梅花鹿鹿茸组织Anxa-1基因cDNA克隆及表达

从梅花鹿(Cervus nippon)鹿茸间充质中成功克隆出包括膜联蛋白A1(Anxa-1)基因全部编码区的c DNA序列,并结合生物学信息方法及实时荧光定量技术对该基因的氨基酸序列及不同生长时期的表达情况进行了分析。结果表明:Anxa-1基因编码346个氨基酸。经生物学信息分析,该基因编码蛋白为稳定蛋白,不具备信号肽,相对分子质量为38 830.4,理论等电点为6.17,一级结构中亮氨酸占最大比例(10.4%)。同源序列比对及系统进化树分析表明,梅花鹿Anxa-1氨基酸序列与藏羚羊(Pantholops hodgsonii)、绵羊(Ovis aries)、山羊(Capra hircus)和水牛(Bubalus bubalis)相似性较高。实时荧光定量RT-PCR分析表明,Anxa-1基因在不同生长时期鹿茸顶端间充质表达存在差异,生长前期的表达量高于中期与后期。     

山羊Eda基因的克隆、序列分析及表达

【目的】克隆山羊Eda基因CDS区全序列,并对其进行序列分析,研究Eda基因在毛囊生长周期不同阶段皮肤组织中的表达规律。【方法】以太行黑山羊为研究对象,采集其毛囊生长休止期、生长期和退行期背部皮肤组织,采用RT-PCR技术克隆山羊Eda基因,通过在线软件Blastn进行基因cDNA序列分析,用SMART进行氨基酸序列分析,利用SWISS-MODEL软件进行蛋白质结构分析;以β-actin为看家基因,采用实时荧光定量PCR技术对 mRNA在毛囊生长不同时期皮肤组织中的表达规律进行分析。【结果】太行黑山羊Eda-A1基因CDS区全长1 176 bp,编码391个氨基酸;Eda-A2比Eda-A1少6个碱基（nt1161-1166）,编码389个氨基酸;山羊Eda蛋白氨基酸序列相似性在不同物种间均大于90%。SMART分析表明,CDS编码的蛋白质包含了TNF、跨膜区以及胶原等结构域。SWISS-MODEL软件预测结果表明,Eda-A2与Eda-A1在蛋白质表面结构上存在明显差异。毛囊退行期的皮肤组织中,Eda mRNA表达量最高,且极显著高于毛囊休止期和毛囊生长期（P＜0.01）,毛囊生长期的表达量中等且显著高于休止期（P＜0.05）,毛囊休止期的表达量较低。【结论】Eda基因CDS区在物种间保守性较强,Eda mRNA在毛囊生长周期不同阶段表达量有差异,推测Eda基因对毛囊生长周期的调控有一定影响。     

雌雄驯鹿茸皮组织ENO1基因cDNA克隆与表达

选用雌、雄驯鹿(Rangifer tarandus)顶端茸皮组织为试验材料,参考Genebank数据库中白尾鹿(Odocoileus virginianus)、牛(Bos taurus)、羊(Ovis aries)等同源物种的ENO1基因序列设计同源引物,采用PCR及T-A克隆技术以雄性驯鹿茸皮组织为材料克隆ENO1基因的c DNA序列,并运用荧光定量PCR技术对ENO1基因在雌、雄驯鹿茸皮组织中的表达量进行对比分析。结果表明:成功克隆获得驯鹿ENO1基因,其编码区片段大小为1 305 bp,共编码434个氨基酸;ENO1基因编码的蛋白的相对分子质量为47 342.09,其二级结构以α-螺旋为主;Blastp比对显示,驯鹿ENO1基因与羊、白尾鹿、牛的同源性最高,均为99%。构建系统进化树发现,驯鹿ENO1基因与白尾鹿的亲缘关系最近,与白头鹰(Haliaeetus leucocephalus)的亲缘关系最远;荧光定量PCR结果显示,ENO1基因在茸皮组织中的表达量在雌、雄之间存在差异,其中在雄性驯鹿茸皮组织中的表达量是雌性驯鹿茸皮组织中的(3.35±0.12)倍。     

