血清4型禽腺病毒Fiber-2蛋白截短表达及单克隆抗体制备

【目的】获得截短表达的血清4型禽腺病毒（FAdV-4）Fiber-2重组蛋白及其单克隆抗体,为建立快速灵敏的病毒检测方法提供基础材料。【方法】对Fiber-2基因序列进行密码子优化,截取Fiber-2蛋白抗原性集中片段,PCR扩增其基因序列,连接至pET-32a（+）构建原核表达载体。将表达的重组蛋白进行纯化,并通过Western blotting验证其在大肠杆菌中的表达情况。将重组蛋白免疫BALB/c小鼠后取脾细胞与SP2/0细胞融合,利用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）法筛选阳性细胞株,再利用秋水仙素裂解法、间接ELISA法和间接免疫荧光法（IFA）对其进行鉴定。【结果】成功构建Fiber-2基因截短片段的原核表达系统,获得大小约为67 kD的Fiber-2截短蛋白,以包涵体的形式出现,经纯化后可获得单一的特异性条带,经Western blotting鉴定证明其可与FAdV-4阳性血清结合从而产生一条特异性条带。经过4次亚克隆后筛选到5株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株（2C2、4F6、5A5、6G10和10B5）,其抗体分泌稳定性、特异性好,诱生的细胞上清液抗体效价为1:1600～...     

一株禽腺病毒4型Fiber2蛋白单克隆抗体的制备

制备禽腺病毒4型（FAdV-4）Fiber2蛋白的特异性单克隆抗体,将重组蛋白FAdV-4 Fiber2纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,分离脾脏中的淋巴细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,筛选得到10株能稳定分泌抗FAdV-4 Fiber2蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株1B5F1、1B5G11、1B5C1、1B5D2、1B5E3、1B5F3、1B5E4、1B5G4、1B5A8、1B5G8,取分泌抗体水平最高的1B5F1细胞株制备腹水,利用斑点杂交（Dot blot）和间接免疫荧光试验（IFA）进行特异性检测。结果表明,成功制备10株杂交瘤细胞株;制备的腹水能与FAdV-4 Fiber2蛋白及FAdV-4攻毒后的鸡肝组织产生特异性反应,证明成功制备了FAdV-4 Fiber2蛋白特异性单克隆抗体。     

血清4型禽腺病毒penton蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

【目的】制备和鉴定血清4型禽腺病毒（FAdV-4）五邻体（penton）蛋白单克隆抗体,为深入探究penton蛋白在FAdV-4感染致病机制中的作用及为抗原检测试剂研发提供抗体材料。【方法】以原核表达的FAdV-4 penton重组蛋白免疫6～8周雌性BALB/c小白鼠,加强免疫3次后,取鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,通过penton-酶联免疫吸附剂测定（ELISA）和FAdV4 virus-ELISA方法分别筛选阳性杂交瘤细胞株,对筛选出的单克隆抗体杂交瘤细胞株进行亚类鉴定、特异性和广谱性鉴定及间接免疫荧光和稳定性试验。【结果】亚类鉴定结果表明,筛选获得7株能稳定分泌抗FAdV-4 penton蛋白的杂交瘤细胞株（1D11、2B3、2C4、2C9、6B3、8F12和8G11）,其轻链均为Kappa链,重链3株为IgG1,4株为IgG2b;特异性检测结果表明,7株单克隆抗体只与FAdV-4反应,不与其他11种血清型FAdV及NDV、ARV、EDSV和IBV等常见禽病病原体发生交叉反应;广谱性鉴定结果表明,7株单克隆抗体均可与19株FAdV-4分离株结合,广谱性好;间接免...     

禽腺病毒4型湖北株的分离鉴定及其Fiber2蛋白在乳酸菌中的表达

为研究湖北地区禽腺病毒4型遗传进化情况及其Fiber2蛋白在乳酸菌中的表达情况,将采集于湖北省某养鸡场的病变组织样处理后接种至LMH细胞,分离出2株禽腺病毒,通过PCR鉴定和Hexon基因测序分析表明为禽腺病毒4型,并命名为HBJZ2021A和HBJZ2021B,遗传进化树分析结果表明,其与国内山东、浙江和北京等地区的毒株亲缘关系较近,处于同一进化分支。以其基因组DNA为模板扩增Fiber2基因并克隆至乳酸菌表达载体pNZ8148,通过酶切和测序表明成功构建了重组表达载体pNZ8148-Fiber2,并通过电转转化至NZ 9000乳酸菌,采用不同浓度梯度的Nisin进行诱导表达,SDS-PAGE及Western-Blot分析结果显示,成功在上清中表达了Fiber2蛋白。该研究结果为湖北地区禽腺病毒4型的流行情况及其口服疫苗的开发提供了参考依据。     

