重茬胁迫下苹果不同砧木幼苗生长及根系吸收的差异

【目的】选择合适砧木是防治苹果重茬障碍最有前途的方法之一。本研究比较了三种苹果砧木的幼苗在重茬胁迫下的生长及根系吸收的差异,探讨重茬胁迫对K+、Ca2+吸收的影响,为筛选抗重茬砧木材料和培育抗重茬砧木品种提供理论依据。【方法】以平邑甜茶(Malus hupehensis Rehd.)、新疆野苹果[Malus sieversii(Ledeb.)Roem.]和富平楸子[Malus prunifolia(Willd.)Borkh.]一年生实生苗为试材,取自泰安市道朗镇玄家庄20年红富士/八棱海棠老果园原树穴深0—40 cm的根际土作为试验用土,于2012年4月25日取砧木幼苗并分为两组,一组利用非损伤微创技术测定根际K+、Ca2+离子流,根系固定于平衡液中,平衡半小时后测定重茬胁迫前的根际离子流速,然后将其在重茬土提取液中浸泡半小时,测定重茬胁迫后的根际离子流速;另一组移栽至直径为25cm、深30cm的苗盆中,7 9月分别测定植株株高、径粗、叶绿素含量和光合速率;生长季结束后扫描根系结构,分别称量幼苗根系、枝条、叶片的鲜重和干重。【结果】三种砧木幼苗受到重茬胁迫后,地上部生长受到不同程度抑制。重茬胁迫前后平邑甜茶株高差异不显著,新疆野苹果和富平楸子株高胁迫后均显著降低;新疆野苹果光合速率重茬土显著低于正茬土,其它两种砧木光合速率在胁迫前后无显著差异;叶绿素含量均表现为重茬土显著低于正茬土;径粗在胁迫前后无显著差异。重茬土中新疆野苹果根系干物质积累下降明显,根/冠比增大;三种砧木的根系生长量显著增大,根系总长度分别是正茬土中根系总长度的1.45倍、2.22倍、1.71倍;三种砧木幼苗在重茬土中的根系活力均低于正茬,但胁迫前后平邑甜茶根系活力下降幅度最小。重茬胁迫后,三种砧木的根际K+离子流均由内流转变为外排,胁迫前后平邑甜茶的根际K+离子平均流速变化较小,说明对其影响小,新疆野苹果根际K+离子平均流速变化最为明显,其吸收K+能力最弱;平邑甜茶根际Ca2+流动方向在胁迫前后未发生变化,均为内流,而另外两种砧木根际Ca2+离子流均由内流转变为外排,且新疆野苹果根际Ca2+离子平均流速变化最为明显。【结论】苹果砧木在重茬胁迫下地上部生长受到显著性抑制,根系总量增大,K+、Ca2+的吸收受到不同程度的影响;重茬使抗性较差的砧木新疆野苹果的物质积累受到较严重的阻碍,根冠比显著增加,K+、Ca2+的吸收受到严重影响;较耐重茬的砧木平邑甜茶的根冠比相对稳定,K+、Ca2+的吸收受到的影响也最小;富平楸子的表现介于两者之间。     

苹果B型细胞分裂素响应因子MdARR11对干旱胁迫的抗性分析

B型反应调节因子（ARRs）作为细胞分裂素的正响应因子在植物生长发育中发挥重要作用。为探究ARR11在应对苹果干旱胁迫过程中的功能,本研究以嘎拉3苹果（Malus domestica Borkh. cv. Gala 3）为试验材料,利用聚合酶链式反应（PCR）扩增技术,获得了B型细胞分裂素响应因子MdARR11。该序列全长2 248 bp,编码613个氨基酸,包含type-B-REC结构域,C端含有一个MYB-like的DNA结合域。组织特异性表达分析显示该基因在茎中表达量最高。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析结果表明,干旱胁迫抑制MdARR11的表达。为进一步研究MdARR11在干旱胁迫中的功能,获得了过表达MdARR11苹果愈伤组织。使用6%聚乙二醇6000(PEG6000)模拟干旱处理野生型及过表达愈伤组织,观察愈伤组织生长速率、大小并检测鲜重、相对电导率、丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、可溶性蛋白积累量以及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性。结果表明,过表达MdARR11提高了愈伤组织细胞膜的脂膜过氧化程度、降低了渗透调节物质的...     