大豆GmCYP85A2基因克隆与表达特性分析

【目的】克隆大豆GmCYP85A2基因并进行表达特性分析,为进一步研究GmCYP85A2基因的功能及其对大豆叶柄角的调控机制奠定基础。【方法】以郑豆196作为试验材料,利用同源克隆技术克隆GmCYP85A2基因,对其编码蛋白进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测GmCYP85A2基因在大豆植株不同组织（根、茎、叶片、叶柄、花、花芽和豆荚）及不同光照处理时间（0,4,8,12,16,20,24 h）下叶柄中的相对表达量,分析该基因的表达特性。【结果】成功克隆了大豆GmCYP85A2基因,其长1 524 bp,开放阅读框长1 401 bp,编码466个氨基酸;编码蛋白分子质量为53.4 ku,理论等电点（pI）为9.00,具有典型的P450超家族保守结构和蛋白三级结构,亚细胞定位结果表明该蛋白为分泌型蛋白。启动子分析结果表明,该基因转录起始位置ATG上游2 kb的基因组序列含有多个响应光照以及与生长发育、逆境胁迫相关的顺式作用元件。基因表达特性分析结果表明,GmCYP85A2基因主要在花、花芽、豆荚及叶柄中表达,且以花中的表达量最大;在营养生长时期,叶柄中GmCYP85A2的表达量受光照影响而上调,并伴随着叶柄角的变大。【结论】克隆了大豆GmCYP85A2基因,并研究了该基因的表达特性,分析了其在叶柄角调控中的可能机制。     

鹿茸不同生长期MALAT1基因的差异表达

以不同生长期的鹿茸尖端组织为材料,采用mRNA差异显示技术检测不同生长期鹿茸尖端间充质组织的差异表达基因。对其中一条差异表达片段进行克隆测序分析,得到400 bp左右的片段,与野猪的非编码基因MALAT1有高度同源性,同源性为90%。进一步实时荧光定量RT-PCR鉴定发现,该基因在鹿茸生长发育的前期和中期表达量高于后期,该基因在鹿茸快速生长期的上调表达暗示其在鹿茸生长发育过程中发挥作用,是鹿茸生长发育相关基因的候选基因。     

麦洼牦牛 Hoxa10基因克隆、原核表达及组织表达谱

从麦洼牦牛肾脏组织提取总RNA,以已公布牛 Hoxa10编码区序列设计引物,RT PCR法克隆麦洼牦牛 Hoxa10基因;构建原核表达载体pET 32a(+) Hoxa10,并在大肠杆菌表达系统中表达,SDS PAGE检测融合蛋白;采用RT PCR检测该基因在麦洼牦牛各组织中的表达分布。结果表明：从麦洼牦牛肾脏中克隆 Hoxa10基因的CDs区,大小为285 bp,编码94个氨基酸残基,与牛、猪和绵羊的 Hoxa10同源性高;经IPTG诱导,pET 32a(+) Hoxa10在BL21中可表达1个大小约为28 ku的特异蛋白;在牦牛各组织中,肾脏和肺脏中表达较高,但在心脏表达量极低或不表达。     

羊绒生长期、休止期陕北白绒山羊皮肤组织中KAP9.2和Hoxc13基因的表达

【目的】研究角蛋白相关蛋白9.2基因(KAP9.2)和Hoxc13基因在羊绒生长不同阶段皮肤组织中的表达量对产绒量的影响,为羊绒生长的调控机理研究奠定基础。【方法】以陕北白绒山羊为研究对象,以奶山羊作为对照,利用qRT-PCR方法,检测羊绒生长期和休止期高产、低产绒量陕北白绒山羊皮肤组织中KAP9.2和Hoxc13基因的表达量。【结果】 对于KAP9.2基因,在羊绒生长期高产绒量陕北白绒山羊的相对表达量极显著低于低产绒量陕北白绒山羊（P＜0.01）,而在羊绒休止期高产绒量陕北白绒山羊的相对表达量却显著高于低产绒量陕北白绒山羊和奶山羊（P＜0.05）;对于Hoxc13基因,在羊绒休止期高产和低产绒量陕北白绒山羊的相对表达量极显著高于奶山羊（P＜0.01）。高产和低产绒量陕北白绒山羊皮肤组织中KAP9.2和Hoxc13基因在生长期、休止期平均相对表达量的变化趋势相似,均表现为生长期极显著低于休止期（P＜0.01）。【结论】KAP9.2对绒毛生长有抑制作用;Hoxc13对KAP9.2基因的表达可能具有调控作用。     

