斜纹夜蛾蛋白二硫键异构酶基因的发育表达分析

[目的]分析斜纹夜蛾蛋白二硫键异构酶基因(SlitPDI)的序列特征和发育表达模式,为解析SlitPDI蛋白在斜纹夜蛾生长发育过程中的生理功能提供依据.[方法]采用DNASTAR对SlitPDI基因序列特征和进化关系进行分析,并以实时荧光定量PCR研究SlitPDI基因在斜纹夜蛾2龄、4龄、6龄幼虫及蛹和新羽化雌、雄成虫共6个不同发育时期的相对表达量.[结果]SlitPDI基因编码494个氨基酸,预测该蛋白分子量约55.3 kD,理论等电点(pI)为4.52.氨基酸序列分析结果表明,SlitPDI蛋白序列具有PDI家族的典型特征:在序列的N端及C端均具有二硫键/巯基氧化还原位点-CGHC-.系统发育进化树分析结果表明,SlitPDI蛋白与意大利蜜蜂(Apis mellifera)的PDI蛋白序列一致性最低,为50.2%;与家蚕(Bombyx mori)的PDI蛋白序列一致性最高,为83.4%.斜纹夜蛾不同发育时期的实时荧光定量PCR分析结果表明,SlitPDI基因在4龄幼虫中的表达量最高,其表达量是基准含量2龄幼虫的1.27倍;在刚羽化雌、雄成虫的表达量也较高,分别为基准含量2龄幼虫的1.03和1.12倍.[结论]SlitPDI蛋白属于I类PDI家族蛋白,SlitPDI基因在斜纹夜蛾4龄幼虫和新羽化成虫中的表达量相对较高.     

黄沙鳖抗菌肽cathelicidin基因克隆及表达特征分析

[目的]克隆黄沙鳖cathelicidin基因并分析其组织分布特征及在攻毒后的表达变化,为深入研究cathelicidin功能及在黄沙鳖先天免疫中的潜在作用提供基础数据.[方法]采用RT-PCR结合RACE克隆黄沙鳖cathelicidin基因cDNA全长序列,利用生物信息学分析软件对黄沙鳖cathelicidin基因及其推导氨基酸序列进行结构特征分析,并采用实时荧光定量PCR检测黄沙鳖cathelicidin基因在不同组织中的表达特征及攻毒后的表达变化.[结果]黄沙鳖catheli-cidin基因cDNA序列全长1026 bp(GenBank登录号MK250818),包括483 bp的开放阅读框(ORF)、315 bp的5'非编码区(5'UTR)和228 bp的3'非编码区(3'UTR).黄沙鳖cathelicidin基因cDNA序列编码160个氨基酸,包括氨基端的信号肽区域、含有4个保守半胱氨酸(Cys)残基的cathelin区域及羧基端的成熟肽区域.黄沙鳖cathelicidin基因推导氨基酸序列与中华鳖cathelicidin基因推导氨基酸序列(KY948708.1)的相似性最高,为97.5%;基于cathelicidin基因推导氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示黄沙鳖与中华鳖的亲缘关系最近.黄沙鳖cathelicidin基因在脾脏和肝脏中的相对表达量相对较高,其次是心脏,在脑组织、肾脏、肠道、肌肉、表皮和背甲的相对表达量较低.以温和气单胞菌攻毒后,黄沙鳖脾脏cathelicidin基因相对表达量呈升—降—升—降的波动变化趋势,出现2个峰值(攻毒后第3和36 h),对应的cathelicidin基因相对表达量分别是对照(注射等量无菌生理盐水)的23.1和3.5倍.[结论]黄沙鳖catheli-cidin基因在脾脏和肝脏中高表达量,且可被温和气单胞菌感染诱导,说明cathelicidin基因在黄沙鳖抵抗病原感染过程中发挥重要作用.     