低磷胁迫下五种苹果砧木的磷吸收与利用特性

【目的】磷是植物必需的矿质元素之一,能够促进植株花芽分化,但施入土壤中的磷易被固定从而变成难以利用的闭蓄态磷,使土壤中的有效磷含量降低。因此,研究和发掘磷高效的苹果砧木对于解决低磷胁迫和提高磷利用效率具有重要意义。本研究以5种一年生苹果野生砧木为试材,进行低磷胁迫处理,调查苹果野生砧木对磷的吸收和利用特性。【方法】盆栽试验以正常管理的一年生八棱海棠（M. micromalus Makino）、 平邑甜茶（Malus hupehensis Rehd.）、 东北山荆子（M. baccata Borkh.）、 富平楸子［M. prunifolia（Willd）Borkh.］、 新疆野苹果［M. sievesii（Ledeb.）Roemer］5种苹果砧木为试材。试验分为低磷（LP）和正常施磷（CK）两组处理,每个处理6次重复（6盆）。根总表面积、 根系总长度分析用WinRHIZO 根系分析软件进行; 植株各器官组织烘干粉碎后,用钒钼黄比色法测定其含磷量。离子吸收动力学参数的测定采用平邑甜茶水培幼苗,吸收前置于黑色培养瓶饥饿处理24 h,幼苗吸收24 h后采集营养液10 mL,钼锑抗比色法测定含磷量。【结果】5种砧木的相对磷效率从高到低为富平楸子（93.66%）平邑甜茶（87.69%）东北山荆子（83.44%）八棱海棠（74.54%）新疆野苹果（74.01%）。在低磷及正常施磷条件下,5种砧木的磷吸收效率均为富平楸子平邑甜茶东北山荆子新疆野苹果八棱海棠; 磷利用效率为平邑甜茶富平楸子八棱海棠新疆野苹果东北山荆子。H2PO-4离子最大吸收速率（Vmax）最高的为富平楸子［101.81 mol/(gh)］,其次为平邑甜茶［66.40 mol/(gh)］、 东北山荆子［45.00 mol/(gh)］和新疆野苹果［44.32 mol/(gh)］,八棱海棠的Vmax最低,为41.28 mol/(gh); 平邑甜茶的Km值最低,为4.05 mol/L,富平楸子为8.68 mol/L,东北山荆子为12.29 mol/L,新疆野苹果为12.64 mol/L,八棱海棠最高为13.57 mol/L。吸收根总表面积和总根长均以富平楸子最大,八棱海棠最小。【结论】低磷胁迫下富平楸子的相对磷效率和磷吸收效率最高,在低磷胁迫下生长势最好并且磷吸收能力最强,是一种对低磷胁迫适应能力较好的苹果砧木; 平邑甜茶的相对磷效率仅次于富平楸子,磷利用效率最高,其耐低磷胁迫的能力也仅次于富平楸子。进一步分析发现,砧木对磷的吸收效率与吸收根总表面积和总根长存在显著正相关关系,说明低磷胁迫下植物通过增加吸收根总表面积及总根长等方式,扩大根系吸收面积,从而增加根系对磷的吸收。     

小麦成株抗条锈性抑制差减杂交文库构建及表达序列标签分析

以成株期抗条锈小麦(Triticum aestivum)品种兴资9104为材料,依照CLONTECH公司PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit方法构建了小麦成株期条锈菌(Puccinia striiformis)诱导的抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)cDNA文库。建库质量分析表明,接头连接效率高,插入片段平均300bp,文库质量较好。对文库中随机挑取的96个阳性克隆进行测序,用CAP3软件聚类拼接,得到unigenes41个。与GenBank已知序列进行Blastx分析表明,所得基因主要涉及植物的信号传导、转录调控、能量与代谢、蛋白质合成与代谢、膜转运、细胞生长分化等。利用RT-PCR对3条基因进行分析,明确其在抗病过程中的表达模式。     

