Ghrelin在梅花鹿体内的免疫组化定位研究

为了阐明胃饥饿素(Ghrelin)在梅花鹿体内的表达规律,采用免疫组织化学方法检测Ghrelin在梅花鹿食管、瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、肝、胰、甲状腺、垂体前叶、卵巢、肺、肾和脾等组织中的分布规律。结果显示:Ghrelin免疫阳性细胞在食管和皱胃内主要分布于黏膜层、黏膜下层和肌层;在网胃、瓣胃和瘤胃的黏膜层及黏膜下层中均可见Ghrelin免疫阳性细胞,但肌层中未见表达;在肠道主要定位于黏膜层、黏膜下层和肌层,尤其在肠绒毛和黏膜下层分布较多;在肝、胰、甲状腺、垂体前叶、卵巢、肺、肾、脾等实质器官中同样发现有Ghrelin免疫阳性信号的表达。结果提示,Ghrelin在梅花鹿体内广泛表达且在食管和胃肠道内分布范围最广。     

梅花鹿PTN基因cDNA克隆及表达分析

为了探究多效生长因子(PTN)基因在鹿茸生长发育中的调控作用,试验采用分子克隆技术得到包括PTN基因全部编码区的cDNA序列,并结合生物信息学方法、实时荧光定量PCR技术对其进行分析。结果表明:获得的PTN基因cDNA序列长度为750 bp,共编码168个氨基酸;PTN蛋白分子质量为18.93 ku,理论等电点为9.66,是信号肽介导的一种亲水性蛋白质;其二级结构以无规则卷曲为主,其次是α-螺旋和β-折叠,分别占47.62%、32.74%和19.64%;梅花鹿PTN基因在进化上较为保守,与白尾鹿、野猪、牛等偶蹄目动物亲缘关系较近,与斑纹海豚、豚鼠、人亲缘关系较远;实时荧光定量PCR分析显示,PTN基因在不同生长时期的鹿茸顶端间充质组织中表达差异显著,表达量在生长中期明显高于前期和后期。     

家蚕冷激蛋白BmCSP的表达及亚细胞定位分析

冷激蛋白是一种多功能RNA/DNA结合蛋白,其特征是存在1个或多个冷激域,不仅可以调节自身的表达,还可以调节许多与疾病相关基因的表达,并协调多种细胞过程,包括增殖和分化。家蚕体内存在一个冷激蛋白(Bombyx moricold shock protein,BmCSP),通过构建重组表达载体pET-28a-BmCSP进行表达纯化和多克隆抗体制备,制备的抗体效价大于1∶12 800。通过实时荧光定量PCR和免疫印迹(Western blotting)对家蚕各个发育时期及5龄幼虫各个组织的BmCSP基因和蛋白质的表达水平进行检测,发现在5龄幼虫期和5龄幼虫生殖腺的表达水平最高,而蛾期和头部中的表达水平最低。推测BmCSP蛋白可能在家蚕生殖过程中发挥一定作用。通过免疫细胞化学技术在家蚕卵巢细胞中进行亚细胞定位分析,发现BmCSP蛋白在整个细胞周期主要分布于细胞质中,但在4℃冷激2 h后,BmCSP蛋白则同时位于细胞核和细胞质内且表达水平上升。推测BmCSP蛋白在冷激情况下向细胞核内迁移,可能对家蚕细胞处于低温条件下保护细胞核正常的生理活动和细胞存活起重要作用。     

梅花鹿Myf5基因的cDNA克隆及表达分析

为获得梅花鹿生肌调节因子(Myf5)基因编码区序列(CDS),并探讨该基因在雌雄梅花鹿及其不同部位的肌组织间差异表达情况,以成年健康雌雄梅花鹿心肌、背最长肌、股四头肌、臀大肌、肋间肌组织为试验材料,以臀大肌组织cDNA为模板克隆获得Myf5基因CDS,运用生物信息学软件进行测序及分析,并利用实时荧光定量PCR技术检测Myf5基因在不同部位的肌组织间相对表达量。结果表明：克隆得到的梅花鹿Myf5基因CDS全长为768 bp;与GenBank上公布的家牛(Gene ID:281335)Myf5基因CDS的同源性为99.61%;梅花鹿与家牛的遗传距离最近,聚为同一支;梅花鹿Myf5蛋白氨基酸组成中丝氨酸含量最高,占氨基酸总量的13.3%;Myf5蛋白具有较强的亲水性,其蛋白二级结构包含α-螺旋、延伸链、无规则卷曲和β-折叠;荧光定量结果分析表明,梅花鹿Myf5基因在雌、雄梅花鹿及其不同部位的肌组织间均有差异性表达。     

