基于RNA-Seq筛选新型鸭细小病毒感染鸭胚成纤维细胞的差异表达基因

为筛选鸭细小病毒(DPV)感染鸭胚成纤维(DEF)细胞后的差异表达基因,本研究利用DPV接种DEF细胞作为试验组,对照组加入相同体积的2%DMEM,培养至72 h后提取2组样品的总RNA,利用RNA-Seq技术筛选出DEF细胞感染DPV后的差异表达基因,并对其进行生物信息学GO功能分类和KEGG分析。结果显示,差异表达水平变化倍数(fold change,FC)在2倍以上的基因共有4 073个,其中上调表达基因1 904个,下调表达2 169个。GO功能分析显示,这些基因主要涉及到炎症反应、免疫反应、蛋白结合、转运活动等功能。KEGG信号通路分析表明,这些差异表达基因参与细胞因子受体相互作用、新陈代谢、TNF、NF-κB、Jak-STAT、Toll样受体等信号通路。应用荧光定量PCR(Real-time FQ-PCR)验证部分差异表达基因的检测结果显示,差异基因的相对表达量与RNA-Seq技术测序结果基本一致,表明了RNA-Seq检测结果的可靠性。本研究为进一步研究DPV的致病作用及宿主抗病机制奠定了基础。     

基于RNA-Seq筛选ALV-J感染汶上芦花鸡肝差异表达致病相关基因

为挖掘感染ALV-J汶上芦花鸡的肝差异表达致病相关基因。本研究以汶上芦花鸡为试验素材,分别在42和300日龄进行ALV血液病毒分离检测筛选ALV阴性和阳性个体,对ALV阳性个体有病理变化的肝组织和阴性个体肝组织进行PCR检测,分别选取3只ALV阳性（G1组）和阴性（G2组）个体的肝组织,并对G1组PCR产物测序、聚类分析确定ALV亚型,利用RNA-Seq测序技术筛选差异表达基因,并进行功能分析,利用荧光定量qRT-PCR对部分差异表达基因进行验证。结果表明,G1组样品经PCR检测、PCR扩增产物测序和聚类分析确定ALV为J亚型,转录组分析发现,共有42个差异基因在GO和KEGG中富集,其中,上调基因18个,下调基因24个。随机选取的5个差异表达基因qRT-PCR验证结果与RNA-Seq测序结果相一致。GO分析显示,差异表达基因主要涉及细胞过程、代谢过程、对刺激的反应、免疫系统等;KEGG分析显示,差异表达基因主要富集在细胞过程、信号传导、疾病、新陈代谢等信号通路。本研究通过转录组分析发现了影响ALV-J致病性的多个基因和关键信号通路,为深入了解ALV-J致病的分子机制提供了思路。     

基于RNA-Seq筛选ALV-J感染汶上芦花鸡肝差异表达致病相关基因

为挖掘感染ALV-J汶上芦花鸡的肝差异表达致病相关基因。本研究以汶上芦花鸡为试验素材,分别在42和300日龄进行ALV血液病毒分离检测筛选ALV阴性和阳性个体,对ALV阳性个体有病理变化的肝组织和阴性个体肝组织进行PCR检测,分别选取3只ALV阳性(G1组)和阴性(G2组)个体的肝组织,并对G1组PCR产物测序、聚类分析确定ALV亚型,利用RNA-Seq测序技术筛选差异表达基因,并进行功能分析,利用荧光定量qRT-PCR对部分差异表达基因进行验证。结果表明,G1组样品经PCR检测、PCR扩增产物测序和聚类分析确定ALV为J亚型,转录组分析发现,共有42个差异基因在GO和KEGG中富集,其中,上调基因18个,下调基因24个。随机选取的5个差异表达基因qRT-PCR验证结果与RNA-Seq测序结果相一致。GO分析显示,差异表达基因主要涉及细胞过程、代谢过程、对刺激的反应、免疫系统等;KEGG分析显示,差异表达基因主要富集在细胞过程、信号传导、疾病、新陈代谢等信号通路。本研究通过转录组分析发现了影响ALV-J致病性的多个基因和关键信号通路,为深入了解ALV-J致病的分子机制提供了思路。     