大蒜蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶基因As-1-SST的克隆与表达分析

植物果聚糖是一类重要的可溶性碳水化合物,其在植物中的积累可提高植物的抗逆性。为了解大蒜蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶的序列特征和功能,本研究采用TA克隆方法(Original TA Cloning Kit)得到乐都紫皮大蒜As-1-SST基因全长序列,利用BLAST、DNAMAN、ProtParam、SWISS-MODEL、MEGA等生物信息工具分析其序列特征,通过荧光定量PCR(qRT-PCR)分析As-1-SST基因在大蒜根、假茎、叶片和鳞芽中的表达差异及其对低温和干旱胁迫的响应情况。结果表明,大蒜As-1-SST基因全长1 872 bp, 编码623个氨基酸,推测蛋白质分子质量为69.76 kDa,理论等电点为5.19,为不稳定亲水性蛋白;亚细胞定位预测结果显示,As-1-SST蛋白主要定位于液泡,该蛋白无信号肽,包含2个特异位点,属于糖苷水解酶32(GH32)家族。在进化关系上,大蒜As-1-SST与百合科的洋葱1-SST亲缘关系最为接近。qRT-PCR分析表明,As-1-SST基因在根中的表达量最高,其次是假茎,在鳞芽和叶片中表达水平较低,具有明显的组织特异性;不同组织As-1-SST对于低温及干旱胁迫的响应差异显著,低温胁迫显著诱导了根、假茎、叶片中As-1-SST的表达,而干旱胁迫只显著提高了鳞芽中As-1-SST的表达量,说明大蒜各组织As-1-SST对逆境信号的响应机制不同。本研究为进一步鉴定大蒜果聚糖合成酶基因的生物信息学功能和表达调控机制提供了一定的理论依据。     

盐生植物海马齿中与K^＋离子胁迫有关的基因功能初步鉴定

盐生植物海马齿常年生长在海边沙地,能忍耐高盐干旱。本研究对从海马齿植物盐胁迫下的差减文库（SSH文库）中分离的3个全长基因SRTG152-I、SRTG152-Ⅱ和SRTG152-Ⅲ（GenBank：FJ457924,FJ457925和FJ457926）进行了微生物表达和耐盐分析。3个全长基因分别插入pET-22bf＋）表达载体,经过1mmol／L的IPTG在37℃下诱导3h,它们均获得了成功表达。耐盐性功能分析表明,3个基因对Ca^、Mg^2＋和Na^＋离子没有抗性,而在900mmol／L高浓度U离子的胁迫下与对照相比赋予菌株一定的U离子抗＋性。所以,我们初步推测这3个全长基因SRTG152-I、SRTG152-Ⅱ和SRTG152-Ⅲ是一类与U离子的抗性相关的基因。     

小金海棠S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因（MxSAMS）的克隆和表达分析

从本实验室建立的小金海棠缺铁差减文库中分离出一个cDNA片段,在GenBank中发现该片段与其它植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因具有90%的同源性。利用RACE技术成功地获得小金海棠（Malus xiaojinensis）SAMS基因(MxSAMS)的cDNA全长序列（GenBank登录号：EU639408）,该基因cDNA全长1 479 bp,最大开放阅读框1 176 bp,编码392个氨基酸,酶蛋白理论分子量为42.99 kD;与其它植物的蛋白质氨基酸序列同源性在88.1%~92.6%之间。推测的MxSAMS蛋白质三级结构包含3个保守结构域和一个保守的ATP结合位点GAGDQG。Southern 杂交显示,MxSAMS基因在小金海棠基因组中是单拷贝的。半定量RT-PCR结果表明,该基因在小金海棠的根和叶中均受缺铁胁迫诱导增强表达。     