团头鲂形态发育相关基因HoxB1b的克隆及功能研究

脊椎动物Hox族基因是一类重要的生长和发育调控基因,它编码具有螺旋—转角—螺旋结构的转录因子,能与下游靶基因特定区域结合并激活表达,从而调节脊椎动物胚胎发育过程中前后轴的形态建成。利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了团头鲂(Megalobrama amblycephala) HoxB1b基因的全长cDNA序列,并研究了该基因的表达模式。结果表明：（1）团头鲂HoxB1b基因cDNA全长为1 479 bp,其中包括一个编码306个氨基酸残基的921 bp阅读框,聚类分析结果表明,该基因与斑马鱼、红鳍东方鲀、青鳉的相似度分别为89%、45%、40%,在脊椎动物中具有一定的保守性;（2）RT-PCR分析结果显示,HoxB1b在团头鲂胚胎发育过程的各时期均有稳定表达,但在成熟卵中未检测到该基因的表达,表明该基因属非母源表达类型。进一步的整胚原位杂交结果显示,HoxB1b在团头鲂不同时期胚胎存在明显的空间表达差异,受精后20 h（20 hours post fertilization, 20hpf)胚胎主要在后脑表达,受精后40 h（40hpf)胚胎除了在后脑表达外,在胸鳍也检测到表达;（3）HoxB1b基因在团头鲂成鱼部分组织或器官中有表达,且在雌雄鱼中基因表达量有一定差别。综上所述,团头鲂HoxB1b基因的功能与胚胎前后轴上的后脑和胸鳍发育密切相关,并在团头鲂成鱼相关组织中具有重要生理功能。     

青海湖裸鲤TNNI1和TNNI2基因克隆及其响应盐碱胁迫的表达研究

【目的】克隆青海湖裸鲤慢收缩骨骼肌型肌钙蛋白I基因(TNNI1)和快收缩骨骼肌型肌钙蛋白I基因(TNNI2),分析其在不同组织及盐碱胁迫环境下皮肤和腹侧肌肉组织中的表达水平,为揭示青海湖裸鲤生长缓慢及恢复青海湖裸鲤鱼类资源提供基础数据。【方法】以青藏高原特有鱼类青海湖裸鲤为研究材料,利用RACE技术克隆TNNI1和TNNI2基因全长cDNA序列,进行氨基酸序列同源性比对;利用实时荧光定量PCR法检测2个基因在青海湖裸鲤鳃、眼、脑、脾脏、肝脏、肠、肾、心、皮肤、腹侧肌肉组织的表达情况,以及盐碱胁迫下腹侧肌肉和皮肤组织中的表达规律。【结果】青海湖裸鲤TNNI1 cDNA序列全长为1 211 bp,其中开放阅读框540 bp,共编码179个氨基酸;TNNI2 cDNA序列全长为737 bp,其中开放阅读框531 bp,共编码176个氨基酸。序列同源性分析发现,青海湖裸鲤TNNI1氨基酸序列与安水金线鲃的同源性高达92.13%,TNNI2氨基酸序列与鲤鱼的同源性最高为92.61%。系统发育树结果显示,从TNNI1氨基酸序列来看,青海湖裸鲤与金线鲃属鱼类、鲫鱼、鲤鱼的亲缘关系较近;从TNNI2氨基酸序列来看,青海湖裸鲤与鲤鱼的亲缘关系最近,其次是鲫鱼和金线鲃属鱼类。TNNI1和TNNI2基因在青海湖裸鲤不同组织中均有表达,且在腹侧肌肉中相对表达量最高。盐碱胁迫条件下,TNNI1和TNNI2基因在肌肉组织中的相对表达量均显著下调;在皮肤组织中TNNI1的相对表达量极显著下调（P＜0.01）,而TNNI2极显著上调（P＜0.01）。【结论】成功克隆了青海湖裸鲤TNNI1、TNNI2基因全长;TNNI1、TNNI2基因在腹侧肌肉组织中高表达,表明其与肌肉组织发育密切相关;盐碱胁迫条件下TNNI1、TNNI2基因在腹侧肌肉组织中的表达均显著下调,提示2个基因表达量降低可能是青海湖裸鲤生长缓慢的重要因素。     

