基于恒温隔绝式荧光RT-PCR技术现场检测牛纽布病毒方法的建立及应用

纽布病毒(nebovirus,NeV)是引起犊牛腹泻的新发病原,本试验旨在建立基于恒温隔绝式RT-PCR(insu-lated isothermal RT-PCR,iiRT-PCR)技术现场检测NeV的方法.根据NeV的RdRp基因的保守区域,设计并合成引物和探针,优化检测体系和检测试剂预混方法,建立检测NeV的iiR...     

牛传染性鼻气管炎病毒恒温隔绝式荧光PCR检测方法的建立

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的恒温隔绝式荧光PCR(iiPCR)方法,本研究采用文献报道的引物和探针,通过优化反应体系,首次建立了检测IBRV核酸的iiPCR方法。结果显示该方法仅特异性检测出IBRV,而对牛病毒性腹泻-黏膜病病毒、牛副流感3型病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛腺病毒3型、牛冠状病毒、牛支原体、多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌等病原则不能检出。该方法的检测下限为2.4拷贝/μL质粒标准品,并具有良好的重复性。对临床样品的检测结果与OIE推荐的荧光定量PCR方法的检测结果一致;该方法配合PetNAD核酸萃取试剂盒,从核酸提取到报告检测结果仅需1h,具有操作简便、快速、可现地化的特点。对9个省29份商品化冻精检测结果显示,IBRV阳性率为24%(7/29),表明我国流通的商品化冻精携带IBRV情况普遍。本研究为IBRV的现地检测提供了一个可靠的方法。     

恒温隔绝式荧光PCR检测非洲猪瘟病毒核酸方法的建立

恒温隔绝式荧光PCR(iiPCR)是一种简便、快速及可使用于现场检测的荧光PCR方法.本研究采用农业农村部推荐的检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)核酸的荧光定量PCR方法的引物和探针,通过对引物、探针、Taq酶等反应体系的优化,建立了基于恒温隔绝式荧光PCR的ASFV检测方...     

基于恒温隔绝式荧光PCR技术的猪流行性腹泻病毒检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)快速检测方法,参照Gen Bank中PEDV的N基因序列,设计引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立了快速检测PEDV的荧光RT-PCR方法,并验证该法的敏感度、特异性和重复性。结果显示:该方法最佳反应体系为上游引物各1.5μL,下游引物各1.8μL,探针0.7μL,酶1μL,缓冲液12.5μL,模板2μL,补足DEPC水至25μL,获得的标准曲线方程为Ct=-3.15×lg拷贝数+31.72,检测PEDV的敏感度可达0.32 TCID50/100μL,特异性好,对其他猪常见病毒检测结果均为阴性。结果表明:该方法适合猪流行性腹泻快速检测,为该病的诊断和防控奠定了基础。     

无乳链球菌恒温热隔绝式PCR快速检测方法的建立

为建立快速检测无乳链球菌的方法,本研究针对无乳链球菌表面免疫原性蛋白sip基因的保守区域设计特异性引物,建立了快速检测无乳链球菌的恒温热隔绝式PCR(iiPCR)方法。该检测方法能在30 min内迅速扩增出大量大小为105 bp的目的条带;并与肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、乳房链球菌、停乳链球菌均无交叉反应;检测下限为10~2拷贝/μL,优于普通PCR方法。本研究建立的检测方法具有操作简便、高特异性、高敏感性及高扩增效率的特点,适用临床或基层实验室使用。     

牛轮状病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

旨在建立一种SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测牛轮状病毒(BRV)的方法,并采用针对BRV vp6基因序列保守区设计的引物,使用RT-qPCR方法进行目的基因扩增,优化反应条件,制备阳性标准品,建立标准曲线,确定重复性、敏感性和特异性,与常规PCR方法比较。结果显示,建立的RT-qPCR方法最佳引物浓度为5μmol/L,退火温度为58℃,40个循环,熔解温度为77℃±0.5℃,最小检出量8.13copies/μL。两种方法检出率分别为30.4%和19.6%,RT-qPCR具有较高敏感性。建立的RT-qPCR可为BRV感染早期诊断、分子流行病学调查及定量检测分析等提供技术保障。     

4种猪腹泻病毒恒温隔绝式荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

为鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)这4种猪主要腹泻病毒,本研究分别针对PEDV M基因、TGEV M基因、PoRV NSP5基因、PDCoV M基因设计特异性引物和探针,经过方阵法优化恒温隔绝式荧光RT-PCR(iiRT-PCR)反应条件,建立了检测这4种猪腹泻病毒iiRT-PCR方法。用建立的iiRT-PCR方法分别检测PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本脑炎病毒(JEV),并对iiRT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果显示该方法特异性强,对PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV的检测下限分别为10²、10²、10³、10³ TCID₅₀/mL,并具有良好的组内和组间重复性;而荧光定量PCR方法的检测下限分别为10¹、10²、10²、10^2<...     