陆川猪IGFBP5基因克隆及其差异表达分析

[目的]克隆陆川猪胰岛素生长因子结合蛋白5(IGFBP5)基因,并明确其在不同猪种中的表达情况,为今后揭示IGFBP5基因在陆川猪肌肉发育中的作用机理提供理论依据.[方法]通过TRIzol法提取陆川猪背最长肌总RNA,反转录合成cDNA后进行PCR扩增,将正确的测序结果采用在线生物信息软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测分析IGFBP5基因在陆川猪和杜洛克猪背最长肌中的表达差异.[结果]陆川猪IGFBP5基因编码区(CDS)序列全长816 bp,编码271个氨基酸,与NCBI上已公布的野猪IGFBP5基因(NM_214099.1)CDS序列相比,存在3处碱基差异,其核苷酸同源性为99.6%.陆川猪IGFBP5氨基酸序列与NCBI上已公布的野猪(NM_214099.1)、牛(NM_001105327.2)、水牛(NM_001290940.1)、马(NM_001308603.2)、人类(NM_000599.3)、猕猴(NM_001284032.1)、小鼠(NM_010518.2)和大鼠(NM_012817.1)IGFBP5氨基酸序列同源性分别为98.9%、98.2%、98.9%、97.4%、96.7%、97.4%、95.2%和95.2%;基于IGFBP5氨基酸序列同源性构建的系统发育进化树也显示,陆川猪与野猪的遗传距离最近.陆川猪IGFBP5蛋白二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成,其中无规则卷曲占比最高,为65.68%;陆川猪IGFBP5蛋白不存在跨膜结构,在第1~20位氨基酸残基存在1个信号肽序列;蛋白修饰结构预测结果表明,陆川猪IGFBP5蛋白存在2个O糖基化位点、2个N糖基化位点和多个潜在磷酸化位点,包含IB保守结构域和Thyro-globulin-1保守结构域.IGFBP5基因在杜洛克猪背最长肌中的相对表达量极显著高于其在陆川猪背最长肌中的相对表达量(P<0.01).[结论]IGFBP5基因保守性较强,其在不同猪种间的差异表达可能是导致猪肉瘦肉率差异的主要原因,可作为陆川猪胴体重和瘦肉率等生长性状的遗传标记予以开发利用.     

广西巴马小型猪ApoA1基因克隆及其生物信息学分析

[目的]克隆广西巴马小型猪载脂蛋白A1(ApoA1)基因并进行生物信息学分析,为后续开展ApoA1基因研究提供基础数据,同时为制作广西巴马小型猪动脉粥样硬化疾病模型打下基础.[方法]以提取的广西巴马小型猪肝脏组织总RNA为模板,运用RT-PCR克隆广西巴马小型猪ApoA1基因序列,以实时荧光定量PCR(qPCR)检测ApoA1基因在广西巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织中的表达情况,并利用MegAlign、ProtParam、SOPMA、Net-Phos、SignalP和SWISS-MODEL等在线分析软件对广西巴马小型猪ApoA1基因进行生物信息学分析及构建系统发育进化树.[结果]广西巴马小型猪ApoA1基因编码区(CDS)序列长795 bp,与普通猪ApoA1基因序列的同源性为99.9%,仅第630处有1个碱基发生同义突变.ApoA1基因在广西巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织中均有表达,且以肝脏中的相对表达量最高、脾脏中的相对表达量最低.广西巴马小型猪ApoA1由264个氨基酸残基构成,其分子式为C1343H2136N376O409S5,蛋白分子量为30254.31 Da,理论等电点(pI)为5.47,属于亲水性蛋白,存在跨膜结构,不存在信号肽,有18处磷酸化位点(丝氨酸磷酸化位点有10处,苏氨酸磷酸化位点有6处,络氨酸磷酸化位点有2处).广西巴马小型猪ApoA1的二级结构中,α-螺旋占79.92%,β-折叠占2.65%,无规则卷曲占11.12%,延伸链占6.31%,属于全α类蛋白.广西巴马小型猪ApoA1氨基酸序列与普通猪的同源性最高,达99.6%;由基于ApoA1氨基酸序列同源性构建的系统发育进化树也可看出,广西巴马小型猪与普通猪的亲缘关系最近.[结论]广西巴马小型猪ApoA1基因保守性强,以在肝脏中的表达量最高,是广西巴马小型猪抗动脉粥样硬化的重要因子,通过敲除该基因可制作广西巴马小型猪动脉粥样硬化疾病模型.     

南方红豆杉MCT基因克隆、功能验证及组织表达特异性检测

[目的]克隆南方红豆杉的2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(MCT)基因(TcMCT),分析其功能,并检测组织表达特异性,为深入研究TcMCT基因在紫杉醇生物合成中的作用机制提供理论依据.[方法]采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得TcMCT基因的cDNA全长序列,对其编码蛋白进行生物信息学分析及亚细胞定位,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测TcMCT基因的组织表达模式,并在大肠杆菌中超表达该基因以验证其功能.[结果]克隆获得的TcMCT基因cDNA序列全长为1293 bp,开放阅读框(ORF)为942 bp,编码313个氨基酸.TcMCT蛋白与其他植物MCT蛋白中均含保守的MEP结合位点和CTP结合位点,但在N端氨基酸序列保守性较差,其中与同为裸子植物银杏GbMCT蛋白的亲缘关系最近,氨基酸序列的相似性为59.3%.TcMCT蛋白的三级结构与AtMCT蛋白相似,均属于同源二聚体.TcMCT蛋白N端含84个氨基酸残基的质体转运肽,且以Arg88作为切割位点,定位于叶绿体中.TcMCT基因在南方红豆杉不同组织中均有表达,在绿色树皮中的相对表达量显著高于其他组织(P<0.05,下同),且在老叶和嫩叶中的相对表达量显著高于茎和根,在茎和根中的表达量极少甚至不表达.大肠杆菌中超表达TcMCT基因可促进β-胡萝卜素大量积累.[结论]不同物种MCT氨基酸序列具有较高的保守性,TcMCT基因具有明显的组织表达特异性,可调控萜类物质如β-胡萝卜素等的生物合成,推测其在紫杉醇生物合成中发挥重要调控作用.     