鸭肠炎病毒感染鸭肝脏组织miRNA表达谱差异分析

为探究鸭感染鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus,DEV）后肝脏miRNA表达谱的差异,试验以DEV-GZ株经腿部肌肉接种30日龄麻鸭,于感染后66、90和114 h采集鸭肝脏组织样本,提取组织总RNA,经质检合格后,采用高通量测序技术对对照组和试验组样品进行miRNA测序,筛选出DEV感染鸭肝脏组织的差异表达miRNA,对其进行生物信息学GO功能分类和KEGG信号通路分析,并随机选取部分差异表达miRNA进行实时荧光定量PCR验证。结果显示,鸭感染DEV后66、90和114 h,肝脏组织差异表达miRNAs数量分别为227、225和231个。GO功能注释显示,感染鸭肝脏差异表达miRNA在生物过程分类中主要为细胞过程、单有机体过程和代谢过程类别;在细胞成分分类中主要是细胞、细胞部分和细胞器类别;在分子功能分类中主要是绑定分子功能和催化活性功能类别。KEGG通路富集显示,差异表达miRNA主要涉及PI3K-Akt、JAK-STAT、磷脂酰肌醇信号通路系统、ECM-受体相互作用、MAPK、Wnt、Toll样受体、IL-17、脂质代谢、钙离子信号通路和cAMP等信号通路,其中感染66 h差异表达miRNA主要在生物系统及神经系统中发挥作用;感染90 h主要在内分泌系统及消化系统中发挥作用;感染114 h主要在全身生物、免疫和消化系统等中发挥作用。选取10个差异表达miRNAs进行实时荧光定量PCR验证,结果与高通量测序结果一致。表明DEV感染对鸭肝脏组织miRNA表达具有显著影响,为从宿主miRNA角度揭示DEV致病机制提供了参考依据。     

基于RNA-Seq技术的塔里木马鹿毛色相关差异表达基因筛选及初步分析

旨在基于RNA-Seq技术对塔里木马鹿毛色相关基因进行筛选及分析。采用Illumina Hi Seq TM2000测序平台对塔里木马鹿和天山马鹿的皮肤组织进行转录组测序,所得序列经质控、组装后比对到NR、Swiss-Prot、COG、KOG、KEGG、GO和Pfam数据库中注释,并对差异表达基因进行筛选、功能注释和富集分析。结果表明,测序获得25 038个有注释信息的Unigenes,比对分析显示,塔里木马鹿与天山马鹿有922个差异表达基因,其中上调表达基因495个,下调表达基因427个;GO功能富集分析结果显示,568个差异表达基因富集到61个GO条目上,分别参与了生物学过程、细胞组分及分子功能;KEGG代谢通路富集分析发现,在差异表达基因中富集最显著的代谢通路是ECM-受体相互作用。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析与塔里木马鹿毛色相关的7个候选基因的转录水平变化来验证转录组测序结果的准确性和可靠性,这些基因的表达趋势与转录组测序结果相一致。ECM-受体相互作用、蛋白质消化与吸收、PI3K-Akt信号通路及与黑色素合成相关的酪氨酸等通路可能与塔里木马鹿的毛色有关;候选基因MITF、Ggt1、VDR、PTPRF、CⅡTA、ARPC5L、POMC等可能在塔里木马鹿毛色形成过程中发挥重要作用。本研究结果为今后塔里木马鹿毛色相关基因的分子调控机制方面及挖掘潜在的新基因提供了丰富的试验数据。     

基于RNA-Seq筛选禽致病性大肠杆菌损伤雏鸡小肠差异表达基因

为筛选禽致病性大肠杆菌(APEC)感染雏鸡后其小肠损伤的差异表达基因,本研究利用APEC菌株经腿部肌肉途径接种两周龄雏鸡,对照组鸡以相同的途径注射相同体积的生理盐水,选取病变严重的肠道与对照组肠道,利用高通量RNA-Seq技术筛选出雏鸡小肠受APEC损伤后的差异表达基因,对其进行生物信息学GO功能分类和KEGG信号通路分析,并利用荧光定量PCR验证部分差异表达基因。结果显示差异变化在2倍以上的基因共有131个,其中74个上调表达,57个下调表达。GO功能分类结果显示,这些基因主要涉及到蛋白结合、免疫反应、转运活动等功能。KEGG分析表明这些差异表达基因参与PPAR、新陈代谢、细胞因子受体相互作用、Jak-STAT、RIG-I-样受体、吞噬体等信号通路。本研究为进一步研究APEC的致病作用及宿主抗病机制奠定了基础。     

