牛LATS1基因启动子转录调控分析

【目的】探究牛大肿瘤抑制基因1（Large tumor suppressor gene1,LATS1）的组织表达规律,并初步鉴定其启动子区关键转录因子,以期阐明其转录调控机制。【方法】利用荧光定量PCR检测LATS1基因在牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮下脂肪、背最长肌、大肠、小肠、大脑、皱胃及睾丸组织中的相对表达量。克隆牛LATS1基因启动子的全长序列,通过逐段缺失PCR技术扩增7个缺失不同片段的启动子序列,并构建其双荧光素酶报告载体,分别转染小鼠C2C12和3T3-L1细胞系,通过检测不同缺失片段荧光素酶报告载体的活性,确定LATS1启动子核心区域。使用在线软件预测牛LATS1基因启动子核心区域的关键转录因子。【结果】LATS1基因在大脑、背最长肌、大肠、皱胃、肾脏中高表达。克隆了1 950 bp的LATS1基因启动子序列及其7个逐段缺失片段序列,并成功构建了pLATS1-1783/+167、pLATS1-1449/+167、pLATS1-1149/+167、pLATS1-837/+167、pLATS1-555/+167、pLATS1-298/+167和pLATS1-123/+167双荧光素报告载体。检测到牛LATS1基因启动子核心区域位于-298/-123区域。在线软件预测到牛LATS1基因启动子核心区存在肌细胞增强因子2（MEF2A）、转录激活因子5（STAT5）、同源异型盒基因5（HOXA5）、肌细胞决定基因1（Myod1）和靶向叉头框转录因子1（FoxO1）结合位点。【结论】克隆了牛LATS1基因启动子,明确了其核心区位于-298/-123区域;MEF2A、STAT5、HOXA5、Myod1和FoxO1可能对牛LATS1基因转录活性具有重要的调控作用。     

牛Nramp1基因启动子的克隆及其活性分析

 【目的】牛Nramp1基因是主要的抗病候选基因,但其转录调控的分子机制尚不清楚。本研究欲确定牛Nramp1基因的启动子区域,找到启动子核心序列和主要的调控区,探索Nramp1基因表达机制。【方法】采用基因克隆、DNA测序、半定量RT-PCR和荧光素酶报告基因系统等技术手段,构建牛Nramp1基因5′侧翼区长片段及固定3′端的不同节段的pEGFP-N1和/或pGL3重组质粒,分别转染293T和RAW264.7细胞,并进行脂多糖(LPS)诱导,对不同片段的启动子活性进行定性和定量测定。【结果】牛Nramp1基因5′侧翼区长片段具有较强的启动子活性,+58—-89区域具有基本的启动子功能,+58—-1 748启动子活性最强。进一步研究表明,-89—-205 bp区域、 -278—-1 495 bp区域存在着正调控元件,在-205—-278 bp区域内存在着负调控元件;另外,LPS能显著增强启动子活性,其诱导牛Nramp1基因的表达具有细胞特异性和剂量依赖性。【结论】成功构建了含推测的牛Nramp1基因启动子片段的重组报告基因载体, 确定了启动子核心区域和主要的调控区域。     

牛Gtl2基因cDNA序列分析及启动子预测

利用RT-PCR和RACE方法,克隆得到了牛Gtl2基因cDNA全序列,生物信息学分析表明:该序列有8个外显子,含有一个最长645 bp的开放读码框,但没有发现与Kozak规则相匹配的翻译起始序列.Gtl2基因在物种间具有保守性,尤其是第1个外显子表现出了较强的保守性.基因进化树分析表明,牛Gtl2基因与绵羊Gtl2基...     