黄沙鳖β-防御素基因克隆及其表达分析

[目的]明确β-防御素在黄沙鳖先天免疫中的潜在作用,为开展黄沙鳖绿色病害防治及促进其养殖业健康发展打下基础.[方法]运用RACE克隆黄沙鳖β-防御素基因(Hs-BD1)cDNA序列,采用SignalP-5.0、PredictProtein、PSIPRED、Robetta和Clustal X等在线软件进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR检测Hs-BD1基因在黄沙鳖不同组织中的表达特征及细菌感染前后的表达变化.[结果]Hs-BD1基因cDNA序列全长493 bp,包括72 bp的5'非编码区(5'-UTR)、201 bp的开放阅读框(ORF)及220 bp的3'非编码区(3'-UTR).Hs-BD1基因编码66个氨基酸残基,包括22个氨基酸残基组成的信号肽区、3个氨基酸残基组成的前肽区和41个氨基酸组成的成熟肽区.其中,成熟肽区具有6个保守的半胱氨酸残基(31Cys、58Cys、38Cys、52Cys、42Cys和59Cys)及位于C1和C2间的甘氨酸残基(Gly),即Hs-BD1基因属于β-防御素家族.Hs-BD1氨基酸序列与中华鳖β-防御素16的相似性最高(93.9%),基于β-防御素序列相似性构建的系统发育进化树也显示黄沙鳖与中华鳖和西部锦龟聚为一支,其亲缘关系相对较近.6个保守的半胱氨酸残基分别以C1-C5、C2-C4和C3-C6的连接方式形成3个二硫键;Hs-BD1成熟蛋白三级结构是由α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲组成.Hs-BD1基因在黄沙鳖肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中的相对表达量较高,在心脏、肠道、肌肉、脑组织和表皮中的相对表达量均较低;以温和气单胞菌攻毒后,Hs-BD1基因在黄沙鳖脾脏中的相对表达量呈上升—下降—上升—下降的变化趋势,在攻毒后第3和36 h共出现2个表达峰值,对应的相对表达量分别是攻毒前(0 h)的20.8和10.6倍,差异均极显著(P<0.01).[结论]Hs-BD1基因在黄沙鳖的多个组织中均有表达,尤其在肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中的相对表达量较高,且可被温和气单胞菌感染诱导表达,说明Hs-BD1基因在黄沙鳖抵抗病原感染的过程中发挥调控作用.     

绵羊MUSTN1基因的克隆、序列分析及其组织表达

为了探讨绵羊(Ovis aires)MUSTN1基因特征及其在不同发育阶段的背最长肌与股二头肌组织中的表达规律,选取0、2、6、12和24月龄健康绵羊15只,每组3只,采取背最长肌和股二头肌组织,应用分子生物学等方法,对MUSTN1基因CDS区进行克隆,对其进行生物信息学和组织表达分析。结果表明,MUSTN1基因CDS区全序列为248 bp,编码82个氨基酸,其分子量为8.89 ku,等电点为9.93,GC含量大于AT含量,含有5个磷酸化位点、5个N-糖基化位点、1个O-糖基化位点、0个跨膜结构、疏水性蛋白,二级结构主要以无规卷曲为主;与山羊(Capra hircus)该基因核苷酸以及编码氨基酸序列的同源性最高,分别为99.2%、100%,其次为牛(Bos taurus),分别为97.2%、100%。MUSTN1基因在绵羊不同发育阶段(0、2、6、12和24月龄)的背最长肌与股二头肌中均有表达,在背最长肌中,24月龄MUSTN1表达量最高,极显著高于其他月龄(P0.01),0月龄MUSTN1表达量最低,极显著低于2、12月龄(P0.01),显著低于6月龄(P0.05);而在6月龄绵羊股二头肌中MUSTN1表达量最高且极显著高于其他月龄(P0.01),24月龄表达量次之且极显著高于12月龄(P0.01),显著高于0月龄(P0.05)。结论为绵羊MUSTN1基因的编码区序列在物种间具有保守性,且在不同发育阶段的背最长肌和股二头肌组织中均表达,其表达量的高低可能与骨骼肌肉的生长快慢相关。     