HGF及其受体c-Met基因在损伤修复的马鹿茸组织中的表达特征

为了探求鹿茸损伤修复的分子机制，本试验收集了意外折断修复50 d和65 d后的鹿茸样品，利用qRT-PCR技术和免疫组织化学技术检测HGF和c-Met基因在损伤修复的鹿茸与健康鹿茸组织中的表达。结果表明，HGF及c-Met基因在损伤茸总组织中的相对表达量显著高于健康鹿茸，在茸皮、间充质、软骨和骨四个组织中，茸皮组织相对表达量最高，间充质组织的相对表达量最低；与健康鹿茸组织相比，损伤茸茸皮组织中HGF及c-Met基因的相对表达量极显著降低(P<0.01)，而在损伤茸间充质组织中的相对表达量极显著增加(P<0.01)，损伤茸与健康茸的软骨和骨组织相对表达量差异不显著(P>0.05)。在损伤修复过程中，HGF及c-Met基因随损伤修复进程的继续表达量也随之上升。因此，HGF及c-Met基因对马鹿茸组织损伤修复及再发育可能具有促进作用。     

梅花鹿鹿茸细胞端粒酶活性及其mRNA表达的检测

[目的]研究鹿茸生长期端粒酶的表达,为揭示鹿茸生长发育的调控机制提供了新思路。[方法]在鹿茸快速生长阶段,采用改进的TRAP（端粒重复序列扩增技术）法检测鹿茸顶端增殖区的间充质层、前软骨层和软骨层细胞及下端成熟区的端粒酶活性。同时,采用RT-PCR的方法检测各组织细胞中端粒酶催化亚基（TERT）mRNA的表达水平。[结果]在顶端增生区各组织细胞中均检测到了不同程度的端粒酶活性,间质细胞、前软骨细胞和软骨细胞中的相对端粒酶活力分别为91.2、46.4和13.7,而在成熟区组织中则检测不到端粒酶活性。RT-PCR法检测的各组织细胞中TERTmRNA的表达水平与端粒酶活性检测结果一致。[结论]在鹿茸快速生长阶段,其增殖区表达端粒酶,并且端粒酶活性随组织层细胞的分化程度的增高而逐渐降低,说明端粒酶可能在鹿茸的生长过程中起重要的调控作用。     

鹿茸干细胞内[Na+]测定及其影响因素鉴定

为探索鹿茸的形态发生与鹿茸干细胞(包括发生干细胞和再生干细胞)内[Na~+]的关系有关,以鹿茸干细胞为模型,研究不同干性的哺乳动物干细胞内[Na~+]的差异,并鉴定引起这种差异的电压门控性钠离子通道(NaV)因素。采集并培养具有不同干性的梅花鹿鹿茸干细胞,包括生茸区骨膜细胞(AP细胞,鹿茸发生干细胞)和角柄骨膜细胞(PP细胞,鹿茸再生干细胞,其干性低于AP细胞),以鹿普通脸部骨膜细胞(FP细胞)作为对照,并采用CoroNa染色方法,通过荧光强度来分析不同类型细胞内[Na~+]的差异,结合PCR方法鉴定转录水平上NaV基因的差异,并分别用睾酮和MS-222对细胞进行处理,观测其对细胞内[Na~+]的影响。结果表明:鹿茸干细胞内[Na~+]高于FP细胞,其中AP细胞内[Na~+]高于PP细胞;NaV1.1基因在AP细胞中特异性转录;睾酮对这3种细胞内[Na~+]水平没有显著影响;但是,MS-222处理能够在一定程度上降低细胞内[Na~+]。本研究发现:鹿茸干细胞内[Na~+]与其干性一致,干性高的AP细胞内[Na~+]也相对较高;NaV1.1基因在转录水平上的差异,可能是造成AP细胞内[Na~+]高的主要原因;干扰NaV的MS-222能够在一定程度上降低细胞内[Na~+]。说明哺乳动物器官的发生和再生可能与低等动物器官上的发现类似,都与细胞内[Na~+]有关。     