绵羊肺炎支原体恒温热隔绝式PCR方法的建立

为建立绵羊肺炎支原体(Mo)感染疾病的现场便捷化诊断方法,本研究选择Mo高度保守区域tuf基因设计合成一对特异性引物和探针,建立了恒温热隔绝式PCR(iiPCR)方法并对其特异性、灵敏性进行评价。结果显示,建立的iiPCR方法仅对Mo的典型菌株和其临床分离菌株的DNA呈阳性结果,具有较强的特异性;对Mo基因组DNA的检出下限为24fg/μL,具有较高的敏感性。利用该方法检测临床样品,结果显示该方法可以从临床采集的羊鼻拭子及支气管拭子中检测出MoDNA,对扩增产物的测序表明检测结果具有较高的准确性。本研究建立的iiPCR方法为Mo的检测及其感染疾病的诊断提供了快速、便捷的技术手段。     

鼠轮状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

根据鼠轮状病毒(Murine rotavirus,MRV)EB-C8/G16P毒株VP1基因(GenBank登录号:KJ477127.1),设计引物和Taq Man探针,确定标准曲线,建立MRV荧光定量PCR方法,检测其特异性、敏感性和稳定性。结果显示,建立的MRV荧光定量PCR方法标准曲线的线性关系良好,R2值可达0.99;最低可检测到10 copies/μL,是常规PCR的100倍;与常见的小鼠病毒株均无特异性扩增;批内和批间变异系数均小于2%,表明该方法重复性好。将建立的荧光定量PCR初步对246份小鼠肠道样品病料进行检测,结果均为阴性。本研究建立的MRV荧光定量PCR方法特异性、灵敏性良好,可为鼠轮状病毒的流行病学调查、检测以及制定国家标准和地方标准提供可靠的数据和适用的监测方法。     

恒温热隔绝式PCR技术的原理与应用

由于常规PCR所使用的加热机制为热传导的热循环仪,需要一个精密的数字控制器来快速加热和冷却样品。近年来,越来越多的研究致力于开发一种快速、便携式的核酸检测PCR平台。而自然对流作为另一种热转换方式,能促进液体自发反复循环以提供工作所需的变性、退火和延伸温度,在核酸检测领域有很大的应用前景。恒温热隔绝式PCR(insulated isothermal PCR,iiPCR)就是采用Rayleigh-Be′nard自然对流原理,利用仪器底部单一热源对特殊聚碳酸酯毛细反应管底部的紫铜圈接触加热,毛细管上部置入隔热挡板,上下的温度差从而使毛细管内部流体对流自发形成可供PCR扩增反应的连续的温度梯度,LED屏上直接显示检测结果。与传统的PCR检测方法相比,具有操作简便、快速高效、特异性强、仪器成本低等优点,已开始运用于临床各种病原体的检测。     

猪A群轮状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据近5年来GenBank发布的猪A群轮状病毒(RVA)VP6基因序列,针对保守区域设计1对特异性引物,优化反应体系及条件,建立了TB Green实时荧光定量PCR方法.该方法在模板浓度为1.06×108 copies/μL～1.06×102 copies/μL范围内线性关系良好,相关系数R2 =0.997 5,最低检...     

牛结核分枝杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立可应用于快速检测奶牛结核病、评估鲜乳污染状况、追溯传播途径的试验方法,本研究根据牛结核分枝杆菌基因组设计合成特异性引物,建立实时荧光定量PCR方法,并对反应条件进行优化,构建标准曲线,评价该方法的性能。结果显示,本研究所建立的实时荧光定量PCR方法能有效检测牛结核分枝杆菌目的基因,其最佳引物浓度为400 nmol/L,最佳退火温度为52 ℃。所构建的标准曲线相关性好,可用于样本的定量检测。该方法的性能评价显示,其最小检出模板浓度为80.24 ng/L,且该方法具有较好的特异性、可重复性,可对鲜乳样本进行检测。试验结果表明,本研究所建方法可用于牛结核分枝杆菌的定性和定量检测,这为奶牛结核病的诊断与净化及鲜乳食品安全评估提供重要技术。     

犬轮状病毒荧光定量RT—PCR检测方法的建立

目的:建立轮状病毒快速准确的检测方法,为研发诊断试剂盒和疫苗奠定基础。方法:用Primer5软件设计VP7引物,从采集的腹泻犬粪便样品抽提病毒RNA,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,将RNA反转录为cDNA,并进行PCR扩增,对扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和测序,与代表株的VP7进行同源性比较。结果:从腹泻病犬粪便样品中抽提到了轮状病毒RNA,反转录后扩增产物为51bp的基因片段,经核苷酸序列分析,其PCR序列与犬轮状病毒VP7基因编码源序列的同源性为86.3%。结论:正确克隆了轮状病毒主要保护性抗VP7基因中抗原表位区,建立了犬轮状病毒实时定量诊断方法,为研制实时定量诊断试剂盒奠定了基础。     

轮状病毒套式PCR方法的建立

轮状病毒(Rotavirus,RV)属呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属.现已证实RV是婴幼儿和各种幼龄动物病毒性腹泻的主要病原之一.猪RV在无其他病原存在的实验条件下可引起悉生猪和未食初乳的猪发生严重的胃肠炎和绒毛萎缩.RV的基因组由11节段的双股RNA组成.所有的11个节段都有同样的末端结构,具有5'm'GPPPPGm,3'末端无Poly(A)尾,单一长开放阅读框架(open readingframe,ORF'),缺乏聚腺苷酸序列.ORF两端为5'和3'端的非编码区(5'-and 3'-terminal untranslated regions,UTRs).     