山羊 Notch1基因的表达及细胞定位

为了进一步了解Notch1蛋白,本研究用BLAST方法对不同动物Notch1基因的同源性及遗传进化情况进行了分析,通过PCR扩增获得Notch1基因,并构建了与GST标签融合表达的原核表达载体、与GFP标签融合表达的真核表达载体。将双酶切和测序鉴定的阳性克隆分别转化BL21感受态细胞和转染BHK21细胞进行原核和真核表达,并用Western blot和荧光显微镜鉴定。同时,与GFP标签对照确定其在细胞中的定位情况。结果显示,扩增的Notch1基因片段约780 bp,为Notch1基因的部分序列,Notch1在不同动物间的基因序列同源性为94%以上,遗传进化关系上分为3个分支。Western blot检测结果显示,构建的原核表达pGEX-KG-Notch1能够表达预期大小为56 kDa的融合蛋白;荧光显微镜检测显示Notch1与GFP的融合蛋白分布在整个细胞中,但主要集中于细胞核,而GFP空白对照仅分布于细胞质中,说明Notch1主要定位于细胞核中。本研究为进一步探索Notch1与KLP1的相互作用及其功能奠定了基础。     

梅花鹿colX基因的克隆及原核表达

提取健康梅花鹿鹿茸肥大软骨细胞总RNA,以RT-PCR获得colX基因2 038 bp的完整编码序列,将其克隆入载体pMD18-T中,经限制性内切酶和质粒PCR分析,并测序证实的阳性重组子与表达载体pET-28a( )连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)。以IPTG诱导,经SDS-PAGE及Western-blot分析表明,获得相对分子质量为65 000的colX蛋白表达带,与预期相符,表明成功获得梅花鹿colX基因蛋白。     

家蚕脂蛋白基因BmLp-c21的表达分析及蛋白质亚细胞定位

家蚕30 kD脂蛋白家族在家蚕的生长发育过程中具有重要的生理功能。从家蚕蛹cDNA文库中克隆到一条编码30kD蛋白质的基因cDNA序列,该序列全长2 803 bp,ORF为792 bp,编码含263个氨基酸残基的脂蛋白(low molecular 30K lipo-protein pBmHPC-21;GenBank登录号:Q00801),命名为BmLp-c21。将BmLp-c21克隆至原核表达载体pET-28a(+),转化E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达后通过亲和层析得到纯化的融合蛋白,并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。亚细胞定位显示BmLp-c21主要存在于细胞质中,呈点状或者片状分布。通过实时荧光定量PCR和Western blotting方法,分别检测到家蚕不同发育时期和5龄幼虫不同组织中BmLp-c21 mRNA的转录水平与蛋白质的表达水平存在较大差异,在蛹期及5龄幼虫血淋巴中的mRNA转录水平和蛋白质表达水平最高。初步推测BmLp-c21在家蚕蛹的变态发育过程以及蚕体脂质的运输方面具有重要的功能。     