Exendin-4基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据GenBank中已公布的编号为AAB2200的Exendin-4氨基酸片断,及酵母密码子偏好性,设计了Exendin-4在酵母中的表达序列。利用基因工程技术,将编码Exendin-4的蛋白基因亚克隆到含有分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型重组表达栽体pPIC9K-E4。用电转化法将线性化的pPIC9K-E4转化入毕赤酵母菌株GSll5,转化子经MD平板筛选,得到的阳性菌株再用浓度梯度递增的G418筛选多拷贝重组子。将MM和MD平板筛选得到Muts菌株用甲醇诱导表达6d,每隔24h取样。Tricine-SDS-PAGE检测结果显示,诱导后第6天表达量达到最高。     

甜味蛋白Brazzein基因的合成及在毕赤酵母中的表达

用连接PCR合成出甜味蛋白Brazzein的基因,克隆到PUC 57质粒中测序后,用EcoR I 和Not I双酶切,连接到pPIC 9 k,电转化毕赤酵母GS 115,经MD和MM平板筛选,获得His+Muts重组子.0.5%甲醇诱导表达96 h后,对发酵液和细胞进行SDS-PAGE分析,在发酵液中没有蛋白带出现,在细胞裂解液中出现相对分子质量约6.0 kd的特异性甜味蛋白条带,与预期的相对分子质量大小相符.用BCA蛋白定量试剂盒测定,Brazzein在毕赤酵母中的表达量可达329 mg/L.     

Exendin-4-Tβ4融合蛋白在毕赤酵母中的表达研究

为实现Exendin-4-Tβ4(以下简称Ex4-Tβ4)融合蛋白在毕赤酵母中的表达,采用重叠PcR法扩增出有Ex4-Tβ4融合基因.将其克隆入表达质粒pPIC9KH,采用毕赤酵母GSll5作为宿主菌,利用电转化法将重组载体pPIC9KH-Ex4-Tβ4转入GSll5中,利用甲醇作为诱导物,对重组栽体进行诱导表达,成功构建重组质粒pPIC9KH-Ex4-Tβ4,SDS-PAGE证明Ex4-Tβ4在毕赤酵母中能高效表达,成功地在毕赤酵母中表达了Ex4-Tβ4融合蛋白.     

甜味蛋白Brazzein基因的合成及在毕赤酵母中的表达

用连接PCR合成出甜味蛋白Brazzein的基因,克隆到PUC57质粒中测序后,用EcoR I和Not I双酶切,连接到pPIC9k,电转化毕赤酵母GS 115,经MD和MM平板筛选,获得His^ Mut^ 重组子。0．5％甲醇诱导表达96h后,对发酵液和细胞进行SDS—PAGE分析,在发酵液中没有蛋白带出现,在细胞裂解液中出现相对分子质量约6．0kd的特异性甜味蛋白条带,与预期的相对分子质量大小相符。用BCA蛋白定量试剂盒测定,Brazzein在毕赤酵母中的表达量可达329mg／L。     

丹毒丝菌SpaA基因免疫保护区的克隆及其在毕赤酵母中的表达

【目的】以毕赤酵母Pichia pastoris X-33为宿主表达猪丹毒丝菌Erysipelothrix rhusiopathiae Spa A基因氨基端的免疫保护区蛋白.【方法】以采集于广东某猪场的猪丹毒丝菌为模板,根据NCBI中已发表的Spa基因c DNA序列设计1对引物,通过PCR扩增得到Spa A-N,并将其连接到表达载体p PICZαC上,得到重组表达质粒p PICZαC-Spa A-N;用Sac I酶将重组表达质粒p PICZαC-Spa A-N线性化后电转化入毕赤酵母X-33,经含博来霉素ZencinTM抗性的YPDS平板筛选和PCR鉴定的阳性转化子,用含不同浓度博来霉素抗性的YPDS平板筛选出高拷贝子并进行甲醇诱导培养,分别于诱导48、72、96 h后离心收集上清液,立即做SDS-PAGE,并进行SDS-PAGE及Western-blot试验.【结果和结论】成功克隆并表达了Spa A-N基因,构建了重组表达质粒p PICZαC-Spa A-N,并以毕赤酵母X-33为宿主成功表达了猪丹毒丝菌Spa A基因氨基端的免疫保护区蛋白.丹毒丝菌Spa A-N作为免疫保护区在酵母宿主中得以成功表达.     

