发现，GnRHR基因编码区198 bp处发生G→C突变，导致甘氨酸变为精氨酸，为错义突变；INHA基因877 bp处发生T→C突变，为同义突变（仍为天冬氨酸）。遗传学分析显示，GG和AA为优势基因型，G和A为优势等位基因；χ²适合性检验显示，试验羊群体GnRHR和INHA基因型分布处于Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）；分析GnRHR与INHA基因互作效应发现，基因互作效应在乌湖羊和湖羊群体差异显著（P<0.05），ABCC互作基因型互作效应最大，AAGG互作基因型互作效应最小。乌湖羊ABCC互作基因型的平均产羔数比AAGG互作基因型多1.68只，湖羊ABCC互作基因型产羔数比AAGG互作基因型多1.32只，ABCC互作基因型比AB和CC基因型的产羔数都高，表明互作效应与羊产羔数呈正相关。本研究认为，INHA基因T877C位点与GnRHR基因G198C位点互作基因型与绵羊产羔数紧密关联，对试验羊群体产羔数影响显著。     

BMPR-IB基因突变对策勒黑羊产羔数的影响及其遗传规律的研究

研究采用PCR-R FLP方法检测500只策勒黑羊BMPR-IB基因FecB突变的多态性,结果表明:策勒黑羊中FecB突变纯合子、杂合子、野生型的基因型频率分别是0.108、0.442和0.450,卡方适合性检验显示该位点在群体中处于Hard-Weinberg平衡状态。通过对公、母羊及羔羊的基因型分析,发现BMPR-IB基因突变位点(FecB)的遗传完全符合孟德尔遗传规律。最小二乘法分析有产羔记录的354只母羊平均产羔数与FecB基因的相关性,结果显示BB型、B+型与++型母羊产羔数差异极显著(P<0.01),表明BMPR-IB基因FecB突变显著影响了策勒黑羊的产羔数,是策勒黑羊多胎性能的主效基因之一。     

不同绵羊群体多羔主效基因FecB的检测

为分析FecB基因在不同绵羊群体中的分布情况以及对产羔数的影响,利用TaqMan探针分型技术检测了27 774只不同绵羊群体的FecB基因,结合12 304只个体的前3胎产羔数据,探索多羔主效基因FecB在提高绵羊繁殖力方面的重要作用。分型结果显示,湖羊群体含有最高的B等位基因频率,达0.90以上,且随着群体中湖羊血统含量的增加B等位基因频率也增加。湖羊、皮山红羊、杜湖杂交羊、杜湖（♂）×湖羊（♀）杂交羊以及利用湖羊培育的鲁中肉羊FecB基因的不同基因型产羔数间均存在极显著差异（P <0.01）。这不仅展示了FecB基因对于绵羊产羔数的重要影响,也显示出通过引入本土绵羊FecB基因改良肉用品种繁殖力的可行性和潜力。     

黄淮杜泊羊繁殖性能和FecB基因多态性研究

为系统评价黄淮杜泊羊的繁殖性能,本实验对2家黄淮杜泊羊核心育种场1年的繁殖数据进行了统计和分析,并随机采集了145只核心群羊只进行FecB基因多态性分析。结果表明:黄淮杜泊羊性成熟为6～7月龄,年繁殖率为252.82%,羔羊断奶成活率为95.79%,每只母羊年提供断奶羔羊数2.39个;黄淮杜泊羊群体FecB基因存在BB、B+和++3种基因型,其中B+型(杂合型)是群体中的优势基因型,基因型频率为0.606 9;基因型与产羔数关联分析表明,BB和B+基因型产羔数极显著高于++基因型。综上,黄淮杜泊羊具有多胎高繁的特性,在繁殖性能方面符合专门化肉用高繁绵羊品种的标准。