东北梅花鹿茸不同部位多糖与无机元素质量分数的差异

选取10支东北梅花鹿茸,分别从顶部、上部、中部和基部分腊片、粉片、血片和骨片部位进行取样,对各部位的多糖与无机元素质量分数进行了比较分析。结果表明:各部位间多糖与无机元素质量分数差异极显著或显著。从腊片到骨片部位,多糖、钾和钠的质量分数逐渐降低,钙、磷、镁的质量分数逐渐升高。微量元素铜、锌、铁和锰的质量分数离散性大,无规律性。多糖与钾、钠、钙、磷和、镁质量分数变化的规律性可以作为评价东北梅花鹿茸的内在指标。     

梅花鹿IGF1全长cDNA克隆及在鹿茸组织的表达

为了检测梅花鹿鹿茸组织IGF1基因的mRNA表达水平,利用TRIzol试剂法分别提取鹿茸真皮、间充质、前软骨和软骨组织总RNA,逆转录合成cDNA.根据GenBank已发表的相关序列设计梅花鹿IGFI基因特异引物并克隆IGFI基因,将IGF1基因DNA序列递交GenBank,并利用相对荧光定量Real-time PCR...     

圈养东北马鹿鹿茸生长研究

2012年3月8日至5月22日,对北京动物园圈养的一只雄性东北马鹿鹿茸生长进行了研究。每间隔8～12d对鹿茸进行拍照,按比例测算鹿茸的相对长度,在锯鹿茸当日测定鹿茸重量。结果表明：圈养条件下,东北马鹿鹿茸主干生长随时间变化呈＂S＂型生长曲线,即呈缓慢、快速和减速生长3个阶段。第1阶段为第0～29天,平均生长速度为0.17cm/d;第2阶段为第30～56天,平均生长速度为1.30cm/d;第3阶段为第57天后,鹿茸平均生长速度为0.94cm/d。鹿茸3个阶段生长速率差异显著（P〈0.01）。第72天鹿茸锯下时重量4.0kg,平均增重0.05kg/d;右角主干长度54.5cm,平均生长速度0.76cm/d;左角主干长度56.5cm,平均生长速度0.78cm/d。     

梅花鹿鹿茸软骨细胞的培养及X型胶原的克隆和序列分析

型胶原是肥大软骨细胞的标志物,据GenBank中收录的人、鼠、牛、猪型胶原基因的序列,进行同源性分析,在同源性高的相对保守区域设计了1对特异性引物。建立梅花鹿鹿茸软骨细胞的分离培养方法,培养鹿茸软骨细胞。提取细胞的总RNA,以总RNA为模板,用RT-PCR方法克隆了梅花鹿的型胶原基因序列为877的片段,此片段全部位于编码区,与已报道的牛的型胶原基因的序列比较,同源性达到96%。共有35个碱基发生变异。DNAStar软件分析表明,二者推导的氨基酸序列同源性为95.5%。     

梅花鹿三种茸片和鹿角盘性激素含量测定权

本试验对梅花鹿的鹿茸腊片、鹿茸粉片、鹿茸血片和鹿角盘分别进行了孕酮、睾酮和雌二醇的检测。结果表明,鹿角盘中3种激素均含有,含量基本均衡;3种鹿茸片均未检出雌二醇;各组孕酮含量均高于睾酮含量;孕酮含量各组差异显著（P〈0．05）,睾酮含量各组差异不显著（P〉0．05）;鹿茸腊片中孕酮和睾酮含量均为最高;以上检测结果为鹿茸的食用和医用及鹿产品开发提供理论基础。     