山羊PRNP基因启动子转录活性研究

【目的】分析山羊PRNP基因启动子活性区域,旨在筛选调节朊蛋白表达水平的关键区域或转录因子,为阐明山羊PRNP基因的表达调控提供理论依据,并为从遗传学角度降低朊蛋白病的发生提供思路。【方法】以山羊PRNP基因序列（GenBank登录号：EU870890）为模板,设计特异性引物,扩增山羊PRNP基因5′侧翼区片段,并将扩增片段克隆至pEASY-T3载体,鉴定为阳性的克隆进行测序;利用生物信息学方法和在线工具进行启动子区域和转录因子结合位点的预测;利用缺失突变技术扩增启动子区不同长度的片段11个,并克隆至pEASY-T3载体后,鉴定为阳性的质粒和pGL3-Basic载体分别用限制性内切酶Mlu I和Bgl II进行酶切,并回收酶切产物;利用T4连接酶进行目的片段与pGL3-Basic连接,鉴定为阳性的荧光素酶报告基因重组质粒进行测序,并提取无内毒素质粒,用脂质体转染法瞬时转染至SH-SY5Y细胞,转染48h后,利用双荧光素酶检测试剂盒进行各缺失突变重组质粒在细胞内的启动活性检测。【结果】成功克隆了山羊PRNP基因5′侧翼区片段,长度为2 332 bp,且该片段含有预测的启动子活性区域、保守的motifs和多个转录因子的结合位点;成功克隆了11个含有不同长度启动子的片段,并与荧光素酶报告基因连接,并构建了目的片段与荧光素酶报告基因的重组质粒;转染时脂质体与DNA的比例为1﹕0.5,萤火虫荧光素酶载体与海肾荧光素酶比例为50﹕1;山羊PRNP基因5′侧翼区存在着核心启动子,启动子活性最强的区域为-519-+82 bp,且在-220-+59 bp这一区域存在着正调控元件,外显子1对启动子活性中起重要的调控作用;4个motifs可能为正调控元件结合位点;在强启动子活性区存在10个Sp1结合位点,2个AP-2 alpha结合位点和1个AP-1结合位点;山羊PRNP基因motif 3和motif 4分别预测为转录因子Foxp3和COE 1的结合位点。【结论】确定了山羊PRNP基因启动子的核心区域（-519-+82bp）,外显子1对启动子活性起重要的调控作用。     

牛MBL1基因启动子区单核苷酸多态性

为研究牛甘露糖结合凝集素1(mannose-binding lectin 1, MBL1)基因启动子区单核苷酸多态性,采用聚合酶链式反应限制片长多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism, SSCP)及直接测序的方法检测了1 073头中国荷斯坦奶牛、69头鲁西黄牛和24头渤海黑牛启动子区-2194(A>C)、-1446(T>C)、-1330(G>A)三个位点的不同基因型分布。结果表明,在-2194位点和-1330位点处渤海黑牛只检测到两种基因型(AA/AC,GG/GA);而鲁西黄牛群体中在-1330位点处没有检测到AA型。三个品种牛群在该三个位点的优势等位基因相同,分别为A、C、G,频率为A(CH 0.900 1/LYC 0.760 9/BBC 0.937 5 )、C(CH 0.604 8/LYC 0.768 1/BBC 0.625)和(CH 0.725 1/LYC 0869 6/BBC 0.895 8)。三个品种牛的优势等位基因相对保守,需进一步研究分析这3个多态位点与牛生产性状的关系。     

FoxO1对牛骨骼肌细胞增殖、凋亡和分化的调控

【目的】骨骼肌是动物机体的重要组成成分,其生长发育直接影响畜禽肉产量,叉头转录因子O1(forkhead box protein O1, FoxO1)作为重要的转录调控因子,其与骨骼肌生长发育密切相关。探究过表达FoxO1对牛骨骼肌细胞增殖、凋亡与分化的作用,为肉牛遗传改良提供基础材料。【方法】采集牛的多个组织样品,提取其RNA并反转录,利用实时荧光定量PCR(qPCR)构建FoxO1组织表达谱。利用酶消化法分离得到牛骨骼肌细胞,通过观察其分化后肌管的形成以及qPCR检测其分化标志基因的表达情况来检验所分离细胞的分化性能。利用免疫荧光技术对牛骨骼肌细胞进行FoxO1亚细胞定位。设计并包装牛FoxO1过表达腺病毒,以提高牛骨骼肌细胞内FoxO1的表达。利用EdU染色检测过表达FoxO1对细胞相对增殖率的影响。利用流式细胞术检测过表达FoxO1对细胞周期分布的影响。利用qPCR检测过表达FoxO1对牛骨骼肌细胞增殖、凋亡和分化相关基因表达水平的影响。【结果】组织表达谱结果显示FoxO1在多个组织中均有表达,其在成年牛的背脂中表达量最高,在背最长肌组织中表达量最低,且FoxO1在犊牛背最长肌...     

