茶树MADS-box家族基因AGL9的克隆及表达分析

【目的】进一步了解AGL9转录因子基因的功能,以及该基因对茶树花器官形成与发育的作用。【方法】前期研究茶树正常花与不育花转录组差异时,筛选出一条与AGL9基因高度同源的基因序列,设计特征引物进行PCR扩增验证AGL9基因并对其生物信息学特征进行分析,同时运用qRT-PCR分析AGL9基因的特性表达。【结果】经验证AGL9基因含有1个726 bp的开放阅读框,编码242个氨基酸,预测分子量为27.67 kD,理论等电点为8.96,命名为CsAGL9。Blastn分析序列发现CsAGL9与多种植物AGL9蛋白具有高度同源性。保守基元分析表明,茶树CsAGL9具有MADS-box和K-box,属于E类功能基因。qRT-PCR分析CsAGL9在不育花的花瓣、雄蕊中的表达量高于正常花而雌蕊中的低于正常花。【结论】茶树CsAGL9基因对花瓣、雄蕊、雌蕊等花器官的形成和发育扮演重要的作用。     

荷花B类MADS-box基因家族NnDEF基因的克隆及表达分析

以荷花品种'重瓣一丈青'(Nelumbo nucifera‘chongban yizhangqing')为试材,采用同源克隆方法获得2个AP3/DEF同源基因NnDEF1和NnDEF2。NnDEF1基因CDS序列全长678 bp,编码225个氨基酸;NnDEF2基因CDS序列全长693 bp,编码230个氨基酸;2个蛋白的C-末端序列均包含典型的PI衍生基序和PaleoAP3基序。序列比对和系统进化分析表明:NnDEF1和NnDEF2基因属于B功能基因家族AP3/DEF亚家族,2个基因序列的同源性远高于其他物种同源基因,表明荷花进化中可能存在基因加倍事件。表达模式分析显示:NnDEF1和NnDEF2基因表达具有品种间相似性和个体内差异性,NnDEF1倾向于在花瓣和雄蕊组织中表达,在内侧花瓣表达量最高;而NnDEF2则表达较广泛,在茎、叶、萼片、花瓣组织中均有表达,在外轮花瓣组织中表达量最高。基因表达差异表明,NnDEF1基因可能在荷花瓣化现象中发挥作用。上述研究结果可为研究荷花花发育及瓣化现象分子机制奠定基础。     

荷花MADS-box基因的克隆及表达分析

采用RT-PCR方法从微山红莲花苞中克隆获得1个与花发育相关的MADS-box基因,命名为Ne MADS1。该基因全长729 bp,包含1个720 bp的开放阅读框,编码239个氨基酸,具有典型的MADS结构域和K结构域。序列比对和系统进化分析结果表明,Ne MADS1与E类家族AGL9/SEP-like3基因亲缘关系较近。RT-PCR分析结果表明,Ne MADS1基因在花瓣、雄蕊和心皮中表达。     

葡萄SVP类MADS-box基因的克隆及表达分析

从无核白葡萄(Vitis vinifera cv.Thompson seedless)中克隆获得一个胚珠发育相关MADS-box基因。该基因cDNA全长1 248bp,ORF为729bp,编码一个含有243个氨基酸的蛋白。氨基酸多序列比对和系统发育分析显示,该基因属于SVP类MADS-box基因。采用半定量技术进行表达分析表明,该基因在葡萄的根、茎、叶、花蕾、盛花和胚珠中均有表达,但是有强弱差异。实时定量PCR技术分析表明在无核葡萄品种无核白胚珠发育过程中基因表达量先升后降,而在有核葡萄品种黑比诺胚珠发育过程中表达量一直呈下降趋势。     

油菜COR基因的克隆及原核表达

以冬油菜陇油6号叶片为材料,利用RT-PCR法克隆到油菜COR基因编码区序列,全长390 bp。将其与大肠杆菌表达载体p ET-30a连接,构建原核表达载体p ET-30a-COR,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE检测结果表明该基因表达了1个约14.3 k D的蛋白,为进一步研究目的蛋白的结构和功能提供了实验基础。     