苎麻α-amylase基因的克隆与表达

α-amylase基因不仅参与植物糖代谢与生物能量的调动,而且与植物抗逆功能相关。为了克隆Bn-α-amylase基因,分析其序列及表达特征,本研究以湘苎3号苎麻(Boehmeria nivea)转录组文库中Unigene4746序列为基础,采用RT-PCR技术克隆该基因的全长编码序列,并进行生物信息学分析;利用Real-time PCR分析该基因在不同组织和不同胁迫条件下的表达特征。研究结果表明,苎麻Bn-α-amylase的编码区序列长2 295 bp,编码765个氨基酸(GenBank登录号:KF860891),推导该蛋白质的等电点和分子量分别为5.685和86.11 kD,该蛋白在羧基端含有两个保守的结构域,亚细胞定位预测显示该蛋白位于细胞质中,不存在信号肽和跨膜结构域。与苹果(Malus×domestic)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、猕猴桃(Actinidia chinensis)、蓖麻(Ricinus communis)、大豆(Glycine max)的α-amylase基因的核苷酸序列相似性分别为80%、76%、76%、73%和67%,与之编码的氨基酸序列相似性分别为68%、65%、65%、69%和51%。进化树分析表明Bn-α-amylase与大豆、葡萄、猕猴桃、蓖麻的α-amylase基因亲缘关系较近,与拟南芥、水稻、高粱的α-amylase基因亲缘关系次之,与卷柏的α-amylase基因亲缘关系较远。实时荧光定量PCR分析表明,Bn-α-amylase在苎麻根、茎皮、茎木质部、茎尖、叶片中均有表达,其中,在叶中表达量最高,在根中表达量最低,且受干旱、高盐胁迫表达增强,受ABA胁迫表达降低。本研究获得了Bn-α-amylase基因的编码区序列,其编码的蛋白具有植物α-amylase典型的结构域,且该基因响应ABA、干旱和高盐逆境胁迫,提示该基因可能与苎麻抗逆境机制密切相关。     

不同耐旱性甘薯柴根和块根的差异蛋白组分析

为从蛋白水平揭示不同耐旱性甘薯柴根和块根的差异,明确甘薯根系分化和耐旱性生理机制,以耐旱性强的济薯21(JS21)和耐旱性弱的济紫薯1(JZS1)为试验材料,在旱棚内人工控水模拟田间干旱,采用iTRAQ技术开展不同耐旱性甘薯柴根和块根的全蛋白组差异蛋白分析。结果表明,共鉴定到甘薯根系差异蛋白2 003个,其中可信蛋白1 716个、动态表达蛋白819个。GO分析表明,干旱胁迫条件下,与柴根相比,JS21和JZS1块根差异蛋白分别集中于细胞质内碳水化合物合成、能量代谢等生物过程;与JZS1块根相比,JS21块根差异蛋白分子功能主要涉及过氧化物酶活性、氧化还原酶活性等。KEGG分析表明,木质素代谢在甘薯根系分化和响应干旱胁迫的过程中起到重要的调控作用。从淀粉和蔗糖代谢、苯丙烷代谢途径富集的差异蛋白分析中探明,正常条件下,JS21主要通过ADPGase积累淀粉,JZS1不仅通过ADPGase还通过UDPGase积累淀粉;干旱胁迫条件下,JS21块根中淀粉的合成仍大于分解,而JZS1块根中蔗糖的分解大于合成。正常条件下,2个品种柴根中均含有丰富的抗氧化酶;但干旱诱导JS21块根产生过氧化物酶,导致JZS1块根中木质素合成关键酶上调表达。蔗糖合酶是干旱胁迫条件下耐旱性弱的JZS1根系中能量代谢重要蛋白。综上,干旱胁迫条件下,耐旱性强的JS21可通过柴根中已有的和块根中诱导产生的过氧化物酶协同抵御干旱胁迫,而耐旱性弱的JZS1则通过蔗糖合酶维持能量代谢,其块根木质化程度加剧。本研究为甘薯耐旱性品种生理鉴定和耐旱基因发掘提供了一定的理论依据。     