转录因子Prm1和Mit1对毕赤酵母产外源蛋白的影响

【目的】研究转录因子Prm1和Mit1在毕赤酵母表达外源蛋白中的作用,为提高毕赤酵母中的外源蛋白产量提供参考。【方法】以毕赤酵母GS115为出发菌构建8种菌株,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,过表达Prm1、Mit1或敲除Prm1、Mit1和Mxr1,以GFP的表达量为指标,分析其对毕赤酵母产外源蛋白的影响。在甲醇和甘油2种碳源下,利用实时定量PCR分析Prm1和Mit1在转录水平的表达情况,探究Prm1和Mit1的关系。【结果】成功构建了表达GFP的菌株、单因子过表达Prm1和Mit1的菌株及敲除Prm1、Mit1、Mxr1的菌株等8种菌株。利用P_AOX1诱导型过表达Prm1,毕赤酵母细胞内的GFP表达量极显著提高(P<0.01),而用P_GAP组成型过表达Prm1,GFP的表达量无明显变化;利用P_AOX1诱导型和P_GAP组成型过表达Mit1,GFP表达量均极显著提高(P<0.01),较对照分别提高3.2和2.5倍;敲除Prm1后,GFP的表达量显著下降(P<0.05);敲除M...     

鸡神经肽Y（NPY）基因在毕赤酵母中的表达

为通过毕赤酵母的表达获得鸡NPY蛋白,根据GenBank上的鸡NPY基因序列,结合毕赤酵母密码子的偏好性合成编码鸡NPY蛋白的基因,将其插入真核表达载体pPICZαA,构建重组表达质粒pPICZαA-NPY,并将重组质粒电转入毕赤酵母GS115,获得重组毕赤酵母菌GS115/pPICZαA-NPY,用终浓度为1%的甲醇诱导表达阳性转化菌,用Tricine-SDS-PAGE和Western Blot检测表达蛋白。结果成功构建表达载体pPICZαA-NPY,转化后的重组酵母菌成功分泌鸡NPY蛋白,获得分子量约为35 kDa的鸡NPY蛋白。     

莱茵衣藻“细菌型”pepc2基因叶绿体表达及其对油脂蛋白质含量的影响

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC,EC 4.1.1.31）在植物碳代谢中有重要作用,高等植物中PEPC可以调控蛋白质和脂肪酸含量,但是对绿藻PEPC的研究还较少。莱茵衣藻是绿藻中的模式生物,其基因工程中外源基因的转化以叶绿体转化效率最高,为了提高外源蛋白表达和获得高产油莱茵衣藻,利用叶绿体转化法能进一步提高表达效率。因此,本研究首先克隆了莱茵衣藻“细菌型”PEPCCSⅠ（conserved sequenceⅠ）的639 bp,构建了pASapI-reve-Crpepc2和pASapI-forw-Crpepc2正反向叶绿体表达载体,并用基因枪法转化莱茵衣藻cc-400获得了空质粒型,正向型和反向型转基因藻株。其次,应用RT-qPCR方法检测Crpepc2的相对表达量,结果表明反向型Crpepc2的表达量减少了89.97%,而正向型增加了201.16%。最后,检测了总蛋白和脂质含量的变化,正向型突变株的总蛋白增加了37.03%;而反向型突变株的脂质含量增加了70.32%,且不饱和脂肪酸含量明显增加。以上结果证明莱茵衣藻“细菌型”PEPC的叶绿体表达不仅可以进一步提高蛋白质与脂肪酸含量,也可为今后外源蛋白的表达和高产油工程藻的应用做贡献。     