基于Illumina平台转录组测序筛选牛卵泡发育调控基因

运用超声波监测技术,采集母牛发情期出现偏差前的第一大卵泡PDF1和出现偏差后的第二大卵泡ODF2,分别分离卵泡颗粒细胞(GCs),构建RNA文库,用Illumina2000测序;测序结果经数据库搜索和差异表达筛选,采用DAVID软件GO和KEGG pathway分析,经Genecards功能查询,筛选牛卵泡发育相关基因。结果表明:数据库搜索共获得35 325个基因,其中有意义的表达基因15 645个,从中筛选获得差异表达基因608个;GO分析表明,608个差异表达基因中参与生物过程的基因占60.46%,细胞组分的基因占20.08%,分子功能的基因占11.46%;KEGG pathway分析表明,608个差异表达基因通过9条信号通路参与牛卵泡发育调控(P0.05),经Genecards功能筛选,共获得11个与牛卵泡发育密切相关的调控基因——SESN3、COL3A1、CCNE1、CAV1、CACNA1H、ITPR1、PIK3R3、MYC、PTGFR、CDK6、GAPDH,它们直接参与细胞增殖分化及信号通路调节。     

小鼠胞内氯离子通道5基因启动子核心功能区域鉴定及转录调控分析

为研究胞内氯离子通道5基因(Chloride intracellular channel 5,CLIC5)广泛参与调节细胞内的各项生理活动与生化反应,并探讨该基因自身的表达调控机制,以小鼠基因组序列为模板,利用PCR技术扩增小鼠CLIC5基因5′上游调控序列,将其插入荧光素酶报告基因表达载体(pGL3-Basic)中,同时采用5′侧翼区缺失的方法构建了7个缺失不同DNA片段的荧光素酶表达载体。重组质粒与海肾荧光素酶载体(phRL-TK)共同瞬时转染HEK-293细胞,经双荧光素酶报告基因活性分析后,确定CLIC5基因的核心启动子区。利用生物信息学方法预测其中转录因子结合位点及启动子区甲基化状况。结果表明,CLIC5基因启动子缺乏TATA盒,但含有典型的GC盒及其他潜在转录因子结合位点;双荧光素酶报告基因活性分析表明,CLIC5基因-329～+1、-624～+1、-917～+1和-2 230～+1区域的启动子活性较高,其中-624～+1区域的启动子活性最强。进一步分析表明,启动子区-624～-329存在负性调控元件,预测存在转录因子结合位点RXR heterodimer binding sites与GC-Box factorsSp1/GC,-420～-283范围内存在CpG岛位点。     

牛FoxO1基因CDS区克隆及其在脂肪细胞分化过程中的表达分析

本试验旨在克隆牛叉头转录因子O1(Forkhead box O1,FoxO1)基因编码区序列并探究其在牛脂肪细胞分化过程中的表达规律。利用PCR扩增牛FoxO1基因CDS区序列,通过生物信息学方法预测牛FoxO1的理化特性和功能,并运用实时荧光定量PCR技术检测牛脂肪细胞不同分化阶段FoxO1和脂肪标志基因PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、FABP4和LPL的表达规律。结果显示,牛FoxO1基因的CDS区全长1 998 bp,编码665个氨基酸,其蛋白分子式为C₃₀₁₆H₄₇₁₁N₈₇₁O₉₇₉S₃₅,理论等电点为6.38。预测发现,FoxO1与脂肪生长发育调控蛋白AKT1、AKT2、AKT3、SIRT1、PRKACA、CDK2和MAPK8等之间存在紧密互作关系。系统进化树结果显示,牛FoxO1进化保守,与亲缘关系较近的绵羊和山羊物种同源性最高。检测牛脂肪细胞不同分化时期基因的时序表达,结果显示,与分化第0天相比,牛FoxO1基因在第6天表达量达到峰值(P<0.01...     