人工感染沙门菌牦牛脾中相关差异表达基因筛选

旨在从基因组转录水平解析牦牛抗沙门菌感染相关免疫基因及其调控网络。以牦牛沙门菌为模式病原体,以牦牛为研究对象,在12、24、48h三个不同时间段利用RNA-Seq测序技术对感染牦牛的外周免疫器官脾进行转录组测序。通过比较分析三个时间段感染牦牛和健康牦牛转录组数据,筛选出差异基因,然后对这些差异基因进行GO、KEGG功能分析,并进行共表达网络分析。结果共筛选出413个差异基因,其中185个表现为上调,228个表现为下调,GO分析显示,与生物过程相关的类别比例最大,其中最为富集的是细胞过程、代谢过程、生物调节、生物过程的调控及单一有机体过程。KEGG分析显示,各时间段富集前20的通路中,与感染、免疫相关的通路占有较大比例,这些通路涉及的差异基因主要为趋化因子。WGCNA分析显示,处于网络枢纽的基因共66个,处于网络中心的基因是SCOC和NOCT。本研究在组学层面上探讨了牦牛脾细胞与沙门菌的分子互作机制。     

鸭瘟病毒感染鸭十二指肠黏膜炎症相关基因及调控通路的筛选

试验旨在分析鸭瘟病毒（duck plague virus,DPV）感染樱桃谷鸭后十二指肠黏膜转录组水平的变化,筛选出DPV感染后参与炎症的相关基因和调控通路。DEV-GZ株经腿部肌肉接种35日龄鸭后,于接种后24、48和72 h采集鸭十二指肠黏膜组织样本,提取总RNA进行转录组测序,对数据进行质控与注释,筛选与炎症相关的差异表达基因及调控通路,并应用实时荧光定量PCR对部分差异表达基因进行验证。结果显示,对照组与试验组总计得到21.39 Gb的Clean Bases,测序样本有效序列占原始序列的99%以上,映射率高于83%。鸭接毒DPV后24 h十二指肠黏膜的差异表达基因有221个,参与炎症相关生物学过程的有3个,均为下调基因;接毒DPV后48 h差异表达基因有499个,参与炎症相关生物学过程的有17个,均为下调基因;接毒DPV后72 h差异表达基因有798个,参与炎症相关生物学过程的有20个,其中上调基因13个、下调基因7个。GO数据库分析显示,参与炎症相关的差异表达基因主要是CCR8、CCL19、CCL4、IL-17、IRF1、IFN-γ、SLC11A1等,涉及急性炎症反应、趋化因子受体活性、急性期反应、炎症反应和炎症反应的正调节等生物学过程。KEGG数据库分析显示,差异表达炎症相关基因主要富集在Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路和炎症性肠病等;实时荧光定量PCR结果显示,IFN-γ和MALT基因的相对表达倍数与转录组结果基本一致。本试验完成了DPV感染樱桃谷鸭十二指肠的转录组测序分析,获取了差异表达基因的功能注释信息,初步揭示了参与DPV感染的炎症相关通路,为深入探究DPV的致病机制提供了理论参考。     

中药茜草对鸭肠炎病毒感染鸭免疫器官病理损伤的影响

为探究中药茜草对鸭肠炎病毒感染所致鸭免疫器官组织病理损伤的影响,将30日龄健康三穗麻鸭随机分成给药组(中药干预)、模型组(病毒感染组)和对照组,经相应处理后于处理66、90和114 h时扑杀,采集相关组织和血清样本进行病原核酸PCR扩增、免疫器官指数测定、血清生化指标检测和病理组织切片观察.结果 显示:与模型组相比,给...     