亚洲棉NCED3基因克隆及其抗旱功能分析

9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是脱落酸(ABA)合成过程中的关键限速酶,被证实广泛参与植物的生长发育进程及对非生物胁迫的应答。为了挖掘、鉴定棉花抗旱相关的NCEDs基因,本研究克隆了亚洲棉(Gossypium arboreum)GaNCED3基因,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了干旱胁迫下该基因的表达特性;并遗传转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),研究了该基因在干旱应答中的功能。结果显示,GaNCED3基因开放阅读框(ORF)全长为1 794 bp,其编码的蛋白质包含597个氨基酸。该基因在干旱胁迫处理后上调表达,在处理3 h的根中表达量最高,是对照的27.6倍。在萌发期进行甘露醇模拟的干旱处理,超表达GaNCED3的转基因拟南芥种子萌发率和绿苗率均高于野生型。在幼苗期进行自然干旱处理后,转基因拟南芥植株叶片丙二醛含量显著低于对照(P<0.05),游离脯氨酸积累量显著高于对照(P<0.05)。本研究初步证明了外源超表达GaNCED3基因使植株抗旱能力增强,为进一步研究GaNCED3干旱应答的分子机制提供了理论依据,为抗旱育种提供了候选基因资源。     

紫花苜蓿铝胁迫抑制消减文库的构建和初步分析

为了分离和鉴定铝诱导基因，以紫花苜蓿小冠品种为对象，以经过40μM铝离子胁迫的紫花苜蓿幼根为实验方，未胁迫的为驱赶方，用抑制消减杂交法（SSH）构建了一个紫花苜蓿铝胁迫消减文库。菌落PCR显示插入片段在250bp到1200bp之间，文库质量良好。通过对文库阳性克隆随机测序和BLASTX分析表明,文库中包含了许多在铝胁迫中发挥作用的基因，涉及到抗氧化作用、信号的传导、发育和能量代谢等多种生理过程，比如过氧化物酶、钙依赖蛋白激酶、蔗糖转化酶、蛋白磷酸脂酶调节因子等。而且许多EST序列与其他生物性和非生物性胁迫诱导相关。为了解紫花苜蓿的耐铝机制和抗性相关基因的克隆奠定了基础。     

低温胁迫下高羊茅抑制消减文库的构建与分析

采用抑制消减杂交(SSH)技术构建了高羊茅"猎狗5号"低温下的正向差减cDNA文库,并从基因表达水平研究了低温诱导对高羊茅抗寒性的影响.通过Reversenorthern杂交法筛选,挑选出36个低温处理下差异表达基因,并对这些基因进行测序.将测序结果在基因组数据库(NCBI)中进行检索比对,最后获得34个差异表达的基因,其中33个基因功能已知,主要与植物信号转导、光合作用、糖代谢、物质运输以及抗逆性相关.     

8个新疆野苹果优良无性系抗寒性比较

为获得新疆野苹果抗寒育种的优良资源,本试验分析比较了8个新疆野苹果优良无性系在不同时期(1月、3月)的抗寒性差异,以8个新疆野苹果优良无性系的一年生枝条为试验材料,应用电导(EL)法和电阻抗图谱(EIS)法对其抗寒性进行测定与对比分析,并在3月对低温处理枝条进行了生长恢复试验。结果表明,新疆野苹果无性系的相对电导率在-20℃低温处理下开始出现显著差异。两时期由EIS法参数中r_e、r_1计算的各无性系半致死温度与EL法所求得的半致死温度的相关系数分别达到显著水平和极显著水平(0.744*、0.751*、0.822**、0.824**),说明这2种方法适用于新疆野苹果的抗寒性测定。3月的半致死温度(-33.97~-32.33℃)均显著高于1月(-31.87~-26.33℃),部分无性系间的差异达到极显著水平,各无性系在两时期的半致死温度相关性不显著。无性系M-3、M-6、M-8枝条计算的半致死温度较低,1月分别为-32.76℃、-33.97℃、-33.52℃,3月分别为-30.47℃、-30.26℃、-31.87℃;在3月的苗木生长恢复试验萌芽率较高,-30℃处理条件下分别为76.19%、75.71%、67.38%,-50℃处理条件下分别为16.67%、17.72%、18.89%。因此,无性系M-3、M-6、M-8的抗寒表现较好,是抗寒育种的优良资源。本试验结果为深入研究不同时期新疆野苹果抗寒性差异和筛选抗寒育种的优良资源提供了科学依据。     