海岛棉GbHCT14基因启动子克隆及上游调控因子筛选

为探究GbHCT14基因CDS区及启动子序列在棉花纤维发育中的作用,通过中国农业科学院棉花研究所数据库检索到GbHCT14基因CDS区及上游非编码区-2 000 bp片段序列,克隆CDS区及启动子,并检测启动子活性。构建cDNA文库,利用酵母单杂交技术筛选阳性克隆,获得候选转录因子,并进行生物信息学分析。结果表明:1)GbHCT14基因的CDS区全长1 144 bp,其翻译产物为亲水性稳定蛋白,预测定位在叶绿体,没有信号肽以及跨膜结构域。2)GbHCT14基因启动子预测到5个MYB结合位点参与植物苯丙烷代谢途径的调节,1个TCA-element参与水杨酸调节,6个ABA响应元件。3)GbHCT14启动子能够驱动GUS蛋白表达,具有启动活性。4)酵母单杂交初步筛选出16个候选基因,包括Gbar_D01G020710、Gbar_A09G017360、Gbar_A09G009680、Gbar_A11G003660、Gbar_A12G004430、Gbar_D04G021210、GbM_D09G1212、GbM_A11G0186、GbM_A03G0171、GbM_A09G1247、GbM_D10G0411、GbM_D10G1024、GbM_D02G1379、GbM_A11G1190、GbM_D12G0471和genome_Gbar-ZJU_D08。利用生物信息学分析预测表明,上述候选基因参与棉花纤维细胞壁的伸长、泛素化反应、细胞分裂、花发育以及果实成熟的过程,其中GbM_A09G1247与WAK2为相似基因,WAK2功能蛋白与果胶结合后促进细胞壁的伸长,而HCT家族基因则是影响果胶合成的关键因素之一。5)GbHCT14和WAK2基因在棉花开花后25 d内高表达,两者在棉花纤维发育调控存在相关性。综上,GbHCT14基因CDS区及启动子序列为首次获得,GbHCT14基因启动子具有启动活性,并且筛选到与裂合酶、转移酶、植物激素、质子泵和功能蛋白相关的16个上游调控的候选转录因子。     

马铃薯转录因子StNAC043基因的克隆及其生理功能分析

为探究马铃薯转录因子StNAC043基因的功能,克隆马铃薯转录因子StNAC043基因,利用农杆菌介导法将其转入马铃薯‘东农310’基因组,使其过量表达。转基因植株经无性系扩繁后,测定转基因株系的根和茎的生长指标、叶绿素相对含量(SPAD)以及荧光参数(F_v/F_m、ETR_max),并以转录组测序结合qRT-PCR验证分析其下游调控基因。结果表明:StNAC043基因过量表达可以显著促进转基因马铃薯根系和茎的生长、显著提高转基因植株叶片SPAD、F_v/F_m、ETR_max;并且转录因子StNAC043可以调控捕光色素结合蛋白基因StCAB1和StCAB2的表达。综上,马铃薯转录因子StNAC043基因对马铃薯幼苗的生长和光合生理调控具有重要作用。     