草莓KEA家族基因的克隆、鉴定及表达分析

K~+/H~+逆向转运体(KEA)介导细胞中K~+和H~+的动态平衡,在维持植物体内的离子平衡、生长发育和信号转导中起重要作用,然而,相关研究主要体现在模式作物拟南芥中,果树中KEA家族基因的功能依然未知。本研究以Yellow Wonder 5AF8草莓为材料,筛选并克隆KEA家族基因,并对其进行生物信息学鉴定和表达特征分析,为研究果树K~+/H~+平衡及钾素动态平衡机制提供基因资源和理论依据。结果表明,在草莓基因组中检索并克隆到5个KEA家族基因,命名为FveKEA1～FveKEA5,属于典型的植物K~+/H~+逆向转运体基因;编码的蛋白质与7种已报道的不同科属植物的KEA家族蛋白在氨基酸水平上具有25.00%的一致性,并可分为2个亚族(Group I和Group II),其中,草莓FveKEA1和FveKEA2属于Group I,只含有4个Motif基序,而FveKEA3～FveKEA5属于Group II,含有7个Motif基序;系统进化树表明草莓FveKEA2和FveKEA4分别与葡萄VvKEA2和苹果MdoKEA6紧密聚在一起,草莓FveKEA1、FveKEA3和FveKEA5分别与葡萄VvKEA1、白杨PtrKEA4、桃PpeKEA4等相应成员在遗传距离上较近;草莓KEA家族蛋白主要定位于细胞质膜,均含有12～14个跨膜区,除FveKEA3外,均为稳定蛋白,且只有FveKEA5含有信号肽;转录表达谱分析结果揭示草莓KEA家族基因在多种组织或器官中均有表达,实时荧光定量PCR结果表明FveKEA1在5AF8草莓不同组织中的整体表达水平最高,在花瓣和未成熟果实中的表达量最为突出,其次是FveKEA4,而其他3个基因的整体表达水平相对较低。此外,在草莓KEA基因启动子区域鉴定到至少16种顺式作用元件,且均含有光感应、胚乳表达和脱落酸(ABA)响应的作用元件。     

葡萄KEA家族基因的克隆、鉴定及表达分析

【目的】从葡萄中克隆并鉴定KEA家族基因,在转录水平探索其组织特异性表达特征及对缺钾、脱落酸(ABA)、氯化钠(NaCl)与山梨糖醇(sorbitol)等胁迫的响应情况,明确主效基因。【方法】通过同源克隆法,在葡萄基因组中筛选并鉴定KEA家族基因;利用MEGA 7.0软件中的邻接法建立9种不同植物(葡萄、拟南芥、水稻、玉米、高粱、短柄草、白杨、梨和苹果)KEA家族成员的系统进化树;借助多种生物信息学软件分析葡萄KEA家族基因及其编码蛋白的详细特征;检索EST数据库,分析葡萄KEA家族基因的表达谱;利用实时荧光定量PCR分析KEA家族基因在葡萄不同组织部位的表达模式及对缺钾、ABA、NaCl与sorbitol等胁迫的响应情况,明确主效基因。【结果】在葡萄基因组中检索并克隆获得4个KEA家族基因,命名为VvKEA1—VvKEA4,均含有典型的K/H交换结构域(K/H exchanger domain)和TrkA-N domain功能结构域,属于典型的植物K+/H+逆向转运体;9种不同植物的KEA家族蛋白在氨基酸水平具有33.10%的一致性,并可分为2个亚族(GroupⅠ和GroupⅡ),其中,葡萄VvKEA1和VvKEA2属于GroupⅠ,均含有7个Motif基序,而VvKEA3和VvKEA4属于GroupⅡ,只含有4个Motif基序;系统进化树表明葡萄VvKEA1、VvKEA2和VvKEA4成员分别与拟南芥AtKEA2、AtKEA3和AtKEA5紧密聚在一起,而葡萄VvKEA3则与梨PbrKEA5和苹果MdoKEA7紧密聚在一起,水稻、玉米、高粱和短柄草4种禾本科植物KEA家族成员更倾向于聚在一起,而木本植物白杨、苹果、梨KEA家族成员紧密聚在一起;葡萄KEA家族蛋白拥有相似的三级结构,主要定位于细胞质膜,均含有12—13个跨膜区,均为稳定蛋白,等电点pI均小于7.00,且只有VvKEA3具有信号肽;在葡萄VvKEA启动子区域鉴定到至少15种的顺式作用元件,主要包括胁迫响应、营养和发育、激素响应、昼夜规律等不同生命活动相关的调控元件;EST表达谱结果表明葡萄KEA家族基因在多种组织或器官中均有表达,在果实中的表达水平最高,其次是叶、种子、根和雌蕊;实时荧光定量PCR分析表明VvKEA3在8年生‘白罗莎里奥’葡萄树不同组织中的整体表达水平最高,在幼果中的表达量最为突出,而其他3个VvKEA的整体表达水平相对较低,且较为接近;幼苗中,VvKEA1—VvKEA4在转录水平对NaCl处理没有响应,但对ABA处理最为敏感,VvKEA1—VvKEA4的表达量在检测幼苗的地上部和根部均被显著诱导,VvKEA3在检测幼苗的地上部和根部及VvKEA1在地上部的表达量受缺钾处理诱导而显著增强,VvKEA3在检测幼苗的地上部和根部及VvKEA4在根部的表达量受sorbitol渗透处理诱导而显著上升。【结论】从葡萄中克隆并鉴定了4个KEA家族基因,主要在葡萄果实、叶片和种子中表达,其成员与拟南芥KEA成员在遗传距离上较近;VvKEA3在成年葡萄树中的整体表达水平最为丰富(幼果中最高),幼苗中VvKEA3受缺钾、ABA和sorbitol渗透胁迫的调控;VvKEA3是葡萄果实中重要的K+/H+逆向转运体。     