应用反向斑点杂交技术从转录序列的选择性捕获中筛选副猪嗜血杆菌表达差异基因

通过对靶DNA的种类和浓度、探针浓度、紫外交联时间等反向斑点杂交条件优化,建立了一种从选择性捕获的转录序列（selective capture of transcribed sequences,SCOTS）库中筛选副猪嗜血杆菌在体内、外差异表达的基因的方法。通过反向斑点杂交技术从10个样品中筛选出的6个样品被证明是副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）在体内上调表达或者是特异表达的基因。结果表明：SCOTS技术能够有效地获得一个可能存在差异表达基因的cDNA文库,而反向斑点杂交技术可以有效地从中筛选到差异表达基因。     

Genetic variability in apple fruit polyphenol composition in Malus × domestica and Malus sieversii germplasm grown in New Zealand

Variations in the concentrations of flavan-3-ol, oligomeric procyanidin, chlorogenic acid, dihydrochalcone, flavonol, and anthocyanin polyphenol groups and total polyphenols were examined in the fruit peel and cortical flesh of 93 (80 Malus × domestica and 13 Malus sieversii) apple genotypes in at least 1 year between 2003 and 2005 grown at one site in New Zealand (NZ). Differences among genotypes accounted for 46-97% of the total variation in the concentrations of total polyphenols and each of the individual phenol groups in the flesh and peel in both species, whereas effects of year and genotype × year were minimal, except for peel flavonols in M. × domestica and flesh flavonols in both species. In these cases, differences among genotypes accounted for less than 30% of the total variation, which was less than the variation found for the interaction between genotype and year. Total polyphenol concentrations among genotypes were spread over a 7- and 9-fold range in the flesh and a 4- and 3-fold range in the peel of M. sieversii and M. × domestica, respectively, with the spread in concentrations of individual polyphenol groups in each tissue and within each species varying from a 2-fold to over a 500-fold range. Higher concentrations were generally found in M. sieversii. In M. × domestica, cultivars and breeding selections originating in NZ had lower average flesh and peel total polyphenols and chlorogenic acid than older cultivars previously imported into NZ from overseas countries.     

甘薯茎线虫诱导抑制差减杂交cDNA文库的构建及表达序列标签分析

以甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)抗茎线虫病品种鲁薯3号为材料,利用抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,构建了甘薯茎线虫诱导的甘薯块根cDNA文库.从中筛选出1379个阳性克隆进行测序,用CAP3软件聚类拼接,得到185个unique EST.Blast2Go比对ESTs,并进行GO功能分类,结果发现151条非重复序列与已知基因同源性很高,占全部非重复序列的81.6%.已知功能的EST涉及植物的能量代谢、信号转导、抗病防卫、蛋白质合成等多方面.通过对已知功能的基因进行分析,推测促分裂原活化蛋白激酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、过氧化氢酶、几丁质酶、葡聚糖酶等可能参与甘薯接种茎线虫后相关的抗性反应.实时荧光定量PCR分析结果表明,与抗茎线虫病相关的4个基因在甘薯接种线虫后不同时间点具有不同的表达模式.     

西农萨能奶山羊gBTN1A1基因的筛选、克隆及序列分析

利用抑制消减杂交技术研究同一只西农萨能奶山羊泌乳中期和末期的乳腺组织差异表达基因,以泌乳中期乳腺cD-NA为测试组,末期乳腺cDNA为驱动组,构建消减文库,得到山羊(Capra hircus)嗜乳脂蛋白基因的部分序列。根据牛(Bos)和绵羊(Ovisaries L.)基因组序列进行电子拼接,并设计引物,得到山羊嗜乳脂蛋白基因的CDs区全序列,应用RT-PCR技术从山羊乳腺组织总RNA中扩增克隆了山羊嗜乳脂蛋白基因CDs区,命名为gBTN1A1,并登录GenBank(EF102891)。gBTN1A1基因开放读码框由1581个碱基组成,编码526个氨基酸,前26个氨基酸为推定的信号肽区域。gBTN1A1基因核苷酸序列与牛(NM-174508)、人(NM-001732)和鼠(AK145168)的同源性分别为97%、88%和84%,氨基酸序列的同源性分别为96%、84%和70%。其二级结构、跨膜区域及信号肽分析均与牛、人和鼠的BTN1A1基因相似。