绵羊繁殖轴相关组织TPH1和TPH2基因表达分析及TPH2基因多态性与产羔数的关系

为探讨TPH1和TPH2基因在绵羊不同繁殖状态下的表达差异及TPH2基因多态性与小尾寒羊产羔数的关系,利用实时荧光定量PCR技术检测该2个基因在不同繁殖状态下成年苏尼特羊(短光照3只,长光照3只)和小尾寒羊(卵泡期3只,黄体期3只)的大脑、小脑、下丘脑、松果体、垂体、卵巢、输卵管、子宫、肾脏和肾上腺等10种组织中的相对表达量;同时采用Sequenom MassARRAY?SNP技术检测TPH2基因单核苷酸多态位点SNP在常年发情绵羊品种(小尾寒羊、湖羊和策勒黑羊)和季节性发情绵羊品种(滩羊、苏尼特羊和草原型藏羊)的多态性,并将基因多态性与小尾寒羊产羔数进行关联分析。结果表明:该2个基因在2个绵羊品种各组织广泛表达,TPH1基因在苏尼特羊下丘脑和松果体中短光照表达量极显著高于长光照(P0.01),在苏尼特羊垂体中短光照表达量显著高于长光照(P0.05),在小尾寒羊垂体和卵巢中卵泡期显著低于黄体期(P0.05);TPH2基因在苏尼特羊卵巢组织长光照下的表达量显著高于短光照(P0.05),TPH2基因在小尾寒羊下丘脑组织中卵泡期的表达量极显著高于黄体期(P0.01)。小尾寒羊中TPH2基因g.107854166CT和g.1078541669CT 2个SNP位点关联分析表明,该2个位点与季节性发情性状和小尾寒羊第1、2以及第3胎产羔数均无显著关联(P0.05)。综上,TPH1和TPH2基因在苏尼特羊绵羊下丘脑和松果体中呈季节性光照节律差异表达,暗示其可能参与季节性发情上游基因的调控,而TPH2基因可能参与调控小尾寒羊下丘脑中激素分泌和卵巢发育,但g.107854166CT和g.1078541669CT不是调控季节性发情和小尾寒羊产羔数的关键位点。     

选择性多聚腺苷酸化及microRNAs对绵羊ACSL1基因表达的影响

为探究长链脂酰辅酶A合成酶(Long-chain acyl-CoA synthetases,ACSLs)在绵羊脂肪组织的表达规律,利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)和双荧光素酶活性检测系统等方法进行研究.结果表明:1)绵羊ACSL1基因因选择性多聚腺苷酸化(Alternative polyadenylation,...     

牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因载体构建与活性检测

【目的】构建牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并检测其在C2C12细胞系中的表达活性。【方法】从牛外周血中提取基因组DNA,通过PCR方法从牛基因组DNA中克隆获得牛ATP5B基因的5′端转录调控区的1 898bp目的片段,通过设计引物逐段缺失后获得7个亚克隆,将其纯化后经SmaⅠ和KpnⅠ双酶切与pGL3-Basic载体连接,连接产物转化感受态细胞DH5α,得到牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,经脂质体基因转染法转染C2C12细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶活性;运用在线软件Gen-omatix和TFSEARCH对ATP5B启动子区序列进行分析。【结果】成功克隆获得7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293、pATP5B-992、pATP5B-678、pATP5B-462和pATP5B-145;通过转染细胞和荧光素酶活性分析,可知构建的重组质粒均有启动子活性,且重组质粒pATP5B-678和pATP5B-462与空载体pGL3-Basic的荧光素酶活性差异极显著。软件分析结果显示,ATP5B基因启动子区域-763~-85bp存在多个重要转录调控元件。【结论】成功构建了7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,且证实-763~-230bp为牛ATP5B基因的核心启动子区域。     

苋菜AtrADH2基因克隆及表达分析

ADH基因在甜菜色素合成酪过程氨酸途径中发挥着重要作用,为探究苋菜酪氨酸途径的关键基因AtrADH2在苋菜中的功能,本研究以'苏苋1号'苏苋2号'苋菜品种为试验材料,利用RT-PCR技术等研究方法克隆获得1个AtrADH2基因(GenBank登录号:MT982371).结果表明:1)苋菜AtrADH2基因的ORF长为...     

梅花鹿茸生长过程中顶端不同组织COL1A1基因启动子DNA甲基化模式及差异分析

为探究COL1A1基因表达的Ⅰ型胶原蛋白α1链在组成生物体结构和骨发育中的重要作用,以梅花鹿茸生长过程的小鞍子（前期）、二杠（中期）和三杈茸（后期）3个典型时期鹿茸顶端组织及其茸皮、间充质、前软骨和软骨4个组织层为试验材料,采用亚硫酸氢盐测序法（BSP技术）,从时空角度研究鹿茸生长过程中顶端不同组织COL1A1基因启动子区DNA甲基化模式及其相互间DNA甲基化差异。结果显示：1)COL1A1基因在前、中、后期的茸皮组织中的甲基化率分别为（9.73±0.92）%、（7.60±0.69）%和（3.73±0.23）%;间充质组织中的甲基化率分别为（3.20±0.40）%、（1.33±0.23）%和（1.60±0.69）%;前软骨组织中的甲基化率分别为（4.67±0.83）%、（2.53±0.46）%和（2.67±0.23）%;软骨组织中的甲基化率分别为（5.60±0.40）%、（2.80±0.40）%和（2.27±0.61）%。2)COL1A1基因启动子区的甲基化区域共有25个CG位点,在17个CG位点上均发生了不同程度的甲基化。3）对COL1A1基因启动子区DNA甲基化差异分析发现,相同时...     