油菜Oleosin基因启动子的克隆、分析及瞬时表达

以甘蓝型油菜幼苗为材料,根据油脂蛋白Oleosin(O20)基因的启动子序列设计引物,PCR扩增了长度为935 bp的片段,把该片段连接到pBI101载体,GUS瞬时染色结果表明,该片段可以驱动GUS基因在油菜幼苗根部特异性表达。油菜油脂蛋白是一个蛋白质家族,为进一步鉴别扩增到的935 bp油脂蛋白启动子,该研究利用油菜基因组信息进行序列对比,结果表明935 bp的启动子和Oleosin(O20)的启动子序列之间有较多的变异,但和油菜1号染色体上的序列完全一致;1号染色体上紧跟的编码框序列和油脂蛋白Oleosin(O20)的编码框序列也完全一致,但油脂蛋白Oleosin(O20)的基因组序列要比油菜1号染色体的基因组序列短。通过PLACE和PlantCARE软件对935 bp启动子进行了扫描预测,结果表明该启动子中含有许多顺式作用元件,尤其是脱落酸、茉莉酸甲酯和水杨酸这3个与激素有关的元件;将该研究扩增到的另一个928 bp长度的启动子与935 bp的启动子相比,前者启动子区域水杨酸顺式作用元件缺少了1个碱基,同时也缺失了1个碱基的片段,这些序列的变化可能是该启动子丧失活力的原因。     

团头鲂jphs家族基因的克隆及表达分析

以团头鲂为研究对象,扩增获得Junctophilin(Jph)家族4个成员,jph1a、jph1b、jph2和jph3的cDNA编码序列,分别为2 031、2 016、2 358和2361 bp,分别编码676、671、785和786 aa。团头鲂jphs均由5个外显子和4个内含子组成,与大多数物种的JPHs基因结构相似;结构域预测显示出8个MORN和1个TM结构域,且蛋白多序列比对分析显示Jphs在进化上非常保守。基于qRT-PCR(quantitative real-time PCR)分析显示,这4个基因呈现出组织特异性表达,其中jph1a、jph1b和jph2主要在肌肉和心脏中表达,而jph3主要表达于心脏、血液和大脑。在早期发育过程中,jph1a、jph1b、jph2和jph3的mRNA表达模式类似,分别在原肠胚期、心跳期和25 dph(days post hatching)达到高峰。综上研究结果表明,鱼类jphs基因在心脏和肌肉等组织中发挥重要作用,并且其功能可能不同于哺乳动物。     

红花檵木LcCHI基因的克隆、表达分析及转化研究

从红花檵木(Loropetalum chinense var.rubrum)叶片中克隆获得查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)同源基因,命名为LcCHI。LcCHI基因的开放阅读框长度为657 bp,编码218个氨基酸。氨基酸序列同源性比对结果表明,红花檵木LcCHI与包括玫瑰(Rosa rugosa)、月季(Rosa chinensis)在内的多种植物CHI的氨基酸序列同源性很高,氨基酸一致性均在75%以上。CHI负责酶催化活性的5个氨基酸残基位点也在不同植物的CHI氨基酸序列中高度保守。LcCHI蛋白的三级结构主要由8个α-螺旋和11个β-折叠片层形成的球状蛋白,其催化核心区域具有两个硝酸根配基结合位点。实时荧光定量PCR结果表明,LcCHI在不同组织中均有表达,其中在根中表达量最高,而成熟叶中表达量最低。成功构建了pLcCHI-SUPER1300过表达载体,在拟南芥中异源表达并获得了LcCHI基因过表达的转基因株系,为进一步分析LcCHI基因功能创造条件。     