家蚕Mod基因的序列分析及表达与亚细胞定位研究

已知多数含BTB/POZ结构域的锌指蛋白对生物体的发育、分化及染色体重组等具有重要的调节作用。从已构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条编码MOD(mdg4)蛋白的基因序列(GenBank登录号:DN237077)。该基因序列的ORF长1 080 bp,编码359个氨基酸残基,蛋白含有BTB保守结构域和FLYWCH保守结构域,与黑腹果蝇、冈比亚按蚊、赤拟谷盗和埃及伊蚊的MOD多序列比对,其同源性不超过40%。表达、纯化带有His标签的家蚕MOD蛋白(BmMOD),并用纯化的融合蛋白免疫新西兰兔获得多克隆抗体。实时荧光定量PCR显示BmMod基因mRNA转录水平在家蚕蛾期及5龄幼虫的卵巢最高,推测BmMod基因在家蚕生殖腺发育过程中产生一定作用。利用纯化的BmMOD蛋白多克隆抗体进行Western blotting分析也表明该蛋白在家蚕蛾期及5龄幼虫卵巢中的表达量最高,验证了BmMod在家蚕生殖腺发育中的功能。亚细胞定位结果显示BmMOD蛋白几乎完全定位于家蚕卵巢上皮细胞(BmN)的细胞核中。     

梅花鹿α干扰素基因在MDBK细胞中表达及抗BVDV活性检测

采用基因工程技术克隆出梅花鹿α干扰素(IFN-α)成熟肽基因序列,并将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.0(+),经酶切、PCR及测序鉴定,成功构建了pcDNA3.0-IFN-α真核重组表达质粒。将鉴定正确的阳性重组质粒经非脂质体法转染至MDBK细胞,间接免疫荧光试验检测其具有较高转染效率;Western blot法检测IFN-α蛋白在MDBK细胞中得到有效表达;病变抑制试验检测转染后的MDBK细胞具有明显抗BVDV活性;抗BVDV活性的定量试验表明转染pcDNA3.0-IFN-α质粒的MDBK细胞与感染未转染的MDBK细胞相比抗BVDV活力提高了66192倍。本试验在MDBK细胞中成功表达了梅花鹿IFN-α,并检测出其具有明显抗BVDV作用,这为梅花鹿IFN-α活性机理研究以及开发更高效的抗梅花鹿病毒性疾病干扰素制剂提供物质和理论基础。     

梅花鹿前景及市场分析

鹿是特种动物，在人工饲养条件下可以生产繁殖，其主要产品鹿茸被称为“东北三宝”之一，具有很高的经济价值。鹿的其他产品如鹿肉、血、鞭、胎、皮及心、肾、肝等内脏都有很好的食和、药用价值，其中鹿肉以高蛋白、低脂肪、低胆固醇及其独特风味等特点深受人们喜爱。我国饲养的鹿主要有梅鹿、马鹿、白唇鹿、麋鹿与水鹿等，其中主要的是茸用梅花鹿与马鹿。     

梅花鹿表达序列标签资源的微卫星信息分析

微卫星标记(simple squenee repeat,SSR)是真核生物基因组中l～6个核苷酸的串联重复,被公认为是各类遗传标记中最有效的分子标记之一.快速增长的表达序列标签(expressed sequence tags,EST)为微卫星标记的开发提供了巨大的来源.     

高羊茅FaRVE8基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

生物钟是一个复杂的调控网络,在环境的不断变化中促进植物的生长,REVEILLE8 (RVE8)是生物钟的重要基因。为探讨其分子机理,采用RT-PCR和RACE方法,克隆高羊茅叶片FaRVE8基因,结果显示,FaRVE8全长为1881 bp,有1236 bp的开放阅读框,编码411个氨基酸,同属于MYB样因子。遗传进化树表明其与禾本科植物二穗短柄草、节节麦、大麦的同源蛋白亲缘关系较近。利用荧光定量分析高羊茅叶片中FaRVE8在不同光照处理下的表达特征,结果表明,FaRVE8在不同光照处理下均有表达,且呈现出明显的昼夜节律。亚细胞定位显示FaRVE8定位在细胞核中,可能在细胞核中发挥重要作用。以上研究表明,FaRVE8在调节生物节律中有重要作用,为进一步探讨FaRVE8基因的功能和分子调控机制奠定基础。     

鸡TATA结合蛋白的亚细胞定位及基因组织表达特性分析

为探究鸡TATA结合蛋白(TATA-binding protein,TBP)的亚细胞定位以及TBP基因在鸡胚不同发育阶段不同组织中的表达情况,首先扩增鸡TBP基因的蛋白质编码区(CDS),将其亚克隆至真核表达载体pCMV-Myc构建重组真核表达载体pCMV-Myc-TBP,转染人胚胎肾细胞(HEK-293T),然后利用...     