陆川猪ANKRD1基因克隆及其表达差异分析

[目的]克隆陆川猪心肌锚蛋白重复域1基因(ANKRD1),并进行生物信息学及组织表达谱分析,为研究ANKRD1在陆川猪机体内的功能作用提供参考依据.[方法]根据NCBI已公布的野猪ANKRD1基因序列(NM_213922.1)设计特异性引物,采用TRIzol法提取陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌和皮下脂肪的总RNA,反转录合成cDNA,并以此为模板进行ANKRD1基因克隆,通过MegAlign、Protaram、Protscale、MHMM Server和Sig-nalP等在线分析软件进行生物信息学分析,最后以实时荧光定量PCR检测ANKRD1基因在陆川猪各组织中的表达情况.[结果]陆川猪ANKRD1基因蛋白编码区(CDS)序列全长960 bp,编码319个氨基酸残基,与NCBI已公布野猪ANKRD1基因(NM_213922.1)的CDS序列存在4处碱基突变,但均为同义突变,二者的ANKRD1氨基酸序列同源性为99.6%.陆川猪ANKRD1基因编码蛋白分子量为36125.70 Da,理论等电点(pI)为7.09,属于稳定蛋白,其二级结构中α-螺旋占46.39%、无规则卷曲占39.81%、β-转角占9.09%、延伸链占4.70%;陆川猪ANKRD1蛋白不存在跨膜结构,也无信号肽,有多个磷酸化位点.陆川猪ANKRD1基因在其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌和皮下脂肪等7个组织中均有表达,其中以心脏中的相对表达量最高,显著高于在其他组织中的相对表达量(P<0.05,下同),在脾脏中的相对表达量最低,显著低于在心脏、肝脏、肺脏和背最长肌中的相对表达量.[结论]ANKRD1基因在陆川猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌和皮下脂肪等组织中均有表达,且存在明显差异,故推测ANKRD1基因在不同组织中发挥不同作用.     

PmC47-8株OmpH蛋白结构的初步预测(英文)

[目的]对牦牛源多杀性巴氏杆菌C47-8株(PmC47-8)OmpH蛋白结构进行初步预测。[方法]对PmC47-8型菌株OmpH基因的测序结果进行在线BLAST比对、信号肽预测、二级结构预测及蛋白特性等方面的分析。[结果]PmC47-8株OmpH基因与已公布的81条OmpH基因相似性在84%～99%间;OmpH蛋白序列中存在信号肽,切割位点在第20号和21号氨基酸残基之间;OmpH蛋白二级结构预测中,折叠结构占49.8%,环状结构占50.2%;推测OmpH蛋白有7个O型糖基化位点,分别是位于第2、45、48、330、716、721、723号位的氨基酸残基,2个N型糖基化位点,即第15和35号位的氨基酸残基。[结论]该研究为牦牛源OmpH基因的免疫研究奠定基础。     

陆川猪MYL9基因克隆及其表达差异分析

[目的]克隆陆川猪肌球蛋白调节轻链9基因(MYL9),并进行生物信息学分析及检测其在不同猪种中的表达差异,为明确陆川猪骨骼肌生长规律及研究MYL9的生理功能打下基础.[方法]根据NCBI上的家猪MYL9基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR克隆陆川猪MYL9基因,利用在线软件对其进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测陆川猪和杜洛克猪背最长肌中MYL9基因的表达情况.[结果]陆川猪MYL9基因编码区(CDS)序列长519 bp,共编码172个氨基酸;与NCBI上已公布的家猪MYL9基因(NM_001244472.1)CDS序列比对,陆川猪MYL9基因存在2处碱基突变,分别是195 bp处C→A和498 bp处T→C,均为同义突变;陆川猪MYL9基因推导氨基酸序列与家猪MYL9基因推导氨基酸序列的同源性最高,为99.6%,与鸡的同源性最低,为88.4%.陆川猪MYL9蛋白存在3个N糖基化位点和15个磷酸化位点,不存在跨膜结构域和信号肽,符合一般EFh-PEF超家族的结构特征.陆川猪MYL9蛋白二级结构中α-螺旋占54.65%,无规则卷曲占35.47%,β-转角占8.14%,延伸链占1.74%.MYL9基因在杜洛克猪背最长肌中的相对表达量极显著高于陆川猪背最长肌(P<0.01).[结论]MYL9基因序列在不同物种中具有较高的保守性,其在10周龄陆川猪背最长肌中的相对表达量极显著低于杜洛克猪,与其在不同猪种背最长肌中的磷酸化程度有关,也说明MYL9基因对猪肌肉生长速度有一定影响.