基于RNA-Seq技术对高黎贡山猪与杜洛克猪背最长肌差异表达基因的筛选

为了筛选出高黎贡山猪与杜洛克猪背最长肌的差异表达基因,为高黎贡山猪的分子选育提供科学依据,试验选用胎次相近、70日龄的高黎贡山猪和杜洛克猪各10头(5♂,5♀),在相同的饲养管理条件下饲养至260日龄,屠宰12头,其中高黎贡山猪6头(3♂,3♀)、杜洛克猪6头(3♂,3♀),利用RNA-Seq技术对两个品种猪背最长肌肌肉组织进行测序,先使用edgeR软件对高黎贡山猪与杜洛克猪背最长肌转录组数据进行差异分析,再将差异表达基因进行GO富集分析和KEGG富集分析。结果表明:高黎贡山猪与杜洛克猪差异表达的基因、显著富集的通路大部分与脂肪的沉积、代谢和脂肪细胞分化相关。说明高黎贡山猪与杜洛克猪背最长肌的肌内脂肪含量受基因转录水平的调控。     

基于RNA-Seq绒山羊皮肤两种毛囊差异表达基因的分析

为了研究绒山羊皮肤初级毛囊和次级毛囊之间的表达基因模式的差异,筛选影响毛囊发育的重要基因,对6只内蒙古绒山羊阿尔巴斯型个体进行RNA-seq测序,利用生物信息学方法对转录组数据进行分析,在测序结果质量控制后的基础上,对差异表达基因进行筛选、功能注释和富集分析。共筛选到617个在初级毛囊和次级毛囊中差异表达的基因,其中,上调表达基因297个,下调表达基因320个。GO功能注释结果显示,上调表达基因主要行使电子传递链、呼吸链电子传递、线粒体电子传递、基因表达等生物学功能;下调表达基因主要行使细胞吞噬、蛋白质复性、中性粒细胞聚集、细菌真菌防御反应等生物学功能。利用KEGG数据库作为参考,这些基因主要参与半胱氨酸和蛋氨酸代谢、RNA聚合、RNA可变剪切、底物磷酸化等通路。PPP2R2A和CDK2AP1基因可能在皮肤毛囊发育中发挥重要作用,以上结果为今后深入研究皮肤毛囊发育相关基因及功能提供了依据。     

表达谱芯片筛选獭兔毛色相关候选差异表达基因

本研究旨在了解青紫蓝色獭兔和白色獭兔毛色形成的分子遗传学机理。试验分为3组,每组包含全同胞青紫蓝獭兔和白色獭兔各1只。利用安捷伦基因芯片技术分析不同分组之间差异基因表达情况,并通过实时荧光定量PCR方法对部分差异显著基因进行验证。差异表达分析结果显示,3组青紫蓝色獭兔对白色獭兔分别筛选出545、1 680和2 092个差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),共有172个共同基因;GO(Gene Ontology)分类结果显示,这些基因主要参与细胞分化、增殖、凋亡、发育、离子转运、免疫应答等生物学过程。通过实时荧光定量PCR技术对Creb1、Wnt2、Gnaq和Gna14基因在组织样中的表达量进行检测,结果与表达谱芯片一致。通过表达谱芯片结果结合生物信息学分析和文献报道,筛选出了Creb1、TH、Wnt2、Gnaq、Dvl1、Mapk12等对毛色形成可能具有重要影响的候选基因。     

鸭冠状病毒肠炎免疫试验

人工感染鸭冠状病毒的鸭在痊愈后的一段时间内能抵抗强毒再次感染,对鸭场调查表明：得病后痊愈的鸭很少有再次发病的。用鸭胚上传代培养的第５代病毒,经灭活加佐剂制成灭活苗对鸭进行免疫试验,大部分鸭有一定的免疫效果;对我们已传代至７５代的鸭胚传代毒,经口服、肌注两种途径免疫鸭,有较好的免疫效果;用康复鸭的血清对２０日龄的鸭实施被动免疫,未能保护鸭抵抗强毒的攻击;康复鸭产蛋孵出的雏鸭缺乏抵抗强毒攻击的母源抗体。     