滑液支原体GDPD基因的原核表达、酶活性分析及亚细胞定位

为了解滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(glycerophosphodoester phosphodiesterase,GDPD)的生物学功能,本试验参照GenBank中MS WVU1853株序列设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得MS WVU1853株GDPD基因,在测序及序列分析的基础上将其克隆至pET-28a(+)质粒构建原核表达载体pET-GDPD,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导表达,纯化表达产物并分析其酶促活性,进而制备其多克隆抗体,应用间接ELISA和Western blotting检测其免疫原性并分析其在MS内的分布。结果表明,MS WVU1853株GDPD基因CDS全长726 bp,编码242个氨基酸,重组蛋白分子质量约为28 ku。酶促活性检测表明,重组蛋白可催化对硝基苯磷酸二钠(pNPP)转化为对硝基苯酚,且其作用的最适pH为9.0,最佳温度为37℃,Pb~(2+)具有较强的抑制作用,而Ca~(2+)对其具有较强的促进作用。间接ELISA及Western blotting检测结果表明,MS GDPD具有良好的免疫原性,可刺激新西兰兔产生高水平的抗体,血清效价高达1∶160 000;亚细胞定位结果表明,MS GDPD在细胞膜和细胞浆内均有分布,但在细胞膜的含量略高于细胞浆。本研究结果为探究MS GDPD生物学功能提供了一定的参考依据。     

高羊茅FaRVE8基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

生物钟是一个复杂的调控网络,在环境的不断变化中促进植物的生长,REVEILLE8 (RVE8)是生物钟的重要基因。为探讨其分子机理,采用RT-PCR和RACE方法,克隆高羊茅叶片FaRVE8基因,结果显示,FaRVE8全长为1881 bp,有1236 bp的开放阅读框,编码411个氨基酸,同属于MYB样因子。遗传进化树表明其与禾本科植物二穗短柄草、节节麦、大麦的同源蛋白亲缘关系较近。利用荧光定量分析高羊茅叶片中FaRVE8在不同光照处理下的表达特征,结果表明,FaRVE8在不同光照处理下均有表达,且呈现出明显的昼夜节律。亚细胞定位显示FaRVE8定位在细胞核中,可能在细胞核中发挥重要作用。以上研究表明,FaRVE8在调节生物节律中有重要作用,为进一步探讨FaRVE8基因的功能和分子调控机制奠定基础。     

滑液支原体GDPD基因的原核表达、酶活性分析及亚细胞定位

为了解滑液支原体（Mycoplasma synoviae,MS）甘油磷酸二酯磷酸二酯酶（glycerophosphodoester phosphodiesterase,GDPD）的生物学功能,本试验参照GenBank中MS WVU1853株序列设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得MS WVU1853株GDPD基因,在测序及序列分析的基础上将其克隆至pET-28a（+）质粒构建原核表达载体pET-GDPD,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经IPTG诱导表达,纯化表达产物并分析其酶促活性,进而制备其多克隆抗体,应用间接ELISA和Western blotting检测其免疫原性并分析其在MS内的分布。结果表明,MS WVU1853株GDPD基因CDS全长726 bp,编码242个氨基酸,重组蛋白分子质量约为28 ku。酶促活性检测表明,重组蛋白可催化对硝基苯磷酸二钠（pNPP）转化为对硝基苯酚,且其作用的最适pH为9.0,最佳温度为37℃,Pb²⁺具有较强的抑制作用,而Ca²⁺对其具有较强的促进作用。间接ELISA及Western blotting检测结果表明,MS GDPD具有良好的免疫原性,可刺激新西兰兔产生高水平的抗体,血清效价高达1：160000;亚细胞定位结果表明,MS GDPD在细胞膜和细胞浆内均有分布,但在细胞膜的含量略高于细胞浆。本研究结果为探究MS GDPD生物学功能提供了一定的参考依据。     