鹿茸·鹿花盘蛋白提取物对小鼠相关指标的影响

[目的]研究鹿茸、鹿花盘蛋白提取物对小鼠相关指标的影响,为鹿蛋白质药理作用研究提供科学依据。[方法]提取鹿茸、鹿花盘蛋白,给小鼠灌胃,研究其对小鼠体重、胰腺系数、肾脏系数的影响。[结果]驯鹿茸蛋白提取物可增加小鼠体重,梅花鹿茸、鹿花盘蛋白对小鼠体重有抑制作用;3种蛋白提取物对小鼠胰腺、肾脏系数无影响。[结论]3种蛋白对小鼠体重有调节作用;3种蛋白对小鼠无明显毒性作用。     

虹鳟 Scarb1基因克隆、生物信息学及组织表达分析

清道夫受体B类成员1 (scavenger receptor class B member 1, Scarb1)作为细胞表面的膜受体蛋白,在动物体色形成过程中发挥重要作用。为了解 Scarb1基因在虹鳟(Oncorhynchus mykiss)体色形成中的作用,通过RACE技术克隆虹鳟 Scarb1基因的cDNA全长,并运用生物信息学方法分析该基因及其序列结构特征,同时使用实时定量PCR(qRT-PCR)检测 Scarb1基因在虹鳟、金鳟及其杂交F₁代不同发育阶段和不同组织中的表达情况。结果显示, Scarb1基因cDNA序列全长为2 032 bp,开放阅读框1 479 bp,编码492个氨基酸,预测分子质量为55.59 ku,且存在保守的CD36结构域和2个跨膜区。序列同源性分析显示,虹鳟与其他硬骨鱼类的氨基酸序列相似度为71.69%~98.58%;进化分析发现虹鳟与大马哈鱼亲缘关系最近,与哺乳动物和两栖动物亲缘关系最远。qRT-PCR检测结果表明,在虹鳟与金鳟胚胎期及出膜后各发育阶段中 Scarb1基因均有不同程度表达,且表现为受精期至桑葚期的表达显著高于其他时期(P<0.05),对虹鳟与金鳟同一时期的差异分析发现该基因在胚胎期及7 dph (days post hatch)、1 M (month post hatch)、2 M和 3 M时期中表达存在显著差异(P<0.01)。 Scarb1基因在虹鳟与金鳟背部皮肤和背部肌肉等色素沉着性组织中表达量较高,其中在金鳟背部皮肤的表达量显著高于虹鳟(P<0.01)。此外, Scarb1基因在杂交F₁代不同发育时期中的表达规律与双亲一致;在不同组织中,该基因在杂交F₁代背部皮肤中的表达量介于双亲之间。研究结果表明, Scarb1基因与虹鳟体色形成有着密切关系,且可能在金鳟黄色体色形成过程中发挥重要作用。     

饲粮不同蛋白质能量水平对四岁梅花鹿生茸的影响

为探讨四岁梅花鹿生茸期饲粮适宜营养水平，本研究采用2(CP18％和15％)×2(GE17.15MJ/kg和16.32MJ/kg)二因子交叉设计，选用四岁(三锯)梅花公鹿40头，分为四个试验组，进行了饲养试验和消化试验。试验结果表明，饲粮蛋白质水平对鹿体增重有极显著影响(P＜0.01)，饲粮蛋白质水平为18％处理组鹿的体增重显著高于15％蛋白组；鹿茸产量组间差异不显著(p＞0.05)；饲粮粗蛋白质水平对蛋白质消化率有极显著影响(P＜0.01)，高蛋白组显著高于低蛋白组；饲粮能量浓度对粗纤维消化率影响显著(p＜0.05)，高能量组显著高于低能量组；四岁梅花鹿生茸期饲粮中能量、蛋白质适宜水平分别约为16.4MJ/kg(GE)和15.9％(CP)；平均每头鹿每天对消化能和可消化蛋白质的需要量分别为33.94MJ和330～360g。