牛支原体套式PCR检测方法的建立

为建立牛支原体检测方法,本研究采用牛支原体的oppD/F基因的两对特异性引物,建立了牛支原体的套式PCR检测方法.该套式PCR可以从100 ccu/mL(color change unit颜色变化单位)的牛支原体培养物中检出目的片段;同时还可以从病牛肺脏、病牛鼻拭子中扩增出目的片段,而且结果与病原分离结果一致.特异性试验结果表明,该方法与其它支原体无交叉反应,是一种特异性强、敏感性高的牛支原体检测方法.     

荧光探针PCR检测牛嵴病毒的方法建立

牛嵴病毒(bovine kobuvirus, BKoV)是与犊牛腹泻密切相关的病原,试验针对BKoV 3D基因设计特异性引物和探针,建立快速检测BKoV的实验室方法。该方法仅能特异性扩增BKoV,对其他犊牛腹泻病原无扩增,特异性较强;对BKoV质粒标准品的最低检出限为11.0拷贝/μL,灵敏性较强;且组内与组间变异系数均小于2%,重复性较好。对采集自河南省的221份犊牛腹泻临床样本进行检测,BKoV的核酸检出率为9.05%(20/221)。本研究建立的检测方法为BKoV的临床快速检测和流行病学调查提供了有效手段。     

牛轮状病毒TaqMan实时荧光RT-PCR 快速检测方法的建立

本研究按照牛轮状病毒(BRV)结构蛋白VP6基因序列,设计合成引物和探针,经各反应条件的优化,建立了BRV TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术。对BRV进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,TaqMan实时荧光RT-PCR最低可检测到100个拷贝病毒RNA;与牛病毒性腹泻病毒(BVD)、猪瘟病毒(CSFV)、牛结核杆菌(MB)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)不发生交叉反应;所制作的标准曲线在10²~10⁹拷贝/μL浓度范围内有极好的线性关系且线性范围宽,相关系数为0.997;与常规的RT-PCR相比,该方法具有快速、特异、敏感、重复性好、可同时检测大量样品等优点。可对样品中微量BRV进行准确检测,对BRV的诊断有重要意义。     

诺如病毒和轮状病毒多重荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

诺如病毒和轮状病毒感染可引起临床高发且症状相似的胃肠炎,急需能够快速准确鉴定两种病毒的方法。用基因保守区域设计特异性引物和探针,通过引物优化、温度调整、性能评估等建立从粪便中特异性检出诺如病毒(GⅠ、GⅡ型)和A组轮状病毒试剂盒。结果显示,最低检测下限为1.0×10³ copies/mL,与当前交叉流行的其他16种病原均不发生特异性反应;组内及组间重复性良好,预混液在不同储存条件下,其检测能力与未处理组无差异。临床收集的276份腹泻样品,共检出诺如病毒GⅠ型15份,GⅡ型74份,A组轮状病毒45份,其检测结果与单一PCR检测结果一致。以上结果表明建立的三重荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、性能稳定等特点,将为2种3个型病毒的特异性检测和疫情防控提供技术支持。     

基于便携式荧光定量PCR仪的猪瘟病毒现场检测方法的建立及应用

为建立猪瘟病毒疫苗株和强毒株一步法双重荧光RT-PCR鉴别检测方法。研究参照GenBank中猪瘟病毒疫苗株以及强毒株特异性基因序列,设计特异引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件,建立了同时检测猪瘟病毒疫苗株和强毒株的双重荧光RT-PCR方法,并验证该方法的特异性、敏感性、重复性。本试验建立的TaqMan-MGB一步法双重荧光定量RT-PCR检测方法可对猪瘟病毒疫苗株和野毒株进行快速鉴别诊断,为猪瘟的净化奠定了基础。     

实时荧光PCR检测牛边缘无浆体方法的建立及应用

根据牛边缘无浆体表面蛋白4的保守基因序列设计特异引物AMOC9/AMOC5、AMOC10/AMOC12和特异性探针MP,首次建立了牛边缘无浆体的实时荧光PCR检测方法,检测DNA的最低限度为200 fg。对中央无浆体、绵羊无浆体、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、羊莫氏巴贝斯虫、山羊泰勒虫、温氏附红细胞体、东方巴贝斯虫、刚地弓形虫和伊氏锥虫进行检测,无荧光检测信号。本研究用所建立的方法检测采自江苏和哈尔滨的180份抗凝血（奶牛和肉牛）,其阳性率为8.9%。结果表明,建立的实时荧光PCR检测牛边缘无浆体的方法具有较高的特异性和敏感性,可用于牛边缘无浆体病的流行病学调查、检疫和监测。