洋葱花器官B类MADS-box基因AcPI的克隆及表达分析

【目的】克隆洋葱花器官B类PI/GLO家族MADS-box基因,分析其序列特征及时空表达模式,为探讨其在洋葱花发育过程中的分子遗传机制奠定基础。【方法】以洋葱花蕾总RNA为模板,根据同源克隆策略设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得AcPI的全长cDNA序列。用生物信息学方法对其基因序列特征进行分析;利用RT-PCR和Real-time PCR分析AcPI在花蕾整个生长过程中的时空表达模式。【结果】克隆获得洋葱AcPI基因（GenBank登录号：JX679083）的cDNA全长931 bp,包含615 bp的完整开放阅读框,编码205个氨基酸。蛋白分析表明,AcPI蛋白具有植物MADS-box蛋白典型的MADS和K结构域;与水仙的NTPI、风信子的HoMADS2有78%、75%的相似性,与金鱼草的GLO也有52%的相似性。系统进化树分析表明,AcPI属于B类MADS-box蛋白家族的PI亚家族。RT-PCR表达分析表明,AcPI只在生殖器官花蕾中表达,但主要在花的第一、二、三轮花器官中表达,而在营养组织根、茎和叶中不表达。Real-time PCR进一步分析表明,AcPI在花芽整个生长过程中,在心皮中微弱表达,但表达丰度呈递增趋势;而在外轮被片、内轮被片和雄蕊中强烈表达,其表达丰度除了在外轮被片中呈先增后减的趋势外,在内轮被片和雄蕊中都呈递增趋势。【结论】AcPI在洋葱第一轮花器官中的表达支持了van Tunen提出的修正的ABC模型;但AcPI在洋葱第四轮花器官中也有表达,这表明AcPI除了调控外轮被片、内轮被片和雄蕊发育外,还可能在心皮的形成发育过程中起着重要作用。     

高粱MADS-box家族基因的鉴定与分析

MADS-box家族是一类具有多种生物功能的转录因子,它参与了植物生长发育的各个过程。本研究利用生物信息学方法,从高粱全基因组数据库中筛选并鉴定出98个高粱MADS-box家族成员,并对该家族成员的蛋白理化性质、系统进化树、染色体定位、基因结构、基因表达模式等特征进行了全面分析。结果表明98个高粱MADS-box基因包含了42个M-type-MADS基因和56个MIKC-MADS基因。高粱MADS-box家族基因的内含子数目为0～10个不等,不同基因的内含子数目相差很大。这些基因位于1～10号染色体,且分布较为均匀。高粱花发育过程中有28个M-type-MADS基因和55个MIKC-MADS基因转录表达。果实发育过程中有32个M-type-MADS基因和54个MIKC-MADS基因转录表达。     

大白菜BrCOX11基因的克隆及表达分析

为了研究大白菜中细胞色素C氧化酶的功能,以雄性不育系及保持系、抗感根肿病DH系为材料,在对大白菜BrCOX11基因克隆的基础上,利用生物学软件对其编码蛋白进行分析和构建进化树。结果显示,大白菜BrCOX11基因编码区大小为861 bp,所编码的氨基酸序列与NCBI收录的COX11氨基酸序列相似性非常高,属于COX家族;分子进化树分析表明,大白菜BrCOX11与芸薹属、拟南芥属及萝卜属亲缘关系最近,而与棉花属、胡萝卜属和黄瓜属等亲缘关系较远;大白菜BrCOX11蛋白是亲水性蛋白。通过分析BrCOX11基因表达发现,BrCOX11基因的表达量和大白菜的生长时期有关系,在果荚中表达量最高;在根肿菌侵染后的根部组织中表达上调,而在根肿菌侵染后的叶片组织中表达下调;在保持系中的表达量明显高于不育系。     

拟南芥AGL15基因的克隆及其植物超表达载体的构建

为了研究AGL15基因在种子发育过程中的作用,应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了拟南芥AGL15基因,并将其克隆到pMD20-T vector载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了该基因全序列。结果表明,该基因全长为807bp。将拟南芥AGL15基因定向克隆到植物表达载体pCambia1301的35S启动子下游,双酶切鉴定结果表明,AGL15基因在双元表达载体中的插入位置和方向都正确,即成功构建了该基因的植物超表达载体。     