基于RNA-Seq数据分析葡萄糖诱导绵羊卵泡颗粒细胞衰老的差异表达基因

【目的】 探讨葡萄糖对绵羊卵泡颗粒细胞衰老及其基因表达的影响。【方法】 将原代分离培养的绵羊卵泡颗粒细胞分别用含17.5(H组)和2 mmol/L(L组)葡萄糖的培养基进行体外培养, 细胞处理72 h后, 利用β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老, 采用RNA-Seq技术进行转录组测序, 对差异表达基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析, 并用实时荧光定量PCR验证锚定蛋白重复域蛋白1(ANKRD1)、白细胞介素8(IL-8)、催产素(OXT)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)基因的表达量。【结果】 H组β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率极显著高于L组(P<0.01)。转录组测序结果显示, 两组间存在401个差异表达基因, 其中上调基因153个, 下调基因248个, 高糖诱导的细胞异常相关基因9个, 细胞周期相关基因6个。GO功能富集分析发现, 差异表达基因参与了细胞过程、生物调节、代谢过程、多细胞生物过程及细胞运动等生物过程, 在细胞成分上主要富集在胞外区、膜、突触、细胞器及超分子复合体等, 在分子功能主要富集在催化活性、整合、转运活性、分子功能调节剂及结构分子活性等。KEGG信号通路富集分析发现, 差异表达基因主要富集在糖尿病并发症中的晚期糖基化产物(AGE)-晚期糖基化终末产物受体(RAGE)信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路等。实时荧光定量PCR结果表明, 与L组相比, H组IL-8基因表达水平极显著上调(P<0.01), ANKRD1基因表达水平显著上调(P<0.05), OXT基因表达水平极显著下调(P<0.01), NOX4基因表达量呈上升趋势, 但差异不显著(P>0.05), 实时荧光定量PCR结果与转录组测序结果一致。【结论】 17.5 mmol/L葡萄糖可诱导绵羊卵泡颗粒细胞衰老及衰老相关基因表达变化, 为葡萄糖诱导颗粒细胞衰老的功能和分子机制提供了依据。     

鸭肠炎病毒感染对鸭肠道菌群多样性的影响

为揭示鸭肠炎病毒(DEV)感染对鸭肠道菌群多样性的影响,本研究采用16S rRNA基因高通量测序和Illumina Hiseq 2500高通量测序技术对DEV感染后鸭肠道菌群多样性和丰度进行分析。结果显示:与对照组比较,感染组鸭肠道菌群Alpha多样性指数均呈先升高后降低趋势,尤其是在DEV感染96 h和120 h后,鸭肠道菌群Beta多样性(Weighted Unifrac指数)距离越远,相似度越低;DEV感染后鸭肠道优势菌群主要分布于厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和梭杆菌门,梭菌纲、丙型变形菌纲、拟杆菌纲和梭杆菌纲,梭菌目、肠杆菌目、拟杆菌目和梭杆菌目,肠杆菌科、消化链球菌科、拟杆菌科和梭杆菌科,大肠杆菌志贺菌亚属、拟杆菌属、梭菌属和Turicibacter属,尤其是产气荚膜梭菌和坏死梭杆菌呈先下降后升高趋势,这可能与DEV感染所导致的肠道病变存在一定的关联性。本研究结果为DEV致病机理及其所致疾病的防控研究奠定了基础。     

Cofilin在鸭肠炎病毒感染过程中的影响

为了解Cofilin在鸭肠炎病毒（DEV）感染过程中的作用及DEV致病机制。以受精鸭蛋、鸭肠炎病毒GZ株为主要研究对象,根据测序获得鸭源-Cofilin2全基因序列,提取和筛选Cofilin2-shRAN,利用FQ-PCR对细胞Cofilin基因转录水平进行测定,分析Cofilin基因的RNAi对DEV的影响。DEF细胞转染处理过程中,转染成功的干扰质粒共有4个,其中Cofilin2-shRAN-86沉默效益最高,可促进DEV的增殖效果。     