绵羊Izumo1基因多态性及其与产羔数关联分析

为研究Izumo1基因多态性及与产羔数关系,本研究利用PCR和直接测序法对小尾寒羊和苏尼特羊的Izumo1基因DNA序列进行扩增、测序和BLAST分析,并和本课题组前期绵羊重测序数据进行比对,筛选出Izumo1基因SNP位点。同时,采用Sequenom MassARRAY~?技术进行基因分型,并对其SNP位点的基因型和等位基因频率在各群体中的分布进行研究。结果表明:小尾寒羊Izumo1基因DNA全长序列3 385 bp,苏尼特羊Izumo1基因DNA全长序列3 382 bp;筛选出8个Izumo1基因SNP位点,经过初步筛选,将在小尾寒羊、苏尼特羊、滩羊、萨福克羊、杜泊羊、草原藏羊这6个绵羊品种中位点分布没有差异的SNP位点排除,最终筛选获得的g.54412135AG和g.54412107CA 2个位点。Izumo1基因g.54412135AG位点在多羔和单羔绵羊品种中存在GG、GA和AA 3种基因型,G基因为优势等位基因;g.54412107CA在多羔品种中存在CC和CA 2种基因型,而在单羔品种中存在CC、CA和AA 3种基因型,C基因为优势等位基因,其基因型频率和基因频率在单、多羔绵羊群体间的分布差异均极显著(P0.01);群体遗传学分析得出g.54412135AG多态位点在6个品种中的多态信息含量(PIC)都属于低度多态(PIC0.25);g.54412107CA多态位点在杜泊羊中属于中度多态(0.25PIC0.5),在其他5个品种中都属于低度多态(PIC0.25),然而,关联分析发现Izumo1基因g.54412135AG和g.54412107CA位点的不同基因型与小尾寒羊不同胎次产羔数之间不存在显著关联(P0.05)。     

SIRT1基因对牛卵泡颗粒细胞增殖及细胞周期的影响

【目的】探讨沉默信息调节因子1(Silent information regulator1,SIRT1)对牛卵泡颗粒细胞增殖及细胞周期的影响。【方法】选取牛卵巢上直径2～6mm的卵泡,用注射器抽取卵泡中的颗粒细胞,进行体外培养。根据牛SIRT1基因的核苷酸序列,构建了4条干扰载体(shRNA-SIRT1-1597、shRNA-SIRT1-1471、shRNA-SIRT1-1186、shRNA-SIRT1-1306)及1条阴性对照载体(shRNA-NC),利用脂质体将质粒转入牛卵泡颗粒细胞,通过实时荧光定量PCR法筛选出干扰效果最佳的干扰载体用于后续试验。以转染shRNA-SIRT1-1471的颗粒细胞为干扰组,转染sh-RNA-NC的颗粒细胞为阴性对照组,不做处理的颗粒细胞为空白对照组,采用CCK-8法检测转染后24,36,48和60h各组颗粒细胞增殖情况,用流式细胞术检测转染后24,36和48h各组颗粒细胞的细胞周期变化情况。【结果】转染后48hshRNA-SIRT1-1471干扰的颗粒细胞SIRT1表达量显著低于其他处理组(P0.05),故选用shRNA-SIRT1-1471作为最佳干扰载体。转染后24,36,48和60h,干扰组颗粒细胞增殖效果显著高于空白对照组和阴性对照组(P0.05);转染后24～48h干扰组与空白对照组和阴性对照组相比G1期细胞比例显著降低,S期细胞比例显著升高,从而使更多细胞进入M期进行正常的有丝分裂,促进细胞增殖。【结论】SIRT1能抑制牛卵泡颗粒细胞的增殖,并阻滞细胞周期的进程。