甘蓝型油菜BnEIN3基因的克隆及菌核病诱导表达研究

乙烯不敏感转录调节基因（EIN3）是定位于细胞核上的乙烯信号转导下游元件,其作为转录因子启动一系列转录级联反应,从而激活乙烯诱导的防御相关基因的表达。拟南芥EIN3功能缺失突变体表现出对死体营养型病原菌高度敏感,表明该基因在抗死体营养型病原菌中发挥一定作用。为克隆甘蓝型油菜EIN3（BnEIN3）基因,该研究采用荧光定量PCR研究菌核病不同抗性的油菜品种接种核盘菌后,BnEIN3的表达变化及差异,初步探讨了BnEIN3在油菜菌核病防卫反应中的作用。     

小麦成熟胚脱分化过程中MADS-box家族基因的表达分析

利用小麦成熟胚脱分化基因芯片对脱分化过程中MADS-box家族基因的表达变化进行研究,检测到MADS-box家族转录因子基因及其靶基因共19个,上调表达基因3个,下调表达基因12个,混合表达基因4个,其中,CA730918、CK213813、BE417035、BJ276784、CA726603可能在小麦脱分化过程中意义重大。利用半定量RT-PCR技术对CA670406、CK213813、CA679889、AB107992和BJ228622基因的表达变化进行验证,结果与基因芯片检测结果相似。     

平邑甜茶非共生血红蛋白基因GLB1的克隆、表达及转化研究

根据GenBank上苹果GLB1基因的EST序列设计引物,利用PCR技术克隆到平邑甜茶GLB1同源基因MhGLB1（GenBank注册号：GQ423619）,该基因包含一个477bp的开放阅读框,编码158个氨基酸,分子量为17．8ku。成功构建了35S：：MhGLB1正义表达载体,并对“S以12粉”番茄进行农杆菌介导的遗传转化。荧光定量PCR结果显示,MhGLB1在根、茎、叶中均有所表达,但在根中的表达量最高;NO3-和SNP处理能够诱导根中MhGLB1的表达。     

甜瓜蛋白激酶类基因CmPKC的克隆、表达及遗传转化分析

【目的】本文研究了蛋白激酶类基因在甜瓜白粉病抗性中的抗性机理。【方法】以不同抗性的甜瓜为材料,根据植物蛋白激酶类基的同源序列设计引物,采用RT-PCR方法获得该基因的中间部分序列,通过RACE法获得c DNA完整序列,将其命名为CmPKC。【结果】该基因全长约为2914 bp,开放阅读框为2493 bp,编码831个氨基酸。蛋白序列进化分析表明,CmPKC蛋白与香瓜蛋白激酶同源性最高。实时荧光定量PCR分析表明在不同抗性材料上相对表达量变化趋势不同,在抗性材料上表达丰度出现的时间较感病材料早,且在不同材料上相对表达量变化趋势与已报道的一个甜瓜感病相关MLO家族基因一致,推测所获得的基因也可能与感病相关,且属于早期应答基因;转基因烟草鉴定初步表明该基因可能还参与生长发育过程,具有促进开花的功能。【结论】将为更加深入探索其功能及在白粉病抗性通路中及生长发育过程中所起的作用奠定基础。     

普通烟草CDPK基因家族的克隆及表达分析

 【目的】从烟草中分离更多CDPK基因,分析该基因家族的序列特征、进化关系和表达谱,为全面揭示其功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR、RACE和生物信息学的方法,分离普通烟草CDPK基因;采用MEGA4.0软件构建系统进化树;利用RT-PCR研究普通烟草全长基因的表达谱。【结果】分离到普通烟草CDPK基因8个,其中3个可以找到完整的开放读码框;系统进化树分析显示,烟草属11个全长CDPK基因位于4个亚家族,预测的2对普通烟草和拟南芥的直系同源基因在功能上可能非常保守;3个普通烟草全长基因虽然在所有的组织中都能检测到,但是它们的表达谱在不同的组织间存在明显差异。【结论】分离到8个未报道的普通烟草CDPK基因,结合已有的报道,目前在普通烟草中获得了15个CDPK基因,为在基因组范围内研究普通烟草CDPK基因家族的功能奠定了基础。     

陆地棉LTP家族基因的克隆与表达分析

长链脂肪酸能够通过调节胚珠内源乙烯信号变化来促进棉花的起始和伸长发育,为深入了解棉花脂肪酸的转运过程及参与基因,对棉花全基因组进行了分析,克隆了11个脂质转运蛋白。实时荧光定量PCR证实:LTP6, LTP7, LTP9, LTP11 4个基因在纤维起始时期（野生型与突变体之间）的表达存在差异,这4个基因可能与纤维起始发育有关。通过基因组步移技术克隆了Gh-LTP6基因的启动子,并对其结构进行分析,发现其具有多个MYB结合位点。这些结果为深入研究LTP基因在纤维起始过程中的角色奠定了基础。