I群禽腺病毒血清4型广东株的分离鉴定及分子特性

[目的]对广东地区疑似心包积液–肝炎综合征患病鸡进行腺病毒分离鉴定并研究其分子特征.[方法]采集的病料样品,通过鸡胚有限稀释法经SPF鸡胚传代分离纯化病毒,进行致病性试验,并对病毒的hexon、fiber-2、ORF19和ORF29基因进行PCR扩增,分析其分子特征.[结果]hexon基因序列分析显示此次分离的毒株为Ⅰ群禽腺病毒血清4型(命名为WM-XC株),SPF鸡接种分离毒株后,致死率达90%,死亡鸡只出现明显的心包积液、肝炎等变化,肝脏病理切片可观察到明显的嗜酸性包涵体,显示分离毒株具有致病性.fiber-2基因序列同经典毒株ON1和KR5相应序列的相似性达96.1%和97.0%,与2015年以来国内分离的毒株序列相似性则达到100%;ORF29序列与2013年国内分离到的毒株JSJ13和JN13的相应序列相比存在33个碱基的缺失;WM-XC分离株与2015年以来国内分离毒株序列相同,但相比经典株ON1和KR-5,缺失ORF19序列.[结论]此次从广东地区分离到的血清4型Ⅰ群腺病毒,和近年国内其他地区分离的流行毒株一样,其fiber-2、ORF19和ORF29基因序列与经典毒株差异明显.     

青海湖裸鲤TNNI1和TNNI2基因克隆及其响应盐碱胁迫的表达研究

【目的】克隆青海湖裸鲤慢收缩骨骼肌型肌钙蛋白I基因(TNNI1)和快收缩骨骼肌型肌钙蛋白I基因(TNNI2),分析其在不同组织及盐碱胁迫环境下皮肤和腹侧肌肉组织中的表达水平,为揭示青海湖裸鲤生长缓慢及恢复青海湖裸鲤鱼类资源提供基础数据。【方法】以青藏高原特有鱼类青海湖裸鲤为研究材料,利用RACE技术克隆TNNI1和TNNI2基因全长cDNA序列,进行氨基酸序列同源性比对;利用实时荧光定量PCR法检测2个基因在青海湖裸鲤鳃、眼、脑、脾脏、肝脏、肠、肾、心、皮肤、腹侧肌肉组织的表达情况,以及盐碱胁迫下腹侧肌肉和皮肤组织中的表达规律。【结果】青海湖裸鲤TNNI1 cDNA序列全长为1 211 bp,其中开放阅读框540 bp,共编码179个氨基酸;TNNI2 cDNA序列全长为737 bp,其中开放阅读框531 bp,共编码176个氨基酸。序列同源性分析发现,青海湖裸鲤TNNI1氨基酸序列与安水金线鲃的同源性高达92.13%,TNNI2氨基酸序列与鲤鱼的同源性最高为92.61%。系统发育树结果显示,从TNNI1氨基酸序列来看,青海湖裸鲤与金线鲃属鱼类、鲫鱼、鲤鱼的亲缘关系较近;从TNNI2氨基酸序列来看,青海湖裸鲤与鲤鱼的亲缘关系最近,其次是鲫鱼和金线鲃属鱼类。TNNI1和TNNI2基因在青海湖裸鲤不同组织中均有表达,且在腹侧肌肉中相对表达量最高。盐碱胁迫条件下,TNNI1和TNNI2基因在肌肉组织中的相对表达量均显著下调;在皮肤组织中TNNI1的相对表达量极显著下调（P＜0.01）,而TNNI2极显著上调（P＜0.01）。【结论】成功克隆了青海湖裸鲤TNNI1、TNNI2基因全长;TNNI1、TNNI2基因在腹侧肌肉组织中高表达,表明其与肌肉组织发育密切相关;盐碱胁迫条件下TNNI1、TNNI2基因在腹侧肌肉组织中的表达均显著下调,提示2个基因表达量降低可能是青海湖裸鲤生长缓慢的重要因素。     

马泰勒虫棒状体颈部蛋白4基因的克隆与原核表达分析

【目的】克隆马泰勒虫新疆株棒状体颈部蛋白4基因（RON4）并原核表达RON4蛋白。【方法】参考美国马泰勒虫WA株基因组数据及其他顶复门原虫RON4基因信息,设计特异性引物,以马泰勒虫新疆株DNA为模板克隆RON4基因片段,构建pET-32a-RON4原核表达载体后进行原核表达与鉴定,并对RON4基因编码蛋白进行生物信息学分析。【结果】获得马泰勒虫新疆株RON4基因（NCBI登录号为：ON254212）。马泰勒虫新疆株与马泰勒虫WA株亲缘关系最近,RON4基因的核苷酸和氨基酸相似性分别为 99.4%和 99.0%;RON4基因在种间高度保守,其氨基酸序列与其他顶复门原虫具有高度相似的保守区域。成功构建了RON4蛋白原核表达载体,诱导表达获得分子质量为50 ku的重组包涵体蛋白;重组蛋白可与马泰勒虫阳性马血清特异性反应。生物信息学分析表明,马泰勒虫新疆株RON4蛋白的亲水性、柔韧性以及表面可及性较弱,B细胞表面抗原表位区域较少,形成表面抗原表位的结构基础条件不足。【结论】克隆获得了马泰勒虫新疆株RON4基因,并完成了原核表达及鉴定,该基因高度保守,在不同物种间可能具有相似的功能。     