猪传染性胃肠炎病毒感染相关猪源miRNA的筛选及表达差异分析

经生物信息学预测发现猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)3′UTR可能是ssc-miR-182的潜在作用位点,本研究以猪传染性胃肠炎病毒为研究对象,构建TGEV 3′UTR双荧光素酶报告基因载体,并将其与合成的ssc-miR-182模拟体瞬时共转染至猪小肠上皮细胞,通过荧光监测仪测定荧光素酶活性;同时通过荧光定量PCR方法检测TGEV感染猪小肠上皮细胞后在不同时间段ssc-miR-182的表达变化情况。研究结果显示,ssc-miR-182对TGEV 3′UTR有一定的抑制作用,并且TGEV在感染小肠上皮细胞以后ssc-miR-182的表达明显上调。结果表明,宿主ssc-miR-182与TGEV的感染和复制增殖相关。     

基于RNA-Seq技术筛选影响猪肌纤维性状的候选基因

旨在探究影响肌纤维性状的候选基因和信号通路。本研究以马身猪和大白猪为研究对象,采用HE染色法分析6月龄马身猪和大白猪背最长肌肌纤维直径和密度,利用RNA-Seq分析马身猪和大白猪背最长肌组织中基因表达情况,并对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析,再通过qRT-PCR验证RNA-Seq结果的准确性。结果显示,马身猪背最长肌肌纤维直径极显著低于大白猪(P<0.01),而肌纤维密度极显著高于大白猪(P<0.01)。转录组测序结果显示,在6月龄马身猪和大白猪背最长肌中,差异倍数在2倍以上的基因共105个,其中,马身猪相对于大白猪上调的基因有55个,下调的基因有50个。GO富集分析表明,差异表达基因主要富集在与线粒体相关的细胞组分和骨骼肌分化有关的生物学过程中;KEGG分析结果显示,这些差异表达基因主要参与到与氧化磷酸化有关的信号途径。qRT-PCR和RNA-Seq对6个DEGs表达情况的检测结果表明它们的表达趋势相同,说明RNA-Seq结果准确可靠。结合差异基因表达丰度、GO和KEGG富集分析结果,本研究发现,MYL3、MYH3、MYH6基因通过影响肌纤维的组成而影响肌纤维特性,ND6基因通过参与线粒体氧化磷酸化过程影响肌纤维类型,MICU2基因通过维持线粒体Ca²⁺浓度的稳态影响细胞功能,编码转录因子的EGR1和FOS基因通过调节细胞增殖、分化和凋亡等过程影响肌肉生长发育。本研究初步揭示了造成马身猪和大白猪肌纤维性状差异的主要原因,为猪肉品质的改善提供了相应的理论依据。     

非洲猪瘟病毒感染相关调控基因以及毒力基因初步筛选

本研究旨在初步筛选非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染过程中与宿主相互作用的调控基因以及毒力基因,为非洲猪瘟(African swine fever, ASF)特效药以及疫苗研发提供分子理论基础。利用GSE145954数据集和文献挖掘,分析ASFV强毒株和弱毒株感染后宿主差异表达基因;使用Metascape数据库对差异基因进行基因功能富集分析,通过交互基因检索工具(STRING)数据库建立蛋白相互作用网络,经网络拓扑结构筛选获得病毒感染宿主调控网络关键基因,随后在细胞水平筛选调控该关键基因的ASFV毒力基因。研究发现ECE1、CCL2、CTSB、SCARB2和CD14在ASFV感染单核巨噬细胞和动物全血中均明显上调,HMBS、DYNLL1、UBB、EZH2和SERPINE1则明显下调。蛋白质相互作用(PPI)分析表明,宿主UBB、CCL2、CTSB、EZH2、SERPINE1、CD14和DYNLL1为ASFV感染宿主调控网络关键基因,其中UBB占据核心地位。ASFV B119L、I215L以及MGF360-13L可抑制UBB的表达。结果提示...     

高邮鸭与金定鸭GnRHR2基因组织表达差异分析

克隆鸭GnRHR基因序列,并研究其对产蛋性能的调节作用.采用RT-PCR技术从鸭生殖轴组织总RNA中克隆GnRHR基因cDNA序列,并利用Real-time PCR技术分析GnRHR基因在不同产蛋期高邮鸭和金定鸭生殖轴组织中的表达.序列分析结果表明克隆序列长度约500 bp,属Ⅱ型GnRHR基因序列,与家鸡cGnRHR...