梅花鹿IFN-β1的原核表达及活性鉴定

为表达具有抗病毒活性的梅花鹿干扰素β1(IFN-β1),本研究通过PCR扩增梅花鹿IFN-β1基因,将其克隆至原核表达载体p ET-28a中,构建重组质粒p ET-IFNβ1,并将其转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后,得到高效表达。SDS-PAGE与western blot分析结果表明,梅花鹿IFN-β1重组蛋白的分子量大小约为24 ku,表达产物主要为不溶性的包涵体,表达量占菌体总蛋白的59.02%。将Ni柱纯化的p ET-IFNβ1诱导表达产物复性后,细胞病变抑制法检测表明表达产物具有抗病毒活性,其抗病毒活性可以达到10×53.81U/0.1 m L。梅花鹿INF-β1的表达为梅花鹿INF-β1的应用奠定了基础。     

梅花鹿γ干扰素克隆表达及抗病毒活性测定

提取经植物血凝素诱导培养的梅花鹿外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出梅花鹿γ干扰素成熟蛋白基因并将其克隆到pMD18-T载体上,测序结果表明,扩增片段为梅花鹿γ干扰素成熟蛋白序列,与GenBank上发表的干扰素序列同源性为100%.将其重组到原核表达载体pET32a(+)上,并在大肠埃希菌BL21中实现了高效表达.表达产物以His-Tag融合蛋白的形式存在,表达量约占细菌总蛋白的32.6%.用镍亲和层析法对蛋白进行纯化,并利用VSV-MDBK/IBRV细胞系统分析其生物活性,重组梅花鹿γ干扰素抗病毒活性分别约为7.25×104 U/mL和4.61×104 U/mL.结果表明,重组梅花鹿γ干扰素特异性好,而且抗病毒活性比较稳定.     

梅花鹿MMP-2催化域的基因克隆及原核表达

为了研究基质金属蛋白酶2(MMP-2)与鹿茸生长发育之间的关系,构建MMP-2催化域原核表达载体,采用RT-PCR方法从鹿茸c DNA中扩增MMP-2的催化域基因,使用NdeⅠ和NotⅠ酶切位点连入原核表达载体p ET30a并进行诱导表达。结果显示:梅花鹿MMP-2的催化域与牛、山羊、大鼠、人、马、猪和绵羊等多个物种的MMP-2催化域进化上较为保守,氨基酸同源性分别为98.4%、99.5%、94.0%、96.2%、95.9%、96.4%和99.2%;重组表达的MMP-2 CD带有His标签,蛋白共有377个氨基酸,预测大小为42.04 ku,理论等电点为4.95;通过转化BL21感受态细胞和IPTG诱导,成功表达了目的蛋白,约占菌体蛋白的80%;经过SDS-PAGE检测和免疫印迹分析,发现目的蛋白主要表达在包涵体中。本试验为后续蛋白纯化及活性检测,进一步研究MMP-2在鹿茸生长中的作用提供了理论依据。     

家蚕ycaCR基因的表达特征及蛋白质的亚细胞定位

ycaC相关蛋白含有一个保守的ycaC-related结构域,属于异分支酸酶超家族成员。从家蚕蛹cDNA文库中检索到一条EST序列,编码一个含ycaC-related保守结构域的蛋白质,将该cDNA的全长序列命名为BmycaCR(GenBank登录号:GU292794)。通过基因克隆、原核表达和纯化技术得到BmycaCR蛋白,用纯化的蛋白质为抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。Western blot检测BmycaCR蛋白在家蚕卵期的表达水平明显高于其它发育时期,蛋白质在5龄幼虫的睾丸、马氏管、气管、卵巢、表皮、肠和脂肪体中均有表达,而在头部、血液和丝腺中没有检测到阳性信号。荧光定量PCR检测BmycaCR在家蚕卵期的转录水平明显高于其它发育时期,在5龄幼虫各组织中,BmycaCR的转录水平由高到低依次为睾丸、气管、脂肪体、卵巢、表皮、肠、血液、马氏管、丝腺和头部。亚细胞定位显示BmycaCR蛋白在细胞核和细胞质中均有分布,可能发挥基本的生物学功能,并在靠近质膜区域有强的荧光信号,可能具有与其它蛋白质相互结合的功能。