膜醭毕赤酵母对侵染苹果的扩展青霉拮抗作用研究

通过牛津杯法测定不同浓度膜醭毕赤酵母对扩展青霉体外抑制作用,将扩展青霉分别接入膜醭毕赤酵母和无菌水处理（对照组）的苹果,统计发病率和病变直径,结合顶空气相色谱-离子迁移谱（HS-GC-IMS）检测膜醭毕赤酵母拮抗组和对照组苹果的挥发性物质。结果表明,酵母在10⁸ CFU/mL时抑菌圈最大（25.4 mm）,并能显著抑制扩展青霉的孢子萌发率和芽管长度。培养10 d,酵母拮抗组的苹果发病率为10.6%,显著低于对照组（92.2%）。HS-GC-IMS共定性出38种挥发性成分,主要为酯类及醇醛化合物。对照组中丙酸乙酯、苯乙烯等含量显著高于酵母拮抗组。10⁸ CFU/mL 膜醭毕赤酵母细胞悬浮液能够明显抑制扩展青霉和有效防治苹果采后青霉病。     

禽腺病毒4型河南株Hexon全基因的克隆及遗传进化分析

【目的】分析禽心包积水-包涵体肝炎综合征的主要病原禽腺病毒4型(FAV-4)在河南省的流行和遗传变异情况。【方法】对2015年8-10月送检的40份疑似FAV-4感染的病料进行PCR阳性检测,同时根据采集地区与宿主的差异性,选取7份FAV-4阳性样品进行了Hexon全基因的扩增、克隆、测序和遗传进化分析。【结果】通过扩增Hexon基因421bp的片段,成功建立了禽腺病毒4型的PCR检测方法;40份家禽肝脏样品中,PCR检测显示35份为FAV-4阳性,阳性率为87.5%;成功扩增了包含Hexon基因全序列的片段,长度为2 889bp;7株FAV-4河南株的Hexon基因与GenBank中的12株FAV-4参考毒株Hexon基因序列之间核苷酸序列同源性为98.5%~99.8%,与参考株相比存在碱基的插入、突变现象;FAV-4河南株Hexon全基因推导的氨基酸序列与参考株之间的同源性为98.2%~99.8%,且发生变化的位置集中在前段和中段。【结论】FAV-4河南株与印度分离株亲缘关系较近,但与韩国分离株亲缘关系相对较远。     

克氏原螯虾泛素结合酶E2基因的克隆及其在卵巢中的表达分析

利用RACE技术获得了UB-E2基因c DNA全长,通过RT-PCR技术研究UB-E2基因在不同组织、发育时期的表达量和17α-羟孕酮激素刺激后UB-E2表达量及性腺发育情况。结果表明:该基因序列全长3 943bp,开放阅读框675 bp,编码224个氨基酸,相对分子量23. 93 ku,等电点8. 61,82～219位氨基酸序列为泛素结合酶家族特有的结构域。氨基酸序列比对发现,克氏原螯虾UB-E2基因与节肢动物UB-E2基因有较高的同源性;系统进化分析表明,UB-E2基因与凡纳滨对虾和斑节对虾聚为一支。荧光定量结果显示,UB-E2基因在克氏原螯虾卵巢组织中的表达量显著高于其他组织(P 0. 05);在卵巢发育初期表达量最低,随后逐渐升高,到产卵后期开始下降; 17α-羟孕酮刺激结果显示,试验组卵巢发育速度明显加快,同时UB-E2基因的表达量也显著上升,卵巢发育速度和UB-E2基因表现为受17α-羟孕酮刺激响应一致。推测UB-E2基因在克氏原螯虾的卵巢发育和配子发生中起着重要的作用,本研究为克氏原螯虾性腺发育分子调控机制提供一定的理论依据。